针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体

摘要

提供了特异性结合肺炎球菌蛋白，特别是肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)和肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体和抗原结合片段。还公开了编码抗体、抗原结合片段、抗体的VH或VL或包括VH和/或VL的多片段抗体的核酸分子、包括这些核酸分子的载体以及用这些载体转染的宿主细胞。还提供了抑制、治疗和检测肺炎链球菌感染的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年2月9日提交的美国临时申请号63/147,393的权益，该申请的全部内容通过引用的方式并入本文。

技术领域

本申请涉及特异性结合肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的单克隆抗体和抗原结合片段，例如特异性结合肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)或肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体和抗原结合片段，以及它们在抑制和检测肺炎链球菌感染中的用途。

政府支持的感谢

本发明得到了美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款1K01OD026569、R01AI123383和GM109435以及美国国家转化科学促进中心(NationalCenter for Advancing Translation Sciences，NCATS)授予的拨款UL1TR002378的政府支持；政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术

尽管已广泛使用两种疫苗来预防疾病，但肺炎链球菌仍是传染病发病率和死亡率的主要原因(Levine et al.(2006)Lancet367：1880-1882)。据世界卫生组织估计，全世界每年有100多万人死于肺炎球菌感染(World Health Organization(2003)Wkly EpidemiolRec 78：110-119)。与其他呼吸道病原体类似，2岁以下和65岁以上的个体更容易感染侵入性肺炎球菌疾病(Practices AC on I.(2000)MMWR Recomm Rep 49：1-35)。此外，患有糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒等原有疾病的个体也会增加严重感染的频率和风险(van der Poll and Opal(2009)Lancet 374：1543-1556)。尽管疫苗接种已在发达国家普及，但肺炎球菌感染仍占成人肺炎的30％，死亡率高达11-40％(Bridy-Pappas et al.(2005)Pharmacotherapy 25：1193-212)。此外，在世界上儿童死亡率较高的地区，肺炎球菌肺炎是导致20-50％儿童死亡的原因(Williams et al.(2002)LancetInfect Dis 2：25-32)。

肺炎链球菌是上呼吸道的常住菌，肺炎链球菌携带发生在活动性感染之前(Sulikowska et al.(2004)J Clin Microbiol 42：3942-3949；Simell et al.(2012)Expert Rev Vaccines 11：841-855)。在幼儿中，肺炎球菌的携带率可高达40-60％(Cardozo et al.(2008)J Med Microbiol 57：185-189)。定植通常是无症状的；然而，肺炎链球菌通常会在流感等原发感染后迅速传播，导致肺炎和侵袭性疾病。肺炎链球菌的反复定植通常会导致免疫，多项研究已确定定植会诱导对荚膜多糖的血清抗体反应，以及对蛋白抗原的血清抗体和细胞免疫反应(Weinberger et al.(2008)J Infect Dis 197：1511-1518；Goldblatt et al.(2005)J Infect Dis 192：387-93；McCool et al.(2002)J ExpMed 195：359-365；Prevaes et al.(2012)Infect Immun 80：2221-2186-2193；Turner etal.(2013)Clin Microbiol Infect 19：E551-E558；Zhang et al.(2006)Eur J Immunol36：46-57；Mureithi et al.(2009)J Infect Dis 200：783-793；和Wright et al.(2013)PLoS Path e1003274)。血清中的这些抗体水平在人出生后的头几年会升高，但在老年人中会下降，这可能是儿童和老年人中观察到的患病风险较高的原因之一(Simell et al.(2008)Clin Vacc Immunol 15：1391-1397)。

虽然疫苗能有效降低肺炎球菌疾病的发病率，但非疫苗血清型的发病率也出现了上升，这被称为血清型替代(Wantuch et al.(2018)Hum Vaccines Immunother 14：2303-2309)。此外，尽管疫苗接种范围广泛，但血清型3和19A引起的侵袭性疾病的发病率仍持续存在(Linley et al.(2019)Vaccines 7：doi：10.3390/vaccines7010004)。在治疗方面，非疫苗血清型的抗生素耐药性有所上升，给肺炎球菌感染的治疗带来了挑战(Lo et al.(2019)Lancet Infect Dis 19：759-769)。鉴于目前疫苗和治疗的局限性，亟需另外的治疗选项。

发明内容

提供了与肺炎链球菌特异性结合的分离的单克隆抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括以下之一：

a)重链可变区(V

b)V

c)V

d)V

e)V

在进一步的实施方案中，公开了多特异性抗体，其包括2种或2种以上这些抗体和/或抗原结合片段的组合。

还公开了编码抗体、抗原结合片段、抗体的V

在更多的实施方案中，公开了抑制受试者肺炎链球菌感染的方法。

在进一步的实施方案中，公开了用于检测生物样品中肺炎链球菌的方法。

本发明的上述及其他特征和优点将从下面参照附图对一些实施方案的详细描述中变得更加明显。

附图说明

图1.重组PhtD和PspA蛋白的纯化。纯化的重组表达的PspA和PhtD的SDS-PAGE(左)和Western印迹(右)。两种蛋白都很纯，没有出现降解产物。

图2.受刺激B细胞的上清液与重组PhtD和PspA蛋白的ELISA结合反应。

图3A-3B.与PhtD和PspA结合的单克隆抗体(mAb)。图3A显示了抗PhtD mAb针对重组PhtD蛋白的ELISA结合曲线。PspA16用作阴性对照。＞表示在最高浓度下OD

图4.纯化的麦芽糖结合蛋白(MBP)PhtD片段融合蛋白的SDS-PAGE。除游离MBP外，每个融合蛋白纯化后都是纯的。

图5.PhtD mAb与各MBP-PhtD片段的ELISA结合曲线。结合曲线的总结显示在结合曲线下方。数据点表示至少两个独立实验之一的四个重复的平均值。误差条表示95％的置信区间。

图6.PhtD特异性mAb的表位图。数据显示了与单独竞争抗体相比，竞争抗体在第一抗体存在下的结合百分比。黑色填充的单元格表示完全竞争，其中观察到≤33％的非竞争信号；灰色单元格表示中等竞争，其中信号在33％到66％之间；白色单元格表示非竞争，其中信号≥66％。

图7.重组MBP PspA片段融合蛋白的SDS-PAGE。片段1-2和4-5纯化良好，只有可见的MBP蛋白作为污染物。PspA片段3有多条共纯化带和/或降解产物。

图8.PspA16与各片段的ELISA结合曲线。PspA16与片段1和片段4结合，而与其他片段没有结合，表明表位在氨基酸1-247内。数据点表示至少两个独立实验之一的四个重复的平均值。误差条表示95％的置信区间。

图9.以PspA16和PhtD3为第一抗体对TIGR4和TCH8431菌株进行的Western印迹。在PspA16的Western印迹中，与MBP融合的PspA片段1-438用作阳性对照，MBP用作阴性对照。在PhtD3的Western印迹中，重组PhtD用作阳性对照，大肠杆菌裂解液用作阴性对照。

图10.分离的mAb针对涂有固定细菌的板的ELISA结合曲线。数据表示至少两个独立实验之一的四个数据点的平均值，误差条为标准差。

图11.热图和抗体与各肺炎球菌血清型结合的百分比。数据是3-4次实验的平均值，是APC阳性细菌的百分比。MPV314和MPV414是对人类变性肺病毒融合蛋白具有特异性的人类抗体，这些用作阴性对照。

图12A-12F.抗PhtD mAb的保护效力。图12A：mAb PhtD3和PhtD8、同种型切换mAb(PhtD3-IgG

图13A-13C.抗PhtD和抗PspA mAb的保护效力。图13A：小鼠在鼻内感染肺炎链球菌(5x10

图14A-14B.PhtD特异性人类mAb的调理吞噬活性。图14A：使用分化的HL-60细胞在标准调理吞噬杀伤测定(OPKA)中测试mAb和血清。用抗体调理指定血清型(血清型4、血清型3或血清型19A)的细菌，随后加入HL-60细胞，再将其涂布在血琼脂板上。将板孵育过夜，对CFU进行计数。数据为一次实验中三个重复的平均值。误差条表示范围。细菌杀伤百分比计算为针对无Ab对照的平均值归一化的每个三重复的计数CFU值。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验来确定显著性。ns＝无显著性，****P＜0.0001。图14B：mAb和血清在基于流动的调理吞噬测定中进行检测。用抗体促进指定血清型(血清型4、血清型3或血清型19A)的pHRodo

图15.用PhtD3-IgG

图16.用PhtD3-IgG

序列

如37 C.F.R.1.822所定义，核酸和氨基酸序列用标准字母缩写表示核苷酸碱基，用三字母代码表示氨基酸。每个核酸序列只显示一条链，但互补链可理解为通过所显示的链的任意参考而包括在内。序列表以名为“序列表.txt”的ASCII文本文件形式提交，该文件创建于2022年1月13日，28,672字节，通过引用并入本文。在所附序列表中：

SEQ ID NO：1是PhtD3 V

SEQ ID NO：2、3和4分别是PhtD3 V

SEQ ID NO：5是PhtD3 V

SEQ ID NO：6、7和8分别是PhtD3 V

SEQ ID NO：9是PhtD8 V

SEQ ID NO：10、11和12分别是PhtD8 V

SEQ ID NO：13是PhtD8 V

SEQ ID NO：14、15和16分别是PhtD8 V

SEQ ID NO：17是PhtD6 V

SEQ ID NO：18、19和20分别是PhtD6 V

SEQ ID NO：21是PhtD6 V

SEQ ID NO：22、23和24分别是PhtD6 V

SEQ ID NO：25是PhtD7 V

SEQ ID NO：26、27和28分别是PhtD7 V

SEQ ID NO：29是PhtD7 V

SEQ ID NO：30、31和32分别是PhtD7 V

SEQ ID NO：33是PspA16 V

SEQ ID NO：34、35和36分别是PspA16 V

SEQ ID NO：37是PspA16 V

SEQ ID NO：38、39和40分别是PspA16 V

SEQ ID NO：41是编码PhtD3 V

SEQ ID NO：42是编码PhtD3 V

SEQ ID NO：43是编码PhtD8 V

SEQ ID NO：44是编码PhtD8 V

SEQ ID NO：45是编码PhtD6 V

SEQ ID NO：46是编码PhtD6 V

SEQ ID NO：47是编码PhtD7 V

SEQ ID NO：48是编码PhtD7 V

SEQ ID NO：49是编码PspA16 V

SEQ ID NO：50是编码PspA16 V

SEQ ID NO：51-64是引物的核酸序列。

具体实施方式

本文公开了特异性结合肺炎链球菌如组氨酸三聚体蛋白(PhtD)和肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体。PhtD是肺炎链球菌高度保守的表面蛋白，在从儿童侵袭性疾病病例中分离出的菌株中为91％至98％不等(Yun et al.(2015)PLoS One 10：e0134055)。一项针对107株肺炎球菌菌株的研究显示，PhtD在100％的受测血清型中都有表达，而其他研究则发现PhtD广泛存在，但在分离的菌株的子集中却不存在(Rioux et al.(2011)Microbiology 157：335-348；Kawaguchiya et al.(2019)Pathog 8：162；Blumental etal.(2015)PLoS One 10：e0133885；和Rioux et al.(2011)Microbiology 157：336-348)。尽管有数据表明Pht蛋白家族参与了肺炎链球菌与呼吸道上皮细胞的附着，但其功能尚未完全阐明(Plumptre et al.(2013)Infect Immun 2013/07/22.81：3644-3651；和Kallioet al.(2014)InfectImmun 2014/02/03.82：1683-1691)。

PhtD具有免疫原性并能诱导保护性体液免疫，接种PhtD蛋白已被证明可减少定植、败血症和肺炎(Adamou et al.(2001)Infect Immun 69：949-958；Godfroid et al.(2011)Infect Immun 79：238LP-245；和Wizemann et al.(2001)InfectImmun 69：1593-1598)。在小鼠模型中，PhtD也被证明可预防全身性肺炎球菌疾病，用PhtD和脱毒的肺炎球菌溶血素一起免疫恒河猴，可保护动物免受肺炎球菌感染(Adamou et al.(2001)InfectImmun 69：949-958；和

所有Pht蛋白都具有免疫原性并能诱导保护性体液免疫，接种这些蛋白已被证明可减少定植、败血症和肺炎(Adamou et al.(2001)Infect Immun 69：949-958；Godfroidet al.(2011)Infect Immun 79：238 LP-245；和Wizemann et al.(2001)Infect Immun69：1593-1598)。在小鼠模型中，PhtD已被证明可预防全身性肺炎球菌疾病，用PhtD和脱毒的肺炎球菌溶血素一起免疫恒河猴，可保护动物免受肺炎球菌感染(Adamou et al.(2001)Infect Immun 69：949-958；和

PspA是肺炎链球菌的另一个重要毒力因子，也是最丰富的表面蛋白之一(Rosenowet al.(1997)Mol Microbiol 25：819-829)。与PhtD一样，PspA也存在于大多数受检的临床分离株中(Hollingshead et al.(2006)J Med Microbiol 55：215-221)。与完整菌株相比，PspA突变菌株从小鼠血液中清除的速度更快，接种PspA蛋白可保护小鼠免受肺炎球菌感染(Briles et al.1988.Rev Infect Dis 10 Suppl.2：S372-4；Bosarge et al.(2001)Infect Immun 69：5456-5463)。PspA的小鼠mAb已被证明可延长小鼠的存活时间，并提高抗生素治疗的效力(

