一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法

摘要

本发明公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。