基于CRISPR/Cas9的拟南芥多基因编辑及其在基因功能研究中的应用

摘要

随着“后基因组时代”的到来，一方面功能基因组学研究基因间相互作用、代谢调控网络的需求日益迫切，另一方面在植物生长发育过程中遗传冗余却大量存在，这种情况下，只有同时敲除多个基因或位点才能获得特定的能显现的表型，以达到为功能基因组学研究、遗传育种提供素材的目的。尽管随着基因组编辑技术的发展，近几年来在植株水平，对单个基因或同时对两个位点进行敲除编辑已经实现，但是如若想获得多个基因同时突变且稳定遗传的突变体，按照传统杂交育种思路，不但累加突变并纯合化的过程极为耗时，而且当突变基因个数增长到一定数量时，杂交后基因型检测的工作量之大也是难以承受的。除此之外，多个位点的同时敲除，对于像小麦、燕麦、烟草、棉花等多倍体植物的研究也非常有意义。
　　尽管多基因/多位点同时敲除意义重大，虽然利用锌指蛋白酶、TALEN等基因组编辑技术于几年前实现了植物中单个基因的敲除，但是因为技术自身的局限性，植物中多基因敲除在整个植物学界进展缓慢。在我们TALEN基因组编辑技术应用成功后，改造用于多基因敲除TALEN技术的课题陷入僵局时，CRISPR/Cas9技术应运而生，因为CRISPR/Cas9系统含有转录后相互独立的Cas9核酸酶和决定编辑特异性的sgRNA，且理论上当Cas9充足时不同的gRNAs之间不会相互影响的特性，使得用含有多个gRNAs的CRISPR/Cas9系统同时敲除多个不同位点成为可能，并且此策略将大大缩短获得多基因敲除个体的周期。基于此，多基因/位点同时敲除恰恰是CRISPR/Cas9系统有别于其他基因组编辑技术且最具诱惑力的地方。
　　基于建立并应用TALEN对植物个体实现单个基因编辑的平台优势与经验，一方面我们通过CRISPR/Cas9系统，运用单个gRNA，对单个基因的基因组靶位点进行了编辑，并对获得了拟南芥的IDM3(Increased DNA Methylation3)基因靶位点的T2代纯合突变体进行了Chop-PCR检测，清晰证明了IDM3属于反沉默因子，它参与DNA的去甲基化过程。并且，我们的结果显示，运用同样的CRISPR/Cas9载体系统，使用两个gRNAs对目标区域设计并实现了长片段的删除。
　　与此同时，我们于第一时间开展了利用CRISPR/Cas9的多基因同时敲除体系的研发工作，最终实现了同时靶定9个基因并获得了一系列多突突变体的目标。对于拟南芥多基因同时敲除体系建立验证，我们选择重要的植物激素ABA的受体拟南芥PYR/PYL/RCAR家族为目标基因，PYR/PYL/RCAR家族虽是研究热点，但因材料的局限性尚有很多成员的具体功能没有研究清楚，成员间的生物学功能关系的研究也因此受阻。
　　为了找出符合gRNA规则并覆盖多个基因的靶位点，针对拟南芥PYR/PYL/RCAR家族成员，我们对序列进行了全面分析，按穷举法逐一比对，找出多个基因共有的符合gRNA覆盖规则的序列片段，在对这些目标片段进行了脱靶效应分析之后，设计了6个分别靶定不同位点的gRNA：其中1个gRNA靶定PYL10,11,12和13的保守区域；1个gRNA靶定PYL7和8基因的保守区域（conserved regions）；4个gRNAs各靶定一个PYL基因位点（gene loci），这些位点分别是PYL3，5，6和9。
　　因植物转基因体系与动物细胞体系有本质的不同，通过向胚胎细胞注射混合mRNA或有活性的蛋白质在植物中暂不可行，即使使用基因枪，单个细胞注入的载体种类和数量也不可控，因此为了有效驱动同时表达6个gRNA，本论文在植物中首次将U6、U3b和7SL启动子各用两次以分别驱动各个gRNA，并通过Golden Gate Assembly的方法将6个gRNA分两级组装串联进一个由CaMV35S驱动的Cas9的骨架载体，然后再将含有以上6个gRNA以及Cas9的片段亚克隆入植物表达载体，通过农杆菌介导转化（Argrobacteria-mediated transformation）将含有6个gRNA和Cas9的单个载体转化拟南芥材料。筛选获得转基因植物群体后，在T1代用覆盖编辑区域的引物分别对编辑区域片段进行了扩增，在PCR产物直接测序初筛之后，将初筛获得的阳性PCR产物逐一克隆进T载体，随后对单克隆进行测序以核实PYLs目标位点获得具体突变信息。在检测样品中除了PYL8和PYL9未检测到编辑事件外，在PYL3，5，6，7，10，11，12和13中检测到各种各样的小片段插入或缺失。证明6个gRNAs均能引导Cas9靶定其靶位点进行切割并诱发突变，且单个gRNA可以驱动Cas9同时编辑2个甚至4个PYLs。