由于PhtD和PspA在各种肺炎球菌血清型中高度保守，因此抗PhtD和PspA的mAb可以预防和/或治疗广谱肺炎球菌血清型引起的疾病。人类mAb有希望成为细菌病原体的治疗剂，因为贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)已获FDA批准用于预防艰难梭菌的复发性感染(Wilcox et al.(2017)N Engl J Med 376：305-317)。然而，尚未分离出针对任何肺炎球菌蛋白抗原的人类mAb。

本文公开了针对PhtD和PspA的人类单克隆抗体。所公开抗体的血清型广度、表位特异性和保护效力也在多种肺炎球菌感染小鼠模型中得到了证实。

I.术语概述

除非另有说明，否则技术术语均按常规用法使用。分子生物学中许多常用术语的定义可参见Krebs et al.(eds.)，Lewin’s genes XII，由Jones&Bartlett Learning出版，2017。如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”既指单数也指复数，除非上下文另有明确说明。例如，术语“抗原”(an antigen)包括单数或复数抗原，可视为等同于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含”是指“包括”。还应理解的是，除非另有说明，否则核酸或多肽的任何及所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值均为近似值，且仅供描述之用。尽管可以使用许多与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但本文描述了特定的合适方法和材料。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实例只是说明性的，并不具有限制性。为便于查看各种实施方案，特提供以下术语解释：

约：除非上下文另有说明，否则“约”是指参考值的正负5％。例如，“约”100是指95至105。

施用：通过选择的途径将药剂(例如所公开的抗体)引入受试者中。施用可以是局部或全身的。例如，如果选择的途径是血管内，则通过将组合物引入受试者的血管来施用药剂(例如抗体)。示例性施用途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、经皮(例如局部施用)、鼻内、阴道和吸入途径。

氨基酸取代：用不同的氨基酸替换多肽中的一个氨基酸。

抗体和抗原结合片段：特异性结合和识别分析物(抗原)如PhtD或PspA的免疫球蛋白、抗原结合片段或其衍生物。本文使用的术语“抗体”以最广义的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。

抗体的非限制性实例包括例如完整的免疫球蛋白以及保持与抗原的结合亲和力的变体和片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab'-SH、F(ab')

抗体还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异种缀合抗体(heteroconjugate antibodies)(例如双特异性抗体)。

抗体可以有一个或多个结合位点。如果有一个以上的结合位点，则这些结合位点可以彼此相同，或者可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体有两个不同的结合位点。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(H)和轻链(L)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变结构域基因。有两种类型的轻链，即lambda(λ)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

每条重链和轻链都包含恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域)。组合时，重链和轻链可变区特异性结合抗原。

提及“V

V

CDR主要负责与抗原的表位结合。给定CDR的氨基酸序列边界可通过一系列众所周知的方案中的任何一种容易地确定，所述方案包括Kabat等人(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5

在一些实施方案中，所公开的抗体包括异源恒定结构域。例如，抗体包括不同于天然恒定结构域的恒定结构域，如包括一个或多个修饰以增加半衰期的恒定结构域。

“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，也就是说，组成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，可能的变异抗体除外，例如，含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制剂过程中产生，这种变体一般以较少的量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体只针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”表明抗体是从基本上同质的抗体群体中获得的，而不能理解为要求用任何特定方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制造，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和其他制造单克隆抗体的示例性方法在本文中均有描述。在一些实例中，单克隆抗体是从受试者中分离出来的。单克隆抗体可以具有保守的氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响。(参见，例如，Greenfield(Ed.)，Antibodies：A Laboratory Manual，2

“人源化”抗体或抗原结合片段包括人类框架区和一个或多个来自非人类(例如小鼠、大鼠或合成)抗体或抗原结合片段的CDR。提供CDR的非人类抗体或抗原结合片段称为“供体”，提供框架的人类抗体或抗原结合片段称为“受体”。在一个实施方案中，所有CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但如果存在，它们可以与人类免疫球蛋白恒定区基本相同，例如至少约85-90％，如约95％或更多的同一性。因此，除可能的CDR外，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分都与天然人类抗体序列的相应部分基本相同。

“嵌合抗体”是一种抗体，它包括源自两种不同抗体的序列，这两种抗体通常属于不同的物种。在一些实例中，嵌合抗体包括来自一种人类抗体的一个或多个CDR和/或框架区，以及来自另一种人类抗体的CDR和/或框架区。

“全人抗体”或“人类抗体”是指包括来自(或衍生自)人类基因组的序列而不包括来自其他物种的序列的抗体。在一些实施方案中，人类抗体包括来自(或衍生自)人类基因组的CDR、框架区和(如果存在)Fc区。人类抗体可例如通过噬菌体展示或使用转基因动物，使用基于源自人类基因组的序列产生抗体的技术进行鉴定和分离(参见，例如，Barbas etal.Phage display：A Laboratory Manuel.1

生物样品：从受试者中获得的样品。生物样品包括用于检测受试者疾病或感染的所有临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液，如血液、血液的衍生物和级分(例如血清)、脑脊液；以及活检或手术切除的组织，例如未固定、冷冻或用福尔马林或石蜡固定的组织。在特定的实例中，生物样品从患有、疑似患有或有风险患有肺炎链球菌感染的受试者或患有或疑似患有病毒性呼吸道感染的受试者获得。

双特异性抗体：由两个不同的抗原结合结构域组成的重组分子，其因此可与两个不同的抗原表位结合。双特异性抗体包括两个抗原结合结构域的化学或基因连接的分子。抗原结合结构域可以使用接头连接。抗原结合结构域可以是单克隆抗体、抗原结合片段(例如Fab、scFv)或其组合。双特异性抗体可包括一个或多个恒定结构域，但不一定包括恒定结构域。

足以形成免疫复合物的条件：使抗体或抗原结合片段与其同源表位结合的程度明显高于基本所有其他表位和/或基本上排除与基本所有其他表位结合的条件。足以形成免疫复合物的条件取决于结合反应的形式，通常是免疫测定方案中使用的条件或在体内遇到的条件。参见Greenfield(Ed.)，Antibodies：A Laboratory Manual，2

免疫复合物的形成可通过常规方法检测，例如免疫组织化学(IHC)、免疫沉淀(IP)、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如Western印迹)、磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、放射摄影和亲和层析。

缀合物：两个分子连接在一起的复合物，例如通过共价键连接在一起。在一个实施方案中，抗体与效应分子连接；例如，与肺炎链球菌特异性结合的抗体与效应分子(例如可检测标签)共价连接。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应在两个分子之间产生了共价键，以形成一个分子。抗体和效应分子之间可以任选地包括肽接头(短肽序列)。由于缀合物可由两个具有不同功能的分子(例如抗体和效应分子)制备而成，因此它们有时也被称为“嵌合分子”。

保守变体：“保守”氨基酸取代是不会明显影响或降低蛋白质的功能(例如蛋白质与靶蛋白质相互作用的能力)的取代。例如，与参考抗体序列相比，肺炎链球菌特异性抗体可包括多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个保守取代，并保留对PhtD或PspA的特异性结合活性。术语保守变异还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸。

在编码序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或较小百分比的氨基酸(例如少于5％，在一些实施方案中少于1％)的单个取代、缺失或添加是保守变异，其中的改变导致氨基酸被化学性质相似的氨基酸取代。

以下六组氨基酸是被认为是相互保守取代的实例：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

非保守取代是降低抗体活性或功能的取代，例如降低与PhtD或PspA特异性结合的能力。例如，如果一个氨基酸残基对蛋白质的功能至关重要，那么即使是保守取代也可能会破坏其活性。因此，保守取代不会改变目的蛋白质的基本功能。

接触：直接物理结合的放置；包括固态和液态形式，可在体内或体外进行。接触包括一种分子与另一种分子之间的接触，例如一种多肽(例如抗原)表面的氨基酸与另一种多肽(例如抗体)的接触。接触还可以包括与细胞接触，例如通过将抗体与细胞直接物理结合。

对照：参考标准。在一些实施方案中，对照为阴性对照，例如从未感染肺炎链球菌的健康患者中获得的样品。在其他实施方案中，对照是阳性对照，例如从诊断感染肺炎链球菌的患者中获得的组织样品。在另一些实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(例如先前检测过的对照样品，如一组已知预后或结果的患者，或一组代表基线或正常值的样品)。

检测样品与对照之间的差异可以是增加，或相反是减少。差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学上的显著差异。在一些实例中，差异是相对于对照至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％或至少约500％的增加或减少。

简并变体：在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码多肽(例如抗体重链或轻链)的多核苷酸，它包括因遗传密码而简并的序列。有20种天然氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子指定。因此，只要核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列不变，那么编码肽的所有简并核苷酸序列都包括在内。

可检测标志物：可检测分子(也称标签)，其直接或间接与第二分子(例如抗体)缀合，以便于检测第二分子。例如，可检测标志物可通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如CT扫描、MRI、超声波、光导纤维镜检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标志物的具体非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，Green和Sambrook(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4

检测：鉴定某物的存在性、存在或事实。

有效量：特定物质的数量，足以使施用该物质的受试者达到预期效果。例如，这可以是抑制肺炎链球菌感染(例如肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A感染)、可测量地改变此类感染的外在症状或降低继发感染风险所需的量。

在一个实例中，所需的反应是抑制、减少或预防肺炎链球菌感染。肺炎链球菌感染不一定要完全消除、减少或预防才说明方法有效。

在一些实施方案中，施用有效量的公开抗体或抗原结合片段可减少或抑制希望量的肺炎链球菌感染(例如，以滴度、感染肺炎链球菌的受试者数量或百分比或受感染受试者存活时间的增加或与感染相关的症状的减轻来衡量)，例如与合适的对照相比减少或抑制至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、甚至至少100％(消除或预防可检测到的感染)。

向受试者施用特异性结合PhtD或PspA的抗体或抗原结合片段以抑制感染的有效量会因与受试者相关的一些因素而变化，例如受试者的总体健康状况和/或体重。有效量可通过改变剂量和测量所产生的反应来确定，例如病原体负荷的减少。有效量也可通过各种体外、体内或原位免疫测定法确定。

有效量包括与之前或之后的施用相结合以达到有效反应的部分剂量。例如，在持续数天或数周的疗程中，有效量的药剂可以以单剂量或多个剂量施用，例如每天。然而，有效量可取决于接受治疗的受试者、被治疗的病况的严重程度和类型以及施用方式。药剂的单位剂型可以按有效量或有效量的倍数包装，例如，包装在具有无菌组分的小瓶(例如，具有可穿刺的盖子)或注射器中。

效应分子：旨在具有或产生预期效果的分子；例如，对效应分子靶向的细胞产生预期效果，或可检测标志物。效应分子可包括例如多肽和小分子。一些效应分子可能具有或产生不止一种预期效果。

表位：抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，使得它们可引起特定的免疫反应，例如，表位是B和/或T细胞对其产生应答的抗原区域。抗体可与特定的抗原表位结合，例如肺炎链球菌表面蛋白上的表位，如PhtD或PspA的表位。

表达：核酸序列的转录或翻译。例如，当编码核酸序列(例如基因)的DNA被转录为RNA或RNA片段(其在一些实例中加工成为mRNA)时，该编码核酸序列(例如基因)就可以表达。编码核酸序列(例如基因)也可在其mRNA翻译成氨基酸序列(例如蛋白质或蛋白质片段)时表达。在特定的实例中，异源基因在转录成RNA时表达。在另一个实例中，异源基因在其RNA翻译成氨基酸序列时表达。表达调控可包括对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(例如mRNA)降解的控制，或通过特定蛋白质分子产生后的活化、失活、区室化或降解。

表达控制序列：用于调节与其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和翻译(视情况而定)时，表达控制序列与该核酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可包括适当的启动子、增强子、转录终止子、编码蛋白质的基因前的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译以及终止密码子。术语“控制序列”旨在至少包括其存在可影响表达的组分，也可包括其存在是有利的其他组分，例如引导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。

表达载体：包含重组多核苷酸的载体，其包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；其他用于表达的元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体的非限制性实例包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

多核苷酸可插入表达载体，所述表达载体含有启动子序列，可促进宿主有效转录插入的基因序列。表达载体通常包含复制源、启动子以及可对转化细胞进行表型选择的特定核酸序列。

Fc区：抗体的恒定区，不包括第一重链恒定结构域。Fc区一般指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定结构域，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定结构域。Fc区还可包括这些结构域N末端的部分或全部柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc区可以包括或不包括尾部，并且可以被或不被J链结合。对于IgG，Fc区通常被理解为包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及任选地Cγ1和Cγ2之间的铰链的下半部分。尽管Fc区的边界可能有所不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为包括C226或P230至Fc羧基末端的残基，其中编号是根据Kabat进行的。对于IgA，Fc区包括免疫球蛋白结构域Cα2和Cα3以及Cα1和Cα2之间的铰链的下半部分。

异源的：来源于不同的遗传源。与细胞异源的核酸分子来源于表达该核酸分子的细胞以外的遗传源。在一个具体的非限制性实例中，编码蛋白质(例如scFv)的异源核酸分子在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达。在细胞或生物体中引入异源核酸分子的方法是本领域众所周知的，例如用核酸转化，包括电穿孔、脂质转染、粒子枪加速和同源重组。

宿主细胞：可在其中繁殖载体并表达其DNA的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，由于在复制过程中可能会发生突变，因此所有后代可能与亲代细胞并不相同。不过，在使用术语“宿主细胞”时，此类后代也包括在内。

