基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用

摘要

本发明公布了一种基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用。该载体以质粒pNeo4为骨架，组合串联的HA标签序列、限制性内切酶酶切位点及四膜虫ACTIN1基因的转录终止序列为模块，将模块合成、酶切位点消化插入到pNeo4的5'端多克隆酶切位点中，构建出表达载体pNeo4‑3HA。使用该载体时，分别扩增获得重组同源臂—目的基因编码区C端序列及其3'侧翼序列，经酶切连接克隆到pNeo4‑3HA载体的5'上游和3'下游多克隆酶切位点中。得到的构建体经转化四膜虫、抗性筛选获得表达突变细胞株。本载体实现了在自身启动子调控下C端表达融合标签的内源基因的目的，操作简单快捷，3个HA标签提高了免疫荧光定位灵敏度，还可用于蛋白亲和纯化和蛋白相互作用研究。