　　由T1代检测结果证明由U6、U3b和7SL启动子驱动6个gRNA介导的多基因敲除体系在拟南芥中可行，得到的T1代均为嵌合体（chimera），理论上在T2代亦将分离出可稳定遗传的纯合突变体。我们首先从ABA处理（100μM）的平板上，筛选出一些正如文献报道推测的对 ABA不敏感表型的T2株系，用覆盖编辑区域的引物分别对编辑区域片段进行了扩增，PCR产物直接测序结果显示大多数对ABA不敏感株系为杂合或纯合的多突突变体。另外，本论文还发现以112458为背景的一些多突株系对空气水分十分敏感，出现了很明显的萎蔫表型。对T2代的检测筛选结果一方面证明多基因敲除及多突突变体的筛选获得具有成本上的可操作性，另一方面至今虽未获得全家族敲除株系，但是整理获得了各种多基因突变体组合库，为进一步冗余基因功能关系研究提供有用素材。并且成功规避解决了如下问题：1.适量表达Cas9基因以满足多个gRNA的需要；2.驱动多个gRNAs足量共表达并保证gRNAs的表达不相互影响；3.将Cas9核酸酶和多个gRNAs高效共转入植物个体；4.实现拟南芥PYL六突背景112458的转基因；5.大规模突变体的检测与保存。
　　另外，尽管CRISPR/Cas9系统在拟南芥中应用比较成功，但是拟南芥仅仅为模式植物，因此本论文还对CRISPR/Cas9系统的广适性进行了验证，证明其也适用于番茄这一重要的经济作物。选取敲除的两个基因SlIAA9和另一个未报到过的SlMET1均得到阳性结果。与拟南芥不同的是，测序结果显示由CRISPR/Cas9引起的内源基因突变在番茄T0代便很容易检测到，对于与叶片形态相关的生长素基因SlIAA9，在T0代就获得了SlIAA9的预期表型——叶片由完全叶变为简单叶。
　　以上结果表明多基因同时突变可以由CRISPR/Cas9介导的基因组编辑产生，并且突变可遗传，而获得的突变体或突变体库是基因功能研究的可贵资源。与此同时可以预期由CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在不久的将来会广泛适用于拟南芥、番茄等其他植物的常规基因功能研究、以及功能基因组研究。

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1 引 言

1.1植物基因组与功能基因组学研究基础

1.2 基因组定点编辑技术的发展及其应用前景

1.3 单基因敲除、大片段删除及多个基因同时敲除策略

1.4 突变体靶位点筛选方法比较

1.5用于基因组编辑技术的植物（拟南芥、番茄）转化方法及检测时期

1.6基因组编辑植物的生物安全性

1.7研究意义及立题依据

1.8本研究的技术路线

2 CRISPR／Cas9系统介导的拟南芥IDM3单个基因编辑敲除及IDM3 参与去甲基化过程的研究

2.1材料与方法

2.2结果与讨论

2.3小结

3运用CRISPR/Cas9系统通过基因组长片段删除敲除单个基因

3.1材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3小结

4拟南芥PYLs基因家族多基因敲除突变体库的构建与基因功能初步研究

4.1材料与方法

4.2结果与讨论

4.3小结

5 CRISPR/Cas9系统的广适性验证

5.1材料与方法

5.2结果与讨论

5.3小结

6总结与展望

7创新点

致谢

参考文献

附录1

A.博士期间发表及待发表的文章

附录2

A.文中涉及关键基因或原件的序列

B.文中所用部分引物