IgG：属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别或同种型的多肽。在人类中，该类别包括IgG

免疫复合物：抗体或抗原结合片段(例如scFv)与可溶性抗原结合形成免疫复合物。免疫复合物的形成可通过常规方法检测，如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如Western印迹)、磁共振成像、CT扫描、放射摄影和亲和层析。

抑制或治疗疾病：抑制疾病或病况的全面发展，例如，在有肺炎链球菌感染等疾病风险的受试者中。“治疗”是指在疾病或病理状态开始发展后，改善其体征或症状的治疗干预。术语“改善”，就疾病或病理状况而言，是指治疗的任何可观察到的有益效果。抑制疾病可包括预防或降低疾病的风险，例如预防或降低细菌感染的风险，如预防或降低肺炎链球菌感染的风险。例如，有益效果可以通过易感受试者疾病的临床症状的延迟出现、疾病的部分或全部临床症状的严重程度的降低、疾病进展的减缓、细菌负荷的减少、受试者整体健康状况或健康的改善或特定疾病特有的其他参数来证明。“预防性”治疗是指对没有表现出疾病症状或仅表现出早期症状的受试者进行的治疗，目的是降低发生病变的风险。

术语“减轻”是一个相对术语，如果在施用药剂后疾病或病况在数量上减轻，或如果与参照药剂相比，在施用药剂后疾病或病况减轻，则该药剂可减轻疾病或病况。同样，术语“预防”并不一定意味着药剂能完全消除疾病或病况，只要疾病或病况的至少一种特征被消除即可。因此，减轻或预防感染的组合物可以但不一定完全消除这种感染，只要感染明显减少，例如与在没有药剂的情况下或与参考药剂相比，减少至少约50％，例如减少至少约70％，或约80％，或甚至减少约90％的感染。

分离的：在生物组分天然存在的生物体细胞中与其他生物组分(即其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本分离、分开生产或纯化的生物组分(例如核酸、肽、蛋白质或蛋白质复合物，如抗体)。因此，分离的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。分离的核酸、肽或蛋白质(例如抗体)的纯度可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。

接头：可用于将两个分子连接成一个连续的分子的双功能分子，例如，将可检测标志物与抗体连接起来。肽接头的非限制性实例包括甘氨酸-丝氨酸接头。

术语“缀合”、“相连”、“结合”或“连接”可指将两个分子连接成一个连续的分子；例如，将两个多肽连接成一个连续的多肽，或将效应分子或可检测标志物放射性核素或其他分子共价连接到多肽如scFv上。连接可以通过化学或重组方式。“化学方式”是指抗体部分和效应分子之间发生反应，使两个分子之间形成共价键，以形成一个分子。

核酸(分子或序列)：脱氧核苷酸或核糖核苷酸聚合物或其组合，包括但不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成(例如化学合成)DNA或RNA。核酸可以是双链(ds)或单链(ss)的。如果是单链的，则核酸可以是有义链或反义链。核酸可以包括天然核苷酸(例如A、T/U、C和G)，并且可以包括天然核苷酸的类似物，例如标记的核苷酸。

“cDNA”是指与mRNA互补或相同的DNA，可以是单链或双链形式。

“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，在生物过程中作为合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译能在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，那么该基因编码蛋白质。基因或cDNA的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常以序列表的形式提供)和非编码链(用作转录模板)均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有相互为简并形式且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子(例如CMV启动子)影响编码序列的转录或表达，则该启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，如果需要在同一阅读框内连接两个蛋白质编码区。

药学上可接受的载体：使用的药学上可接受的载体(carriers(是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy，22

一般来说，载体的性质取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，其包括药学上和生理学上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为运载体(vehicle)。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、添加的防腐剂(例如非天然防腐剂)、pH缓冲剂等，如乙酸钠或山梨醇单月桂酸酯。在特定的实例中，药学上可接受的载体是无菌的，适合例如通过注射方式向受试者肠胃外施用。在一些实施方案中，活性剂和药学上可接受的载体以单位剂型提供，如丸剂或以小瓶中的选定数量提供。单位剂型可包括一个剂量或多个剂量(例如，以小瓶的形式，可选择性地从小瓶中分装药剂的计量剂量)。

肺炎球菌疾病：由肺炎链球菌感染引起的疾病。侵袭性肺炎球菌疾病是一种严重的病况，通常需要住院治疗，并可能致命。严重的疾病表现包括肺炎球菌肺炎、败血症和/或脑膜炎。肺炎球菌肺炎的常见症状包括发烧、咳嗽、气短和胸痛。肺炎球菌脑膜炎的症状包括颈部僵硬、发烧、意识模糊、定向障碍和昏迷。肺炎球菌败血症的症状与肺炎和脑膜炎的症状相似，但包括发冷、血压下降和严重的器官功能障碍。某些慢性病况会导致患者患侵袭性肺炎球菌疾病，如糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒。其他风险因素还包括病毒性呼吸道感染、年龄和既往病毒性呼吸道感染。2岁以下的儿童和65岁以上的成人更容易患肺炎球菌疾病。

尽管疫苗接种已在发达国家普及，但肺炎球菌感染仍占成人肺炎的30％，死亡率高达11-40％。(Bridy-Pappas et al.(2005)Pharmacotherapy 25：1193-212)。此外，在世界上儿童死亡率较高的地区，肺炎球菌肺炎是导致20-50％儿童死亡的原因(Williams etal.(2002)Lancet Infect Dis 2：25-32)。

肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)：PhtD是肺炎链球菌保守表面蛋白群中的成员，该蛋白群还包括PhtA、PhtB和PhtC，所有这些蛋白都具有组氨酸三聚体基序(Adamou etal.(2001)Infect Immun 69：949-958)。这些蛋白彼此的序列同源性很高，PhtB和PhtD具有87％的序列同源性(Rioux et al.(2011)Microbiology 157：335-348)。PhtD高度保守，在从儿童侵袭性疾病病例中分离出的菌株中，PhtD在91-98％不等(Yun et al.(2015)PLoSOne 10：e0134055)。一项对107株肺炎球菌菌株的研究显示，PhtD在100％的测试血清型中都有表达，而其他研究则发现PhtD广泛存在，但在分离出的菌株亚组中却不存在(Rioux etal.(2011)Microbiology 157：335-348；Kawaguchiya et al.(2019)Pathog 8：162；Blumental et al.(2015)PLoS One 10：e0133885；和Rioux et al.(2011)Microbiology157：336-348)。尽管有数据表明Pht蛋白家族与肺炎链球菌附着于呼吸道上皮细胞有关，但其功能尚未完全阐明(Plumptre et al.(2013)Infect Immun 2013/07/22.81：3644-3651；Kallio et al.(2014)Infect Immun 2014/02/03.82：1683-1691)。此外，PhtD的第一个组氨酸三聚体基序已被证明对锌的获得和细菌的稳态很重要(Eijkelkamp et al.(2016)Infect Immun 84：407 LP-415)。已确定了与Zn

肺炎球菌表面蛋白A(PspA)：PspA是另一种疫苗抗原，是肺炎链球菌的重要毒力因子，并且是最丰富的表面蛋白之一(Rosenow et al.(1997)Mol Microbiol 25：819-829)。与PhtD一样，PspA也发现于大多数受检的临床分离株中(Hollingshead et al.(2006)JMed Microbiol 55：215-221)。与完整的菌株相比，PspA突变菌株从小鼠血液中清除的速度更快，接种PspA可保护小鼠免受肺炎球菌感染(Briles et al.1988.Rev Infect Dis 10Suppl.2：S372-4；Bosarge et al.(2001)Infect Immun 69：5456-5463)。与PhtD相比，PspA的保守性较低，PspA可分为三个同一性大于55％的家族和六个同一性大于75％的进化枝(Hollingshead et al.(2000)Infect Immun 68：5889-5900)。PspA有四个不同的结构域，包括α-螺旋区、富脯氨酸区、胆碱结合重复结构域和胞质尾区，其中富脯氨酸区在不同进化枝间高度保守，而N末端的α-螺旋区变化较大(Khan and Jan(2017)Front Microbiol 8：742；Ren et al.(2004)Infect Immun 72：114-122；Mukerji et al.2012.J Immunol 189：5327-5335；和Tu et al.(1999)Infect Immun 67：4720 LP-4724)。已证明PspA可抑制补体沉积，并显示出与人类乳铁蛋白结合的特异性，但这种结合的重要性尚不清楚。已经确定了PspA的乳铁蛋白结合结构域与人乳铁蛋白N末端区域复合的X射线晶体结构(Senkovich etal.(2007)J Mol Biol 370：701-713)。PspA的示例性氨基酸和核酸序列可参见2016年7月24日的

多肽：一种聚合物，其单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体，优选L-异构体。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”意在涵盖任何氨基酸序列，并包括修饰的序列，例如糖蛋白。多肽既包括天然存在的蛋白质，也包括重组或合成产生的蛋白质。多肽具有氨基末端(N末端)和羧基末端。在一些实施方案中，多肽是所公开的抗体或其片段。

纯化：术语“纯化”并不要求绝对纯度；相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽制剂是其中的肽或蛋白质(例如抗体)比细胞内天然环境中的肽或蛋白质更富集的制剂。在一个实施方案中，纯化制剂，使得蛋白质或肽占制剂中肽或蛋白质总含量的至少50％。

重组的：重组核酸是具有非天然存在的序列或具有由两个原本分离的序列片段人工组合而成的序列的核酸。这种人工组合可以通过化学合成实现，或更常见的是通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术实现。重组蛋白是具有非天然存在的序列或具有由两个原本分离的序列片段人工组合而成的序列的蛋白质。在一些实施方案中，重组蛋白由异源(例如重组)核酸编码，该核酸已被引入宿主细胞，例如细菌或真核细胞。例如，核酸可以引入表达载体，该载体具有能够表达由引入的核酸编码的蛋白质的信号，或者核酸可以整合到宿主细胞染色体中。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2：SARS-CoV-2又称2019新型冠状病毒，是p冠状病毒属的正义单链RNA病毒，已成为严重急性呼吸道感染的高致命性病因。SARS-CoV-2感染的症状包括发烧和呼吸道疾病，例如干咳和呼吸急促。严重感染病例可发展为重症肺炎、多器官衰竭和死亡。从暴露到出现症状大约需要2到14天。

检测病毒感染的标准方法可用于检测SARS-CoV-2感染，包括但不限于评估患者的症状和背景以及基因检测，例如逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)。检测可在患者样品如呼吸道样品或血液样品上进行。

序列同一性：两个或多个核酸序列或两个或多个氨基酸序列之间的同一性用序列之间的同一性百分比表示。序列同一性可以用同一性百分比来衡量；百分比越高，序列同一性越高。特异性结合靶抗原的抗体的V

任何合适的方法都可用于序列比对，以进行比较。以下描述了程序和比对算法的非限制性实例：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2(4)：482-489，1981；；Needlemanand Wunsch，J.Mol.Biol.48(3)：443-453，1970；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(8)：2444-2448，1988；Higgins and Sharp，Gene，73(1)：237-244，1988；Higgins and Sharp，Bioinformatics，5(2)：151-3，1989；Corpet，NucleicAcids Res.16(22)：10881-10890，1988；Huang et al.Bioinformatics，8(2)：155-165，1992；和Pearson，Methods Mol.Biol.24：307-331，1994.，Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990，展示了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990)可从多个来源获得，包括美国国家生物信息中心(National Cemer for BiologicalInformation)和互联网，可与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx配合使用。Blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。更多信息请访问NCBI网站。

一般来说，一旦对两个序列进行了比对，就可以通过计算两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定匹配数。两个序列之间的序列同一性百分比是通过将匹配数除以鉴定序列中所示序列的长度，或除以一个衔接长度(例如来自鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将所得值乘以100来确定的。

特异性结合：在指抗体或抗原结合片段时，是指一种结合反应，它能确定在异质蛋白质和其他生物品群体存在下是否存在靶蛋白质。因此，在指定条件下，抗体优先与特定的靶蛋白、肽或多糖(例如病原体表面上存在的抗原，如PhtD或PspA)结合，而不会与样品或受试者中存在的其他蛋白大量结合。特异性结合可通过标准方法确定。参见Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，2

关于抗体-抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合的K

与PhtD或PspA上的表位特异性结合的抗体是与附着有蛋白质的PhtD或PspA基底或生物样品中的蛋白质有实质性结合的抗体。当然，认识到抗体与非靶标之间可能会发生一定程度的非特异性相互作用。与缺乏表位的蛋白质或细胞或组织相比，与包括该表位的蛋白质或表达靶表位的细胞或组织的特异性结合通常会导致结合的抗体的量(单位时间内)增加2倍以上，例如5倍以上、10倍以上或100倍以上。在这种条件下与蛋白质特异性结合需要选择对特定蛋白质具有特异性的抗体。有多种免疫测定形式适合用于选择对特定蛋白质具有特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，固相ELISA免疫测定法通常用于选择对蛋白质具有特异性免疫反应的单克隆抗体。

肺炎链球菌：一种常见于上呼吸道的革兰氏阳性兼性厌氧菌。肺炎球菌携带在活动性感染之前。在幼儿中，肺炎链球菌的携带率可高达40-60％。定植通常是无症状的；但是，肺炎链球菌通常会在流感等原发性病毒感染后迅速传播，引起肺炎和侵袭性肺炎球菌疾病。目前，有至少100种已知的血清型，其中大多数可导致肺炎球菌疾病，包括血清型3、血清型4或血清型19A。

肺炎是由肺炎链球菌引起的最常见疾病。症状包括发烧和发冷、咳嗽、呼吸急促、呼吸困难和胸痛。老年人还会出现意识模糊和警觉性低。肺炎链球菌还可引起肺炎球菌脑膜炎，它是覆盖大脑和脊髓的组织受到感染。症状包括颈部僵硬、发烧、头痛、意识模糊和畏光。败血症也可由肺炎链球菌引起；败血症可导致组织损伤、器官衰竭和死亡。症状包括意识模糊、呼吸急促、心率加快、疼痛或不适、多汗、发烧、颤抖或感觉寒冷。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，一种包括人类和非人类哺乳动物的类别，如非人类灵长类动物、猪、骆驼、蝙蝠、绵羊、牛、狗、猫、啮齿动物等。在一个实例中，受试者是人类。在特定的实例中，受试者是人类。在另外的实例中，选择需要抑制肺炎链球菌感染的受试者。例如，受试者要么未感染肺炎链球菌并面临感染风险，要么已感染并需要治疗。

转化的：转化的细胞是通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。如本文所用，术语转化的等(例如转化、转染、转导等)包括将核酸分子引入细胞的所有技术，包括用病毒载体转导、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速引入DNA。

载体：包含核酸分子(例如DNA或RNA分子)的实体，带有启动子，所述启动子与目的蛋白质的编码序列可操作地连接，并能表达编码序列。非限制性实例包括裸露的或包装的(脂质和/或蛋白质)DNA、裸露的或包装的RNA、可能无复制能力的病毒或细菌或其他微生物的亚组分或可能有复制能力的病毒或细菌或其他微生物的亚组分。载体有时称为构建体。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包括一个或多个可选择标志物基因和其他遗传元件。病毒载体是重组核酸载体，其具有来源于一个或多个病毒的至少一些核酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包括编码与肺炎链球菌特异性结合的所公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体。

在足以......的条件下：用于描述允许预期活性的任何环境的短语。

II.一些实施方案的描述

提供了特异性结合肺炎链球菌的分离的单克隆抗体和抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可以是全人源的。在一些实施方案中，所公开的抗体可抑制肺炎链球菌的体内感染，并可在肺炎链球菌(例如但不限于肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A)感染之前或之后施用。还提供了包括这些抗体的可变结构域的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。此外，本文公开了包含抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段和药学上可接受的载体的组合物。还提供了编码抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段、可变结构域的核酸，以及包含这些核酸的表达载体(例如腺相关病毒(AAV)病毒载体)。所述抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段、核酸分子、宿主细胞和组合物可用于研究、诊断、治疗和预防目的。例如，所公开的抗体和抗原结合片段可用于诊断患有肺炎链球菌感染的受试者，或可施用以抑制受试者的肺炎链球菌感染。

A.特异性结合PhtD.或PspA的单克隆抗体及其抗原结合片段

下面讨论的单克隆抗体是指包括重链和/或轻链可变结构域的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，这些结构域包括CDR1、CDR2和/或CDR3，参照IMGT编号方案(除非上下文另有说明)。各种CDR编号方案(例如Kabat、Chothia或IMGT编号方案)可用于确定CDR位置。在序列表中提供了所公开的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列和CDR(根据IMGT编号方案)，但这些只是示例性的。

在一些实施方案中，提供了一种单克隆抗体，它包含本文所述任何一种抗体的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，提供了一种单克隆抗体，它包含本文所述任何一种抗体的重链和轻链可变区。

表1.抗体的IMGT CDR和SEQ ID NO

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a.单克隆抗体PhtD3

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD3抗体为基础或来源于PhtD3抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。

单克隆抗体PhtD3靶向PhtD的N末端部分，PhtD是肺炎链球菌的保守表面蛋白。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD3 mAb可延长感染肺炎球菌血清型3的小鼠的存活时间，并在鼻内和静脉感染模型中对血清型4提供预防性保护。此外，在肺炎球菌感染24小时后施用的血清型3治疗模型中，mAb PhtD3具有保护作用。

在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：2、3和4所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：2、3和4所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。

b.单克隆抗体PhtD8

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD8抗体为基础或来源于PhtD8抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。

单克隆抗体PhtD8靶向PhtD的C末端部分，PhtD是肺炎链球菌的保守表面蛋白。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD8在多种不相关的肺炎球菌血清型中具有广泛的反应性，并且PhtD8 mAb延长了感染肺炎球菌血清型3的小鼠的存活时间。

在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。

c.单克隆抗体PhtD6

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD6抗体为基础或来源于PhtD6抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。

单克隆抗体PhtD6靶向PhtD的N末端部分，PhtD是肺炎链球菌的保守表面蛋白。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD6在多种不相关的肺炎球菌血清型中具有广泛的反应性，并且对固定细菌的亲和力高于PhtD8。PhtD6也表现出与PhtD3的中等结合竞争。与PhtD8相比，mAb PhtD3和PhtD6的N末端特异性与对全细胞细菌的更高的结合相关，这是一个惊人的观察结果，因为预测该蛋白质的N末端区域附着在细菌表面，使C末端一半更多暴露于表面。

在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：18、19和20所示的HCDRl、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：18、19和20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。

d.单克隆抗体PhtD7

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD7抗体为基础或来源于PhtD7抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。

单克隆抗体PhtD7似乎靶向依赖于氨基酸341-838的独特构象表位，但这种mAb不结合PhtD的341-647或645-838片段。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD7在多种不相关的肺炎球菌血清型中具有广泛的反应性，并且对固定化细菌的亲和力高于对PhtD8的亲和力。此外，在肺炎链球菌感染的小鼠模型中，PhtD7 mAb具有保护作用并能提高存活率。

在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。

e.单克隆抗体PspA16

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD8抗体为基础或来源于PhtD8抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。

单克隆抗体PspA16靶向PspA的N末端区段，PspA是肺炎链球菌最丰富的表面蛋白之一。正如实施例中进一步讨论的那样，PspA16对重组PspA有很高的亲和力，并根据与氨基酸片段1-438和1-512的阳性结合以及与247-512、436-725和247-725片段的阴性结合，与N末端片段1-247结合。发现PspA16结合肺炎链球菌血清型19A和血清型菌株3WU。由于PspA16与PspA的最可变区域结合，因此与不同血清型的结合减少是意料之中的。此外，如实施例所示，在肺炎链球菌感染的小鼠模型中，PspA16 mAb具有保护作用并能提高存活率。

在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：34、35和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：34、35和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的Vn，包含分别如SEQ ID NO：38、39和40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的V

在一些实施方案中，所公开的抗体可抑制肺炎链球菌感染。

f.其他抗体

在一些实例中，与目的表位结合的抗体可以根据它们在结合测定中与本文提供的抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制其结合)的能力来鉴定。在其他实例中，与目的表位结合的抗体可以根据它们在结合测定中与本文提供的一种或多种抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制其结合)的能力来鉴定。

与所公开抗体结合的PhtD或PspA的相同表位结合的人类抗体可以用任何合适的方法产生。例如，可以通过向转基因动物施用免疫原来制备这种抗体，转基因动物经过改造，可以在抗原挑战下产生完整的人类抗体或带有人类可变区的完整抗体。这种动物通常含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座，这些基因座取代了内源性免疫球蛋白基因座，或以染色体外方式存在，或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。有关从转基因动物中获取人类抗体的方法，请参阅Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。另见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSE

还可以通过基于杂交瘤的方法制造与相同表位结合的其他人类抗体。已经描述了用于生产人类单克隆抗体的人类骨髓瘤细胞系和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boemer et al.，J.Immunol.，147：86(1991)。)Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)还描述了通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体。其他方法包括那些描述于例如美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人类IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的方法。Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)还描述了人类杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)。人类抗体也可以通过从人类衍生的噬菌体展示文库中分离出Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将这些可变结构域序列与所需的人类恒定结构域相结合。

还可以通过筛选具有所需结合特性的抗体组合文库，分离出与相同表位特异性结合的抗体和抗原结合片段。例如，通过生成噬菌体展示文库并筛选出具有所需结合特性的抗体的此类文库。此类方法在例如Hoogenboom et al.，Methods in Molecular Biology178：1-37(O'Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2001)中进行了综述，并在例如McCafferty et al.，Nature 348：552-554；Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks and Bradbury，inMethods in Molecular Biology 248：161-175(Lo，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2003)；Sidhuetal.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中进一步描述。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆V

2.抗体和抗原结合片段的其他说明

本文公开的抗体或抗体的抗原结合片段可以是人类抗体或其片段。还提供了嵌合抗体。抗体或抗原结合片段可包括任何合适的框架区，例如(但不限于)来自另一来源的人类框架区或优化的框架区。备选地，抗体的重链或轻链中也可包括异源框架区，例如(但不限于)小鼠或猴子框架区。

抗体可以是任何同种型。例如，抗体可以是IgA、IgM或IgG抗体，如IgG

在一些实例中，所公开的抗体是抗体的寡聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等。

抗体或抗原结合片段可以衍生或连接到另一种分子(例如另一种肽或蛋白质)。一般来说，对抗体或抗原结合片段进行衍生化使得其与肺炎链球菌(例如PhtD或PspA)的结合不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体或抗原结合片段可(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)与一个或多个其他分子实体进行功能连接，所述分子实体如另一种抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、可检测标志物、效应分子或可介导抗体或抗体部分与另一种分子结合的蛋白质或肽(例如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标签)。

(a)结合亲和力

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合，例如与PhtD或PspA特异性结合，其亲和力(例如以K

在另一种测定中，可使用生物层干涉测量法(Biolayer interferometry，BLI)使用表面等离振子共振测定来测量K

(b)多特异性抗体

在一些实施方案中，提供了一种多特异性抗体，如双特异性抗体，它包括特异性结合肺炎链球菌的抗体或抗原结合片段，如本文提供的与PhtD或PspA结合的抗体或抗原结合片段。任何合适的方法都可用于设计和生产多特异性抗体，如交联两种或多种抗体(例如交联特异性结合PhtD的抗体和特异性结合PspA的抗体)、相同类型或不同类型的抗原结合片段(例如scFv)。制造多特异性抗体的示例性方法包括PCT公开号WO2013/163427中所述的方法，该专利通过引用的方式整体并入本文。合适的交联剂的非限制性实例包括异双官能的交联剂，其具有被适当的间隔区(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯)隔开的两个明显的反应性基团，或同双官能的交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。

在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段以及PhtD7、PhtD6、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD7抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在一些实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD6、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在一些实例中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD7、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD8抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD7、PhtD6和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，多特异性抗体包括PspA16抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PspA16抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD7、PhtD6和PhtD8抗体或抗原结合片段中的一种或多种。

多特异性抗体可以具有任何合适的形式，允许本文提供的抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌结合，如与PhtD或PspA结合。双特异性单链抗体可由单个核酸分子编码。双特异性单链抗体的非限制性实例以及构建这种抗体的方法在美国专利号8,076,459、8,017,748、8,007,796、7,919,089、7,820,166、7,635,472、7,575,923、7,435,549、7,332,168、7,323,440、7,235,641、7,229,760、7,112,324、6,723,538中提供。双特异性单链抗体的其他实例可参见PCT申请号WO 99/54440；Mack et al.，J.Immunol.，158(8)：3965-3970，1997；Mack et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92(15)：7021-7025，1995；Kufer et al.，Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4)：193-197，1997；

最外层或N末端可变结构域称为VD1，最内层可变结构域称为VD2；VD2位于C末端CH1或CL的近端。正如Jakob等人在上文所公开的，DVD-免疫球蛋白分子可以大量制造和纯化至均一，具有与传统IgG

(c)抗原结合片段

本公开包括抗原结合片段，如Fab、F(ab’)

(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生完整的轻链和一条重链的一部分；

(2)Fab’，抗体分子的片段，可用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，得到完整的轻链和部分重链；

(3)(Fab')

(4)Fv，基因工程片段，包含以两条链表达的V

(5)单链抗体(例如scFv)，定义为含有V

(6)单链抗体的二聚体(scFV

可以使用任何合适的方法来生产上述抗原结合片段。非限制性实例在Harlow andLane，Antibodies：A Laboratory Manual，2

抗原结合片段可通过对抗体进行蛋白水解或在宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)中表达编码所述片段的DNA来制备。抗原结合片段也可以通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体而获得。例如，抗原结合片段可以通过胃蛋白酶酶促裂解抗体来产生，从而得到5S片段，即F(ab')

也可使用其他裂解抗体的方法，如分离重链以形成单价轻重链片段，进一步裂解片段，或使用其他酶促、化学或基因技术，只要片段能与完整抗体识别的抗原结合即可。

(d)变体

在一些实施方案中，提供了本文提供的抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)的氨基酸序列变体。例如，改善抗体或多特异性抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性可能是理想的。抗体的氨基酸序列变体可通过在编码抗体V

在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的变体。取代诱变的目的位点包括CDR和框架区。可将氨基酸取代引入到目的抗体中，并对产物进行所需活性的筛选，如保留/改善抗原结合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC。

变体通常保留正确折叠和稳定V

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的V

在更多的实施方案中，与SEQ ID NO：9中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的V

在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO：17中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的V

在另一些实施方案中，与SEQ ID NO：25中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的V

在更多的实施方案中，与SEQ ID NO：33中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的V

在一些实施方案中，可以在一个或多个CDR内发生取代、插入或缺失，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。在上文提供的变体V

为了提高抗体的结合亲和力，可以随机突变V

在一些实施方案中，改变抗体或抗原结合片段以增加或减少抗体或抗原结合片段糖基化的程度。糖基化位点的增加或缺失可通过改变氨基酸序列使一个或多个糖基化位点产生或缺失来实现。

当抗体包含Fc区时，可改变附着其上的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链双触角(biantennary)寡糖，该寡糖一般通过N-连接连接到Fc区CH

在一个实施方案中，所提供的变体具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。岩藻糖的量是通过计算相对于连接到Asn 297的所有糖结构(例如复合物结构、杂合体结构和高甘露糖结构)的总和，糖链中Asn297处岩藻糖的平均量来确定的，如通过MALDI-TOF质谱(例如如WO 2008/077546中所述)所测量的。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Ash297也可能位于297位上游或下游约±3个氨基酸，即294位和300位之间。这种岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd)。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.，336(5)：1239-1249，2004；Yamane-Ohnuki et al.，Biotechnol.Bioeng.87(5)：614-622，2004。能产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec 13 CHO细胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249(2)：533-545，1986；美国专利申请号US 2003/0157108和WO2004/056312，特别是在实施例11中)，以及基因敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki et al.，Biotechnol.Bioeng.，87(5)：614-622，2004；Kanda et al.，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688，2006；和WO2003/085107)。

进一步提供具有二等分(bisected)寡糖的抗体变体，例如，其中连接到抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利号6,602,684(Umana et al.)；和US 2005/0123546(Umana et al.)。还提供了在连接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。

在一些实施方案中，抗体或多特异性抗体的恒定区包含一个或多个氨基酸取代，以优化抗体的体内半衰期。IgG Abs的血清半衰期受新生儿Fc受体(FcRn)调节。因此，在一些实施方案中，抗体包含增加与FcRn的结合的氨基酸取代。此类取代的非限制性实例包括IgG恒定区T250Q和M428L(参见，例如，Hinton et al.，J Immunol.，176(1)：346-356，2006)；M428L和N434S(“LS”突变，参见，例如，Zalevsky，et al.，Nature Biotechnol.，28(2)：157-159，2010)；N434A(参见，例如，Petkova et al.，Int.Immunol.，18(12)：1759-1769，2006)；T307A、E380A和N434A(参见，例如，Petkova et al.，Int.Immunol.，18(12)：1759-1769，2006)；以及M252Y、S254T和T256E(参见，例如，Dall'Acqua et al.，J.Biol.Chem.，281(33)：23514-23524，2006)处的取代。所公开的抗体和抗原结合片段可以与包含上述任一取代的Fc多肽连接或包括包含上述任一取代的Fc多肽，例如，Fc多肽可以包括M428L和N434S取代。

在一些实施方案中，本文提供的抗体或多特异性抗体可进一步被修饰以包含另外的非蛋白部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性，在生产中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链的或非支链的。附着在抗体上的聚合物的数量可以不同，如果附着有一种以上的聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可根据如下考虑因素来确定，包括但不限于待改进抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在规定条件下用于应用等。

B.缀合物

与肺炎链球菌如本文公开的PhtD或PspA特异性结合的抗体、抗原结合片段和多特异性抗体(例如双特异性抗体)可与效应分子或可检测标志物等物质缀合。共价和非共价连接方式均可使用。可使用各种效应分子和可检测标志物，包括(但不限于)毒素和放射活性剂，如

将可检测标志物连接到抗体、抗原结合片段或多特异性抗体上的步骤因效应物的化学结构而异。多肽通常含有多种官能团，如羧基(-COOH)、游离胺基(-NH

鉴于已经报道了大量将各种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标签(例如酶或荧光分子)、毒素和其他物质附着到抗体上的方法，因此可以确定一种合适的方法，用于将给定的物质附着到抗体或抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)上。

抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)可与可检测标志物缀合；例如，可通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(例如CT、计算机轴向断层扫描(CAT)、MRI、磁共振断层扫描(MTR)、超声波、光纤检查和腹腔镜检查)检测的可检测标志物。可检测标志物的具体非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标志物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系荧光粉等。也可以使用生物发光标志物，如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体还可以与用于检测的酶缀合，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶缀合时，可通过添加另外的试剂来检测，所述试剂被酶用来产生可被识别的反应产物。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺会产生彩色反应产物，其可通过视觉检测。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体也可以与生物素缀合，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素的结合来检测。值得注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标签缀合。

抗体、抗原结合片段或多特异性抗体可与顺磁剂(例如钆)缀合。顺磁剂如超顺磁性氧化铁也可用作标签。抗体还可以与镧系元素(例如铕和镝)和锰缀合。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体也可以用二级报告物识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)进行标记。

抗体、抗原结合片段或多特异性抗体也可以与放射性标记氨基酸缀合，例如用于诊断目的。例如，放射性标记可用于通过放射摄影、发射光谱或其他诊断技术检测肺炎链球菌。多肽的标签的实例包括但不限于以下放射性同位素：

例如，缀合物中每个抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的可检测标志物部分的平均数量范围为从每个抗体或抗原结合片段中有1个到20个部分不等。在一些实施方案中，缀合物中每个抗体或抗原结合片段的效应分子或可检测标志物部分的平均数量范围为约1个至约2个、约1个至约3个、约1个至约8个、约2个至约6个、约3个至约5个、或约3个至约4个。缀合物的负载量(例如，效应分子与抗体的比率)可以通过不同的方式进行控制，例如通过以下方式：(i)限制效应分子-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程化，从而改变半胱氨酸残基的数量和位置，以控制接头-效应分子连接的数量或位置。

C多核苷酸和表达

提供了编码与肺炎链球菌如本文公开的PhtD或PspA特异性结合的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和缀合物的氨基酸序列的核酸分子(例如cDNA或RNA分子，如mRNA)。利用本文提供的氨基酸序列(例如CDR序列以及V

遗传密码可用于构建各种功能上等效的核酸序列，如序列不同但编码相同抗体序列的核酸，或编码包括V

在一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体的V

下文公开了示例性核苷酸序列：

PhtD3 V

PhtD3 V

PhtD8 V

PhtD8 V

PhtD6 V

PhtD6V

PhtD7 V

PhtD7V

PspA16 V

PspA16 V

还提供了这些核酸序列的简并变体。

编码与肺炎链球菌如PhtD或PspA特异性结合的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和缀合物的核酸分子可以通过任何合适的方法制备，包括例如克隆适当的序列或通过标准方法直接进行化学合成。化学合成可产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交或通过使用DNA聚合酶以单链为模板进行聚合，可将其转化为双链DNA。

示例性核酸可通过克隆技术制备。适当的克隆和测序技术的实例可参见例如Green and Sambrook(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4

核酸也可通过扩增方法制备。扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)和自我维持序列复制系统(3SR)。

核酸分子可在重组工程细胞，如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达。抗体、抗原结合片段和缀合物可以表达为包括V

为产生scFv，可将编码V

如果只使用单个V

编码抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)或缀合物的一个或多个DNA序列可通过DNA转移到合适的宿主细胞进行体外表达。细胞可以是原核细胞或真核细胞。许多可用于表达蛋白质的表达系统，包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞，如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系，都可用来表达所公开的抗体和抗原结合片段。可以使用稳定转移的方法，即外来DNA在宿主中持续保持。表达目的抗体的杂交瘤也包含在本公开中。

编码本文所述抗体、抗原结合片段和多特异性抗体的核酸的表达可通过将DNA或cDNA与启动子(组成型或诱导型)可操作地连接，然后将其纳入表达盒来实现。启动子可以是任何目的启动子，包括巨细胞病毒启动子。任选地，在构建体中包括增强子，如巨细胞病毒增强子。表达盒可以适合在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达盒含有用于调节编码蛋白质的DNA表达的特定序列。例如，表达盒可包括适当的启动子、增强子、转录和翻译终止子、启动序列、蛋白质编码基因前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA适当翻译的序列以及终止密码子。载体可编码可选择标志物，如编码抗药性(例如氨苄西林或四环素抗药性)的标志物。

为了获得克隆基因的高水平表达，需要构建表达盒，例如，表达盒包含强启动子以指导转录，核糖体结合位点以启动翻译(例如内部核糖体结合序列)，以及转录/翻译终止子。对于大肠杆菌，这可以包括启动子，如T7、trp、lac或λ启动子，核糖体结合位点，以及优选地转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可以包括启动子和/或增强子，例如来自免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒的启动子和/或增强子，以及多聚腺苷酸化序列，并且可以进一步包括剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。可通过任何合适的方法将盒转移到所选的宿主细胞中，例如对于大肠杆菌使用转化或电穿孔以及对于哺乳动物细胞使用磷酸钙处理、电穿孔或脂转染。用盒转化的细胞可通过盒中包含的基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)赋予的抗生素抗性进行选择。

可以对编码本文所述多肽的核酸进行修饰而不降低其生物活性。可以进行一些修饰，以便于靶向分子的克隆、表达或将靶向分子并入融合蛋白中。这些修饰包括例如终止密码子、建立方便定位的限制位点的序列和在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点的序列或帮助纯化步骤的另外的氨基酸(例如多聚His)。

一旦表达，抗体、抗原结合片段、多特异性抗体和缀合物可根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等(一般参见Simpson et al.(Eds.)，Basicmethods in Protein Purification and Analysis：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009)。抗体、抗原结合片段和缀合物的纯度不必达到100％。一旦根据需要纯化、部分纯化或纯化至均一，如果是预防性使用，多肽应基本上不含内毒素。

从哺乳动物细胞和细菌(例如大肠杆菌)中表达抗体、抗原结合片段、多特异性抗体和缀合物和/或再折叠成适当的活性形式的方法已经被描述，并适用于本文公开的抗体。参见，例如，Greenfield(Ed.)，Antibodies：A Laboratory Manual，2

D.方法和组合物

1.抑制肺炎链球菌感染和/或肺炎球菌疾病

本文公开了抑制受试者肺炎链球菌感染的方法。肺炎链球菌感染可以是任何血清型，例如肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A感染。在一些实例中，肺炎链球菌是血清型3。这些方法包括向有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的受试者施用有效量(即有效抑制受试者感染的量)的所公开的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码这种抗体或抗原结合片段的核酸。这些方法可用于暴露前或暴露后。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以以多特异性抗体(例如双特异性抗体)的形式使用。抗原结合片段可以是scFv。

在一些实施方案中，选择受试者进行治疗。例如，有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的受试者。受试者可能患有肺炎球菌疾病或有患肺炎球菌疾病的风险，包括但不限于肺炎球菌肺炎、败血症或脑膜炎。患有某些慢性病况(例如糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒)的受试者患肺炎链球菌感染或肺炎球菌疾病的风险会增加。在一些实例中，被选中的受试者患有糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒。受试者可能合并感染另一种病毒，例如但不限于流感病毒。

此外，急性病况如原发性病毒性呼吸道感染也会增加肺炎链球菌感染的风险。在一些实例中，被选中进行治疗的受试者患有肺炎链球菌感染以外的感染。例如，可以选择患有原发性病毒感染的受试者，如呼吸道病毒感染。在一些实施方案中，被选中的受试者患有流感、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、人类变性肺病毒、副流感病毒感染。在具体的非限制性实例中，感染是流感或严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2感染。在另一个非限制性实例中，感染是甲型流感感染。

年龄是另一个风险因素，2岁以下或65岁以上的受试者更容易感染肺炎链球菌。在一些实例中，被选中进行治疗的受试者年龄在约2岁以下或约65岁以上。受试者的年龄可以小于一岁，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月大。受试者可以是老年人，例如年龄大于65、70、75、80、85或90岁。

该方法不需要完全消除或抑制感染才有效。例如，与未治疗时的肺炎链球菌感染相比，该方法可按所需量减少感染，例如减少至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，甚至至少100％(消除或预防可检测到的肺炎链球菌感染)。在一些实施方案中，还可以用有效量的另外的药剂(例如抗菌剂)治疗受试者。在一些实施方案中，对受试者施用青霉素或其衍生物，如阿莫西林、大环内酯类、克林霉素、头孢菌素、利福平、万古霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和/或头孢曲松。

在一些实施方案中，施用有效量的所公开抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码所公开抗体的核酸分子可抑制受试者感染的建立和/或随后的疾病进展，例如侵袭性肺炎球菌疾病的发展，这可包括受试者肺炎链球菌感染的活动(例如生长或侵袭)或症状的任何统计学意义上的显著降低。

本文公开了用于抑制受试者中肺炎链球菌复制的方法。这些方法包括向有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的受试者施用有效量(即有效抑制受试者中复制的量)的所公开抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)或编码此类抗体、抗原结合片段的核酸。这些方法可用于暴露前或暴露后。

公开了用于治疗受试者肺炎链球菌感染的方法。还公开了用于预防受试者肺炎链球菌感染的方法。这些方法包括施用如本文公开的一种或多种所公开的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体、或编码此类抗体的核酸分子、或包括此类抗体的组合物。核酸分子可以是DNA或RNA。

可以使用任何施用途径。在一些实施方案中，抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段、核酸分子、载体或药物组合物向受试者鼻内、静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内施用。

在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量可为约0.5mg/kg至50mg/kg。在一些实例中，剂量为约1mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.5mg/kg至约20mg/kg、约0.5mg/kg至约15mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约25mg/kg、约1mg/kg至约25mg/kg、约5mg/kg至约25mg/kg、约10mg/kg至约25mg/kg、约15mg/kg至约25mg/kg、约20mg/kg至约25mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约15mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约15mg/kg、约10mg/kg至约15mg/kg或约10mg/kg至约20mg/kg。在一些实例中，剂量为约7.5mg/kg至约15mg/kg。

抗体、其抗原结合片段和多特异性抗体可通过静脉内输注施用。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量会改变，但一般在约0.5mg/kg至约50mg/kg的范围内，例如剂量为约1mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg。在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量可以为约0.5mg/kg至约5mg/kg，例如剂量为约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体按照医生确定的给药计划施用。在一些实例中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体每周、每两周、每三周或每四周施用一次。

抗体、其抗原结合片段和多特异性抗体(例如双特异性抗体)可鼻内施用。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量会改变，但一般在约0.5mg/kg至约50mg/kg的范围内，例如剂量为约1mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg。在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量可以为约0.5mg/kg至约5mg/kg，例如剂量为约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg。

抗体、抗原结合片段或多特异性抗体按照医生确定的给药计划施用。在一些实例中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体每周、每两周、每三周或每四周施用一次。

在一些实施方案中，抑制受试者感染的方法进一步包括向受试者施用一种或多种另外的药剂。另外的目的药剂包括但不限于抗生素，例如青霉素或其衍生物，如阿莫西林、大环内酯类、克林霉素、头孢菌素、利福平、万古霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和/或头孢曲松。

在一些实施方案中，该方法包括施用有效量的特异性结合肺炎链球菌的一种以上所公开的抗体或抗原结合片段的组合，或编码这种抗体或抗原结合片段的核酸分子，例如，2、3、4、5或更多种所公开的抗体或抗原结合片段的组合，或编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些非限制性实例中，该方法包括施用第一抗体或抗原结合片段，例如PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或抗原结合片段，和第二抗体或抗原结合片段，例如PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或抗原结合片段中的另一种。在进一步的实例中，该方法包括施用第三抗体或抗原结合片段，例如，PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或抗原结合片段中的另一种。

在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段结合PhtD或PspA的一个表位，而另外的抗体或抗原结合片段(例如，第二、第三、第四、第五抗体或抗原结合片段)结合PhtD或PspA的不同表位。在一些实例中，组合中的每个抗体都能结合PhtD或PspA的不同表位。在一些实施方案中，一种或多种特异性结合PhtD(例如PhtD3、PhtD6、PhtD7和/或PhtD8)的抗体或抗原结合片段与特异性结合PspA(例如PspA16)的抗体或抗原结合片段联合施用。在进一步的实例中，施用至少一种靶向PspA的抗体或抗原结合片段和至少两种靶向PhtD的抗体或抗原结合片段，例如PhtD3、PhtD7和PspA16。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码上述抗体或抗原结合片段的核酸分子，如本文所公开的。

在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD7、PhtD6、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD7抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在一些实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。

在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD6、PhtD8和PspAl6抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。

在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD7、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。

在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD8抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD7、PhtD6和PspA16抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD8抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，该方法包括施用PspA16抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PspA16抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD7、PhtD6和PhtD8抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。

在一些实施方案中，向受试者施用编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的DNA或RNA，以提供体内抗体生产，例如使用受试者的细胞机制。在一些实例中，向受试者施用有效量的编码scFV的mRNA或编码抗体V

可以使用任何合适的核酸施用方法；美国专利号5,643,578、美国专利号5,593,972和美国专利号5,817,637提供了非限制性实例。美国专利号5,880,103描述了几种向生物体递送编码蛋白质的核酸的方法。施用核酸的一种方法是直接施用质粒DNA，如哺乳动物表达质粒。可将编码所公开抗体、其抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)的核苷酸序列置于启动子的控制下以增加表达。这些方法包括核酸的脂质体递送。这些方法可用于生产抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，使用pVRC8400载体(描述于Barouch et al.，J.Virol.，79(14)，8828-8834，2005，该文献通过引用的方式并入本文)在受试者中表达所公开的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，可以向受试者(例如有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的人类受试者)施用有效量的AAV病毒载体，该AAV病毒载体包含一个或多个编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)的核酸分子。AAV病毒载体设计用于表达编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的核酸分子，向受试者施用有效量的AAV病毒载体可导致受试者中表达有效量的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体。可用于在受试者中表达所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的AAV病毒载体的非限制性实例包括Johnson et al.，Nat.Med.，15(8)：901-906，2009和Gardner et al.，Nature，519(7541)：87-91，2015提供的AAV病毒载体，其中每篇文献的全部内容通过引用的方式并入本文。

在一个实施方案中，将编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的核酸直接引入组织。例如，可以用标准方法将核酸装载到金微球上，然后用Bio-Rad的HELIOS

通常，DNA被注射到肌肉中，尽管也可直接注射到其他部位。注射剂量通常为约0.5μg/kg至约50mg/kg，通常为约0.005mg/kg至约5mg/kg(参见，例如，美国专利号5,589,466)。

包括所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)、缀合物或编码此类分子的核酸分子在内的组合物的单次或多次施用可根据患者需要和耐受的剂量和频率进行。剂量可以一次施用，也可以定期施加，直到达到预期效果或出现副作用需要停止治疗为止。一般来说，该剂量足以抑制肺炎链球菌感染，而不会对患者产生不可接受的毒性。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定人体使用的剂量范围。剂量通常在包括ED

肺炎链球菌特异性抗体、抗原结合片段或多特异性抗体或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物可以通过各种方式向受试者施用，包括局部和全身施用，如通过皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮内注射或鞘内注射。在一个实施方案中，抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物每天一次通过单次皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮内注射或鞘内注射施用。抗体、抗原结合片段、多特异性抗体、缀合物或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物也可以通过在疾病部位或附近直接注射施用。进一步的施用方法是通过渗透泵(例如Alzet泵)或微型泵(例如Alzet迷你渗透泵)，在预先确定的时间段内可控制、持续和/或缓释递送抗体、抗原结合片段、缀合物或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物。渗透泵或微型泵可皮下或靶部位附近植入。

2.组合物

所提供的组合物包括在药学上可接受的载体中的本文公开的一种或多种肺炎链球菌特异性抗体、抗原结合片段、缀合物或编码此类分子的核酸分子。在一些实施方案中，组合物包含本文公开的PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，组合物包含两种、三种、四种或更多种特异性结合肺炎链球菌(例如PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16)的抗体或抗原结合片段。在一个实例中，组合物包含PhtD3和PhtD7抗体或抗原结合片段。在其他实例中，组合物包括以下抗体或抗原结合片段：PhtD3和PhtD6、PhtD3和PhtD8、PhtD3和PspA16、PhtD7和PhtD6、PhtD7和PhtD8、PhtD7和PspA16、PhtD6和PhtD8、PhtD6和PspA16、或PhtD8和PspA16。在一些实施方案中，组合物中包含至少一种特异性结合PhtD(例如PhtD3、PhtD6、PhtD7或PhtD8)的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体。在其他实施方案中，组合物中包含至少一种特异性结合PspA(例如PspA16)的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体。例如，组合物可用于抑制或检测肺炎链球菌感染，如肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A感染。

组合物可以制备成单位剂型，如试剂盒，用于向受试者施用。施用量和施用时序由施用医生决定，以达到预期目的。抗体、抗原结合片段、多特异性(例如双特异性)抗体、缀合物或编码此类分子的核酸分子可配制成全身或局部用药。在一个实例中，抗原结合片段、多特异性抗体、缀合物或编码此类分子的核酸分子配制成肠胃外施用，如静脉内施用或鼻内施用。

在一些实施方案中，组合物中抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或其缀合物的纯度为至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。在一些实施方案中，组合物含有小于10％(例如小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％或甚至更少)的大分子污染物，例如其他哺乳动物(例如人类)蛋白质。

用于施用的组合物可包括溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、缀合物或编码此类分子的核酸分子的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，一般不含不想要的物质。这些组合物可以通过任何合适的技术进行灭菌。为接近生理条件，组合物可含有药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。抗体在这些制剂中的浓度可以变化很大，主要根据液体体积、粘度、体重等按照所选的特定施用方式和受试者的需要来选择。

典型的用于静脉内施用的组合物包括每名受试者每天约0.01至约30mg/kg的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或缀合物(或相应剂量的包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。任何合适的方法都可用于制备可施用的组合物；非限制性实例在诸如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，22

典型的用于鼻内施用的组合物包括每名受试者每天约0.01至约50mg/kg的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或缀合物(或相应剂量的包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。任何合适的方法都可用于制备可施用的组合物；非限制性实例在诸如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，22

提供了一种气雾剂组合物，用于递送抗体、其抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。单克隆抗体雾化的示例性方法已在欧洲公开号EPl8819934中公开。呼吸道包括上呼吸道，其包括口咽部和喉部，随后是下呼吸道，其包括气管，气管随后分支成支气管和细支气管。上气道和下气道被称为传导气道。末端细支气管再分为呼吸性细支气管，呼吸性细支气管然后通向最终呼吸区--肺泡或深肺。

肺部递送可通过吸入实现，本文的通过吸入施用可以是口服和/或鼻腔施用。用于肺部递送的药物装置的实例包括计量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和雾化器。例如，美国专利号5,756,353；5,858,784；和PCT公开号WO98/31346；WO98/10796；WO00/27359；WO01/54664；WO02/060412中描述了通过吸入的示例性递送系统，其可适于递送治疗剂(例如抗体、其抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体))。美国专利号6,294,153；美国专利号6,344,194；美国专利号6,071,497和PCT公开号WO02/066078；PCT公开号WO02/053190；PCT公开号WO01/60420；和PCT公开号WO00/66206中还公开了用于递送抗体的气雾剂制剂。

可以使用加压计量吸入器(pMDI)。在这些装置中，当阀门打开(通常通过按压推进剂罐)，使液体推进剂从罐中喷出时，就会产生气雾剂。通常情况下，治疗剂包含在悬浮在液体推进剂中的小颗粒(直径通常为几微米)中，但在一些制剂中，治疗剂可以溶解在推进剂中。当气雾剂离开装置时，推进剂会迅速蒸发，从而产生被吸入的小颗粒。此类pMDI通常使用的推进剂包括但不限于氢氟烃(HFA)。表面活性剂也可用于pMDI，例如用于配制治疗剂。pMDI还可使用其他溶剂或赋形剂，如乙醇、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、甘油、氯丁醇和氯化十六烷基吡啶。此类pMDI可以进一步包括附加装置，例如间隔器、容纳室和其他改装装置。

雾化器可产生供吸入的雾状含药液滴，可分为两种类型：超声波雾化器和喷射雾化器。此外，还开发了单次呼吸雾化器(例如

另一种类型的吸入器是干粉吸入器(DPI)。在DPI中，气雾剂可以是粉末，在吸入前一直保存在装置中。治疗剂以粉末形式制成，粉末颗粒很小(直径通常为几百万分之一米，或微米)。在许多DPI中，治疗剂与大得多的糖颗粒(例如乳糖一水合物)混合，糖颗粒的直径通常为50-100微米。乳糖/治疗剂团聚体上增加的空气动力可改善吸入时颗粒的夹带。吸入时，粉末会借助湍流和/或机械装置(例如筛网或颗粒团聚体撞击的旋转表面)碎裂成其组成颗粒，将小的单个治疗剂/粉末颗粒释放到空气中，以被吸入肺部。糖颗粒可能会留在装置中和/或口腔-咽部中。

抗体、其抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)或编码此类分子的核酸可以以冻干形式提供，并在施用前用无菌水再水化，尽管它们也可以以已知浓度的无菌溶液提供。然后，可将包括抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码此类分子的核酸的溶液加入含有0.9％氯化钠(USP)的输注袋中，通常按0.5至15mg/kg体重的剂量施用。自1997年利妥昔单抗获批以来，抗体药物已在美国上市，在抗体药物的施用领域已有相当丰富的经验。抗体、抗原结合片段、缀合物或编码此类分子的核酸可以通过缓慢输注施用，而不是静脉内推注或快速注射。在一个实例中，施用较高的负荷剂量，随后施用较低水平的维持剂量。例如，初始负荷剂量为4mg/kg，输注时间为约90分钟，如果前一剂量的耐受性良好，则随后每周维持剂量为2mg/kg，输注时间为30分钟，持续4-8周。

控释肠胃外制剂可制成植入剂、油性注射剂或微粒系统。有关蛋白质递送系统的广泛概述请参阅Banga，Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Lancaster，PA：Technomic Publishing Company，Inc.，1995。微粒系统包括微球、微颗粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有活性蛋白剂(例如细胞毒素或药物)作为中心核。在微球中，活性蛋白剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊一般分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径约为5μm，因此只能静脉内施用纳米颗粒。微粒的直径通常为约100μm，可皮下施用或肌肉内施用。参见，例如，Kreuter，Colloidal Drug Delivery Systems，J.Kreuter(Ed.)，New York，NY：Marcel Dekker，Inc.，pp.219-342，1994；和Tice and Tabibi，Treatise on ControlledDrug Delivery：Fundamentals，Optimization，Applications，A.Kydonieus(Ed.)，NewYork，NY.Marcel Dekker，Inc.，pp.315-339，1992。

聚合物可用于本文公开的组合物的离子控制释放。可使用任何合适的聚合物，例如设计用于控制药物递送的可降解或不可降解聚合物基质。备选地，羟基磷灰石被用作控制蛋白质释放的微载体。另一方面，脂质体可用于脂质封装药物的控释和药物靶向。

2.检测和诊断方法

还提供了在体外或体内检测肺炎链球菌的存在的方法。在一个实例中，肺炎链球菌的存在在受试者的生物样品中检测，并可用于鉴定受试者是否感染。样品可以是任何样品，包括但不限于来自活检的组织、尸体解剖和病理标本。生物样品还包括组织切片，例如用于组织学目的的冷冻切片。生物样品进一步包括体液，例如血液、血清、血浆、痰液、脊髓液或尿液。检测方法可包括在足以形成免疫复合物的条件下，使细胞或样品与特异性结合肺炎链球菌的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)或其缀合物(例如包括可检测标志物的缀合物)接触，并检测所述免疫复合物(例如通过检测与抗体或抗原结合片段缀合的可检测标志物)。

在一个实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体直接用可检测标志物标记。在另一个实施方案中，结合肺炎链球菌的抗体(或抗原结合片段或多特异性抗体)(第一抗体)是未标记的，使用第二抗体或其他可以结合第一抗体的分子进行检测。选择的第二抗体应能特异性结合第一抗体的特定种类和类别。例如，如果第一抗体是人类IgG，那么第二抗体可以是抗人类IgG。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，这两种蛋白都可以商购获得。抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或第二抗体的合适标签是已知的，并如上所述，包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。

在一些实施方案中，所公开的抗体、其抗原结合片段或多特异性抗体可用于检测疫苗。例如，检测包括PhtD或PspA或其片段的疫苗组合物是否产生包括所公开抗体的表位的构象。因此，本文提供了一种检测疫苗的方法，其中该方法包括在足以形成免疫复合物的条件下，使含有疫苗(例如PhtD或PspA免疫原)的样品与所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体接触，并检测免疫复合物，以检测样品中包括目的表位的疫苗。在一个实例中，检测样品中的免疫复合物表明疫苗组分(例如免疫原)具有能够结合抗体或抗原结合片段的构象。

实施例

分离特异性结合肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)或肺炎球菌表面蛋白A(PspA)这两种保守的保护性抗原的人类mAb(PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8和PspA16)。抗PhtD的mAb靶向跨越整个PhtD蛋白的不同表位，而抗PspA16的mAb靶向PspA的N末端区段。发现PhtD特异性mAb可与多种血清型结合，而PspA16的血清型范围有限。还检验了两种PhtD mAb(PhtD3和PhtD8)对预防肺炎球菌疾病的预防效力，这两种mAb分别靶向PhtD的N末端和C末端区域。虽然这两种mAb都能延长感染肺炎球菌血清型3的小鼠的存活时间，但PhtD3能提供更强大的保护。为了检验mAb PhtD3所诱导的保护作用的广度，在一项针对血清型4的预防性治疗研究中对mAb进行了测试，PhtD3延长了鼻内和静脉内感染模型中小鼠的存活时间。此外，在血清型3治疗模型中，在肺炎球菌感染24小时后施用时，PhtD3mAb具有保护作用。所有PhtD和PspA mAb都表现出了调理吞噬活性。这些结果为疾病预防和治疗提供了新的人类mAb，并确定了人类B细胞识别的PhtD和PspA上的表位，以用于治疗和疫苗开发。

实施例1

材料和方法

抽血和PBMC分离

通过静脉穿刺将90mL血液抽入9个肝素涂覆的管中，然后将10mL血液收集到血清分离管中。使用Ficoll-Histopaque密度梯度离心法从人类供体血液样品中分离出外周血单核细胞(PBMC)，并将PBMC冷冻在液氮蒸汽相中，直至进一步使用。

肺炎球菌蛋白克隆和表达

用下表2所列的引物从肺炎链球菌菌株TCH8431(血清型19A)的基因组中克隆PspA和PhtD全长蛋白和片段。全长PspA和PhtD被连接到pET28a载体中，而片段被连接到pMAL-c5x载体中。所有构建质粒的序列均通过测序确认，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达。挑取转化的大肠杆菌的单菌落，在5mL补充有抗生素(pET28a为50μg/ml卡那霉素，pMAL-c5x为100μg/ml氨苄青霉素)的LB培养基中培养，在37℃下在震荡培养箱中过夜。然后将过夜培养物以1∶100的比例在含抗生素的2x YT培养基中扩大，并在37℃下培养。当OD

与肺炎球菌蛋白结合的酶联免疫吸附测定

在重组蛋白捕获ELISA测定中，用PBS中的2μg/ml抗原处理384孔板1小时(37℃)或过夜(4℃)。之后，用水洗涤板一次，然后用PBS-T中的2％脱脂奶/2％山羊血清(封闭缓冲液)封闭1小时。用水洗涤板三次，然后施加PBS中的系列稀释的一级mAb 1小时。之后，用水洗涤板三次，然后施加25μL在封闭溶液中以1∶4,000稀释的二级抗体(山羊抗人IgG Fc；Meridian Life

产生肺炎球菌特异性杂交瘤

为了产生杂交瘤，将从人类供体血液中纯化的1000万个外周血单核细胞与先前冷冻和γ射线照射的800万个经修饰以表达人CD40L、人白细胞介素-21(IL-21)和人BAFF(69)的NIH 3T3细胞在80mL StemCell

人类mAb表达与纯化

对于杂交瘤衍生的mAb，杂交瘤细胞系在StemCell

人类mAb的同种型测定

为了测定mAb的同种型，在96孔

RT-PCR检测杂交瘤mAb可变γ链和可变轻链

根据生产商的方案，使用

生物层干涉测量的实验设置

对于所有生物传感器，在运行缓冲液(PBS、0.5％牛血清白蛋白[BSA]、0.05％吐温20、0.04％硫柳汞)中获得初始基线。为绘制表位，将100μg/mL的His标记的PhtD蛋白固定在抗五组氨酸生物传感器吸头

细菌菌株和生长条件

肺炎球菌菌株在37℃、5％CO

Western印迹

将肺炎球菌菌株与非还原性上样缓冲液(Laemmli SDS样品缓冲液，非还原性6X)混合，并在4-12％Bis-Tris凝胶

固定的肺炎球菌的酶联免疫吸附测定

在384孔板的每个孔中加入15μL(约10

通过流式细胞术检测抗体与细菌的结合

通过流式细胞术测定mAb与暴露在肺炎链球菌表面的抗原结合的能力。细菌用10μM CFSE

确定PhtD3的效力

致死性肺炎挑战研究使用5-7周龄的CBA/CaHN-Btkxid/J(CBA/N)小鼠(TheJackson

调理吞噬杀伤测定

如前所述，进行了调理吞噬杀伤测定，该测定改编自早先的方案并进行了修改(Burton and Nahm(2012)Clin Vaccine Immunol 2012/04/18.19：835-841)。将TIGR4储存液与指定抗体(每孔10μg抗体，每孔最终体积100μL)在调理缓冲液B(OBB：含Ca

基于流动的调理吞噬测定

按照生产商的方案，用PHrodo

实施例2

肺炎球菌蛋白特异性入类mAb的分离与表征

为了鉴定PhtD和PspA特异性人类mAb，在大肠杆菌中重组表达来自菌株TCH8431(血清型19A)的His标记的PhtD和PspA(图1)，并利用这些蛋白筛选来自人类供体外周血单核细胞(PBMC)的受刺激B细胞，如前所述(Bar-Peled et al.(2019)J Virol 93：e00342-19)。将健康人类受试者的PBMC涂布在表达人CD40L、人IL-21和人BAFF的饲养层上六天，以刺激B细胞生长和抗体分泌。通过酶联免疫吸附测定针对重组PhtD和PspA来筛选受刺激B细胞的细胞上清液。如图2中的实例所示，受试者之间对重组蛋白的反应各不相同。从五个受试者的PBMC中融合出几个反应孔，用于产生人杂交瘤和随后的人类mAb分离。成功产生了四个分别来自独特供体的杂交瘤系，通过单细胞分选对PhtD进行生物克隆，并从独立的受试者产生一个PspA的mAb。通过ELISA测定，针对每种PhtD的mAb都有相似的结合EC

mAb PhtD3和PhtD6使用κ轻链，而mAb PhtD7和PhtD8使用λ轻链。根据通过ELISA测定的分型数据，所有mAb均为IgG

为了确定人类mAb靶向的PhtD的特定区域，根据二级结构预测器生成了PhtD的截短片段。这些片段与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合以确保溶解性，并在大肠杆菌中表达并使用直链淀粉树脂纯化。除MBP融合蛋白中的游离MBP蛋白外，大多数片段的纯度都大于90％(图4)。为了确定分离出的mAb靶向的PhtD的特定区域，我们测量了mAb与PhtD片段的ELISA结合。由于以前没有针对这些蛋白生成过具有确定表位的mAb，因此生成的片段可提供mAb表位的粗略估计。四种mAb中的每一种都与PhtD蛋白上的独特区域结合(图5)。mAb PhtD3和PhtD6结合蛋白质的N末端部分，而mAb PhtD8结合C末端部分。mAb PhtD7似乎靶向依赖于氨基酸341-838的独特构象表位，但这种mAb并不结合341-647或645-838片段。通过竞争性生物层干涉测量法评估了mAb的表位，以比较mAb之间的结合表位(图6)。用His标记的PhtD蛋白装载抗五组氨酸生物传感器，并且mAb依次竞争结合(图6)。mAb结合不同的区域，竞争有限，类似于片段ELISA数据的结果。mAb PhtD3和PhtD6显示出中等竞争，这些mAb的表位在我们的片段ELISA数据中也有重叠。为了绘制mAb PspAl6的结合区，根据先前确定的结构域将PspA片段化为几个截短片段(图7)(Khan N，Jan AT.(2017)Front Microbiol 8：742)。mAbPspA16对重组PspA具有高亲和力，根据与氨基酸片段1-438和1-512的阳性结合以及与247-512、436-725和247-725片段的阴性结合，与N末端片段1-247结合(图8)。

肺炎球菌表面蛋白PhtD和PspA在不同血清型中是保守的，而且在大多数血清型中广泛存在。因此，针对这些抗原的人类mAb具有治疗多种血清型的肺炎球菌感染的潜力。为了确定分离出的mAb的血清型广度，评估了mAb与两种不同肺炎球菌血清型的结合，一种是菌株TCH8431(血清型19A)，从其克隆并表达了重组PhtD和PspA蛋白的基因；另一种是常用的实验室菌株TIGR4(血清型4)。PspA在TCH8431和TIGR4之间有88％的氨基酸序列同一性，尽管N末端结构域存在显著差异，氨基酸1-247的同一性为70％。相比之下，PhtD在这两个菌株之间有98％的氨基酸序列同一性。通过用mAb PhtD3和PspA16对来自TIGR4和TCH8431的细菌裂解物进行探针探查来进行Western印迹。mAb PspA16只标记菌株TCH8431(血清型19A)的PspA蛋白(图9)，而mAb PhtD3能标记两种肺炎球菌菌株的PhtD蛋白。然而，由于细菌裂解可能会导致蛋白质变性，因此mAb PspA16的表位可能会在变性过程中发生改变。接下来测定的是针对每种重组蛋白分离的mAb是否与整个细菌结合。通过用固定细菌包被板并通过ELISA测量mAb结合来进行ELISA测定。mAb PhtD 3、PhtD6、PhtD7和PhtD8对多种无关的肺炎球菌血清型具有广泛的反应性，并且与PhtD8相比，mAb PhtD3、PhtD6和PhtD7对固定细菌具有更高的亲和力(图10)。相比之下，PspA16只与菌株TCH8431结合，与Western印迹实验的结果相似。由于PspA16与PspA最易变的区域结合，因此与不同血清型的结合减少是意料之中的。在第三项实验中，通过流式细胞术评估了mAb与一组肺炎球菌血清型的结合。使用来自21天前接种过

实施例3

mAB治疗可保护小鼠免受肺炎球菌感染

进一步分析了mAb PhtD3、PhtD8、PspA16和PhtD7在肺炎球菌感染小鼠模型中的保护效力。

由于mAb PhtD3和PhtD8在通过流式细胞术进行的血清型结合分析中表现出最高的整体广度，因此进一步分析了这些mAb在小鼠模型中的保护效力。此外，选择这些mAb以确定mAb对PhtD的表位特异性是否会影响保护效力，因为它们靶向不重叠的表位。在肺炎球菌感染的小鼠模型中，针对PhtD的小鼠mAb和来自健康人类受试者和接种有PhtD疫苗的人的多克隆人类抗体已被证明对定植或疾病有保护作用。然而，还没有对人类mAb的保护效力进行过研究。

为了确定PhtD特异性mAb是否对感染有保护作用，在使用血清型3菌株(WU2)的肺炎球菌肺炎小鼠模型中检测了mAb PhtD3和PhtD8的效力，因为血清型3是侵袭性肺炎球菌疾病的主要病因。由于mAb是从人类杂交瘤中分离出来的，因此具有真实的人类Fc区，Fc区被同种型转换为最接近的小鼠同源物(人类IgG

PhtD3-IgG

由于上述数据表明针对肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)的mAb具有保护作用，因此对针对PhtD不同区域的mAb PhtD7进行了评估，以确定它是否也具有保护作用。两组小鼠(n＝10/组)经鼻内感染5x10

此外，针对肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的mAb PspA16也被确定在鼠血清型3鼻内感染模型中具有显著的保护作用。三组C57BL/6小鼠(n＝10/组)经鼻内感染5x10

实施例4

感染后用mAB PhtD3和PhtD7联合治疗可提高存活率

由于上述数据表明mAB PhtD3和PhtD7都有保护作用，因此要确定这两种mAB的组合在感染后施用与感染前施用相比是否有保护作用。两组小鼠(n＝20/组)经鼻内感染5x10

鼻内感染后24小时腹膜内递送这两种mAb的组合具有显著作用，与同种型对照相比，存活率提高了75％(图13C)。

实施例5

PhtD特异性人类mAb具有调理吞噬活性

目前肺炎球菌疫苗的相关保护作用是基于激发抗荚膜抗体，这种抗体能调理细菌，导致宿主免疫细胞对它们的吞噬细菌并随后的细菌杀死(Romero-Steiner et al.(2006)Clin Vaccine Immunol 13：165-169；Paschall et al.(2019)JoVE e59400)。通过接种PhtD分离出的小鼠mAb先前已被证明能诱导细菌调理吞噬，而这种调理吞噬依赖于补体和巨噬细胞(Visan et al.(2018)Hum Vaccin Immunother 14：489-494)。为了确定PhtD3和其他PhtD mAb的潜在保护机制，利用使用HL-60细胞系建立的调理吞噬杀伤测定(OPKA)。针对血清型4(菌株TIGR4)、血清型3(菌株WU2)和血清型19A(菌株TCH8431)检测mAb，从其克隆PhtD和PspA构建体。这些mAb还与从采血前21天接种有

实施例6

mAb PhtD3治疗降低了肺部和血液细菌滴度

下面描述了mAb PhtD3-IgG

两组小鼠(n＝10/组)经鼻内感染5x10

与同种型对照相比，肺部滴度降低了约4个对数值，有些经治疗的动物的滴度低于检测限。血液滴度显示了类似的结果，与同种型对照相比降低了约2.4个对数值，经PhtD3治疗的动物血液中均未出现可检测到的细菌水平(见图15)。

实施例7

mAb PhtD3在流感合并感染模型中具有保护作用

下面描述了mAb PhtD3-IgG

三组小鼠(n＝20/组)经鼻内感染100FFU的甲型流感病毒CA04/09(IAV)。流感感染后七天，小鼠经鼻内感染1x10

监测小鼠的存活率随时间的变化，并以百分比表示(图16)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对PhtD3与同种型对照组的存活曲线进行统计学比较，显示p值小于0.0001。与对照相比，接受PhtD3治疗的小鼠存活率提高了20％，并且与对照相比，到达死亡的时间明显延长。

鉴于所公开的本发明的原理可以应用于许多可能的实施方案，应该认识到，所阐述的的实施方案只是本发明的优选实施例，不应被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们将这些权利要求的范围和精神内的内容视为我们的发明。

序列表

<110>佐治亚大学研究基金会有限公司

<120>针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体

<130>8618-105628-02

<150>US 63/147,393

<151>2021-02-09

<160>64

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>125

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD3 VH

<400>1

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ala Ala Phe Glu Ser Phe

202530

Ala Phe Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Met

354045

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Ala Glu Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Met Thr Met Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ala Thr Ala Tyr

65707580

Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

859095

Ala Arg Asp Gly His Ile Met Arg Thr Thr Leu Ser Asp Ala Ala Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Thr Asp Asn

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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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Pro Glu Asp Phe Ala Met Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Pro

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<223>PhtD8 VH

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1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Val Thr Asn Tyr Thr Gln Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Lys Asp Thr Ser Val Thr Ser Val Tyr

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Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

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<212>PRT

<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 HCDR3

<400>12

Ala Arg Gly Gly Thr Leu Asp His

1 5

<210>13

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 VL

<400>13

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Thr Tyr Asp

202530

Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Gly Lys Gly Pro Arg His Leu Met

354045

Arg Leu Asn Gly Asp Gly Ser His Thr Asn Gly Asp Gly Ile Pro Asp

505560

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser

65707580

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Thr Trp Val

859095

Thr Asn Ile His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 LCDR1

<400>14

Ser Gly His Ser Thr Tyr Asp

1 5

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 LCDR2

<400>15

Leu Asn Gly Asp Gly Ser His

1 5

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 LCDR3

<400>16

His Thr Trp Val Thr Asn Ile His Leu Val

1 5 10

<210>17

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 VH

<400>17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

202530

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Trp Met Asn Ala Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65707580

Met Asp Leu Ile Asp Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Gly Pro Tyr Trp Val Glu Asn Trp Phe Asp Thr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

115 120

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 HCDR1

<400>18

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp

1 5

<210>19

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 HCDR2

<400>19

Met Asn Ala Asn Ser Gly Asn Thr

1 5

<210>20

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 HCDR3

<400>20

Ala Arg Gly Pro Tyr Trp Val Glu Asn Trp Phe Asp Thr

1 5 10

<210>21

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 VL

<400>21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Ser Ile Arg Ser Phe

202530

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Asn Leu Leu Ile

354045

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Gln Lys

859095

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210>22

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 LCDR1

<400>22

Arg Ser Ile Arg Ser Phe

1 5

<210>23

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 LCDR2

<400>23

Lys Ala Ser

1

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 LCDR3

<400>24

Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Gln Lys Thr

1 5

<210>25

<211>127

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 VH

<400>25

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Ile Phe Ser Asp Ser

202530

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met

354045

Gly Trp Val Ser Pro Asn Thr Gly Ala Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65707580

Leu Glu Leu Thr Arg Leu Ala Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Val Leu Arg Gly Ser Tyr Asp Phe Arg Gly Asn Tyr Pro His

100 105 110

Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210>26

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 HCDR1

<400>26

Gly Asp Ile Phe Ser Asp Ser Tyr

1 5

<210>27

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 HCDR2

<400>27

Val Ser Pro Asn Thr Gly Ala Thr

1 5

<210>28

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 HCDR3

<400>28

Ala Arg Val Leu Arg Gly Ser Tyr Asp Phe Arg Gly Asn Tyr Pro His

1 5 1015

Asp Phe Asp Tyr

20

<210>29

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 VL

<400>29

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Arg Gly His Asn Asn Tyr Pro

202530

Ile Ala Trp Leu Gln Lys Gln Thr Asp Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met

354045

Arg Leu Asn Ser Asp Gly Ser His His Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp

505560

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Ser Ile Ser

65707580

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp

859095

Thr Gly Leu Gln Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Phe Val Leu

100 105 110

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 LCDR1

<400>30

Arg Gly His Asn Asn Tyr Pro

1 5

<210>31

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 LCDR2

<400>31

Leu Asn Ser Asp Gly Ser His

1 5

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 LCDR3

<400>32

Gln Thr Trp Asp Thr Gly Leu Gln Gly Val

1 5 10

<210>33

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 VH

<400>33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

202530

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Trp Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ala Leu Gly Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

859095

Ala Arg Ala Trp Ala Pro Gly Ala Glu Tyr Leu His His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>34

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 HCDR1

<400>34

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr

1 5

<210>35

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 HCDR2

<400>35

Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr

1 5

<210>36

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 HCDR3

<400>36

Ala Arg Ala Trp Ala Pro Gly Ala Glu Tyr Leu His His

1 5 10

<210>37

<211>108

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 VL

<400>37

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

202530

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

354045

Ile Phe Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser

505560

Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65707580

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp His Ser Pro

859095

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys

100 105

<210>38

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 LCDR1

<400>38

Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr

1 5

<210>39

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 LCDR2

<400>39

Gly Ala Ser

1

<210>40

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 LCDR3

<400>40

Gln Gln His Asp His Ser Pro Phe Thr

1 5

<210>41

<211>376

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD3 VH

<400>41

caggtgcagc tagtgcagtc tgggcctgac gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc60

tcctgcaagg cctctggagc cgccttcgag agttttgcct tcgcctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggtttgagtg gatgggaagg atcattccaa tcttggaaac aagggactac 180

gcagagaagt tccagggcag aatgacgatg accacagacg agtcgacggc gacagcctac 240

atggaactga acagcctaag atttgaagac acggccgttt atttctgtgc gcgagatggg 300

cacattatga ggacaactct ctcggatgct gcacttgatg tctggggcca agggacaacg 360

gtcattgtct cctcag 376

<210>42

<211>325

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD3 VL

<400>42

gacatcgtga tgacccagtc tccagtcacc ctgtctttgt ctccagggga gagagccacc60

ctctcctgca gggccagtca gagtcttact gacaactact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctac gccgcatcca ccagggccac tggcatccca 180

gacaggatca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagagtggag 240

cctgaagatt ttgcaatgtt ttactgtcaa cagtatcaga actcaccgtt caccttcggc 300

ggggggacca cggtggagat caaac 325

<210>43

<211>346

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 VH

<400>43

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc60

tcctgtaagg cttctggata caccttcacc gactacttta tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacacg gtcttgaatg gatggggtgg atcaacccta accgcggtgt cacaaactat 180

acacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accaaggaca cgtccgtcac ctcagtctac 240

atggagctga gcaggctgac atctgacgac acggccctat attattgtgc gagaggtggt 300

acgcttgacc actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctctg346

<210>44

<211>337

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD8 VL

<400>44

cagcttgtgc tgactcaatc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaccctc60

acctgcactc tgagcagtgg gcacagcacc tacgacatcg catggcatca gcagcagcca 120

ggaaagggcc ctcgacactt gatgagactt aacggtgatg gcagtcacac caacggggac 180

gggatccctg atcgcttctc aggctccagc tctggggctg agcgctacct caccatctcc 240

agcctccagt ctgaagatga ggctgactat tactgtcaca cctgggtcac taacattcat 300

ttggtgttcg gcggagggac caaactgacc gtcctag337

<210>45

<211>361

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 VH

<400>45

caggtgcagt tggtgcagtc tgggactgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc60

gcctgcaagg cttctggata caccttcact agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacgcga acagtggcaa cacaggctat 180

gcacaaaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccattac cacagcctac 240

atggacctga ttgatctgac atctgaggac acggccatat attactgtgc gagagggccg 300

tactgggtgg agaattggtt cgacacctgg ggccagggaa ccctggtcag cgtctcctca 360

g 361

<210>46

<211>322

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD6 VL

<400>46

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtcggaga cagagtcacc60

atcacttgcc gggcaagtcg gagcattcgc agctttttaa attggtatca acaaaaacca 120

gggaaacccc ctaacctcct gatctataaa gcatccactt tgcacagtgg ggtcccgtct 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcaacaa tctacaaccc 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta atcagaagac cttcggccaa 300

gggaccaagg tggacatcaa ac322

<210>47

<211>382

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 VH

<400>47

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc60

tcctgcaagg cttctggaga catcttcagc gactcctata ttcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcctgagtg gatgggatgg gtcagcccta acactggtgc cacacattat 180

gcacagaagt tgcagggcag agtcaccatg accagcgaca cgtccatcag tacagcctat 240

ttggagctga ccaggctggc atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagtctta 300

aggggaagtt atgatttccg gggtaattat ccacatgatt ttgactactg gggccaggga 360

accctggtca ccgtctcctc ag382

<210>48

<211>337

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD7 VL

<400>48

cagcttgtgc tgactcaacc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaccctc60

acctgcactc tgagcagagg acacaacaac taccccatcg cttggctcca aaagcagaca 120

gataagggcc ctcgttatgt gatgagactt aatagtgatg gcagccacca caagggggac 180

ggaatccctg atcgcttctc aggctccagt tctggggctg agcgctacct cagcatttcc 240

agtctccagc ctgaagatga ggctgaatac tactgtcaga cgtgggacac tggccttcag 300

ggggtgttcg gcggagggac caaactgttc gtcctag337

<210>49

<211>361

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 VH

<400>49

caggtgcagc tggtgcagtc tgggcctgac gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc60

tcctgtaaga cttctggata caccttcact ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gtcaacccta acaccggtgg cacaagttat 180

gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccgtg accagggaca cgtccatcag cacagtctac 240

atggaactga gcgctctagg atctgacgac acggccatat atttctgtgc gagggcgtgg 300

gctccgggcg ctgagtacct ccaccactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360

g 361

<210>50

<211>325

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA16 VL

<400>50

gagattgtga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aacagccacc60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatcttt ggtgcgtcca acagggccac tggcatccca 180

gtcaggttca gtgccagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt tcgcagtgta ttactgtcag cagcatgatc actcaccatt cactttcggc 300

cctgggacca aagtggatct caaac 325

<210>51

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA1-F引物

<400>51

cgccatatga tggctaataa gaaaaaaatg atttt 35

<210>52

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA247-F引物

<400>52

cgccatatgg agctaaacgc taaacaa27

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA436-F引物

<400>53

cgccatatgg atgaagaaga aactccagcg 30

<210>54

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA438-R引物

<400>54

tagcggccgt taatggtgat ggtgatggtg ttcttcatct ccatcagggc 50

<210>55

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA512-R引物

<400>55

tagcggccgt taatggtgat ggtgatggtg ttttggagtg gctggttttt c 51

<210>56

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PspA725-R引物

<400>56

tagcggccgt taatggtgat ggtgatggtg aacccattca ccattggcat 50

<210>57

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD1-F引物

<400>57

catgccatgg ccatgaaaat caataaaaaa tatctagcag g41

<210>58

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD168-F引物

<400>58

catgccatgg ccgcagataa tgctgttgct g 31

<210>59

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD341-F引物

<400>59

catgccatgg cctatcgttc aaaccattgg gt32

<210>60

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD645-F引物

<400>60

catgccatgg ccgaccatta ccataacatc aaatttg 37

<210>61

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD170-R

<400>61

cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg attatctgct cttgagttat gattatg 57

<210>62

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD343-R引物

<400>62

cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg tgaacgataa cgaaggggaa t 51

<210>63

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD647-R引物

<400>63

cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg gtaatggtca taatgaggta tgattaaa58

<210>64

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PhtD838-R引物

<400>64

cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg ctgtatagga gccggttga49