用于非小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于非小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。更具体地，本发明涉及一种用于非小细胞肺癌的诊断和预后判断的生物标志物，所述生物标志物是ECHS1和/或XYLB。本发明人已发现，ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌患者中的表达水平明显高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，ECHS1和/或XYLB的高水平表达在用于诊断非小细胞肺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与非小细胞肺癌患者的预后相关，因此可以作为用于非小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于非小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。

背景技术

肺癌是导致癌症相关死亡的首要病因。近年来，尽管肺癌治疗技术得到了显著的提高，但患者5年总体生存率仍然无法令人满意，仅为20％左右。肺癌根据组织病理学类型，主要分为小细胞肺癌(15％)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC，85％)，其中最常见的两种NSCLC为肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)与肺鳞状细胞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUSC)。大多数肺癌患者在确诊时已经处于中晚期阶段，这为肺癌的治疗带来了极大的挑战。目前已发现可潜在用于早期肺癌诊断和预后判断的几种生物标志物，包括TTF1，其表达于甲状腺滤泡上皮和肺泡上皮细胞的细胞核中，与肿瘤的分化程度呈正相关，分化越差则越可能表达缺失；TTF1是临床上区分肺癌亚型的最佳标志物之一。然而此生物标志物在非小细胞肺癌诊断和预后判断中的应用仍需更深入研究。

因此，发现新的诊断标志物，并明确其在非小细胞肺癌增殖与转移进程中的作用及预后评估中的价值，对于推动非小细胞肺癌临床诊疗策略的发展具有重要意义。

循环肿瘤细胞是从原发肿瘤或者转移肿瘤上脱落下来、释放进入血液循环中的一群肿瘤细胞亚群。近些年的研究发现，一方面，循环肿瘤细胞在肿瘤发生的很早期就可能出现在患者的外周血中，这为癌症的早期诊断提供了帮助。另一方面，这些循环肿瘤细胞还可以用来预测癌症患者的预后，循环肿瘤细胞的发现往往预示着肿瘤的复发或转移，这也提示患者的预后不良。如何使用循环肿瘤细胞来对癌症尤其是特定癌症例如非小细胞肺癌进行诊断或者预后，这也是我们未来在循环肿瘤细胞系列探索中的一个重要方向。使用循环肿瘤细胞进行诊断或预后的一大好处是其可以有效替代肿瘤活检，对于那些无法进行病理组织活检的患者，这是一个很好的替代指标，它可以帮助临床医生实时地对癌症的生物学特征进行动态监测和判断。然而，由于循环肿瘤细胞数量稀少，利用其作为诊断癌症尤其是特定癌症例如非小细胞肺癌的手段存在挑战，并非所有的癌症相关标志物都可以在循环肿瘤细胞中被检测到。因此，寻找适用于借助循环肿瘤细胞进行诊断的生物标志物也具有重要的临床价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人已发现，ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌患者中的表达水平明显高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，ECHS1和/或XYLB的高水平表达在用于诊断非小细胞肺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与非小细胞肺癌患者的预后相关，因此可以作为用于非小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物。

如本文所用，ECHS1是烯酰辅酶A水合酶短链1（enoyl-CoA hydratase, shortchain 1，ECHS1）的简称，其NCBI Gene ID为1892。

如本文所用，XYLB是木酮糖激酶（xylulokinase，XYLB）的简称，其NCBI Gene ID为9942。

具体地，本发明提供了一种用于非小细胞肺癌诊断的生物标志物，其中所述生物标志物是ECHS1和/或XYLB。

在其他方面，本发明还提供了一种用于非小细胞肺癌预后判断的生物标志物，其中所述生物标志物是ECHS1和/或XYLB。

在其他方面，本发明还提供了一种用于非小细胞肺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测ECHS1和/或XYLB表达的试剂。

在其他方面，本发明还提供了一种用于非小细胞肺癌预后判断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测ECHS1和/或XYLB表达的试剂。

在其他方面，本发明还提供了检测ECHS1和/或XYLB表达的试剂在制备用于非小细胞肺癌的诊断的工具中的用途。

在其他方面，本发明还提供了检测ECHS1和/或XYLB表达的试剂在制备用于非小细胞肺癌的预后判断的工具中的用途。

进一步地，所述非小细胞肺癌的诊断包括以下步骤：

（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；

（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中ECHS1和/或XYLB的表达水平；

如果待测受试者的样本中ECHS1的表达水平与对照样本中ECHS1的表达水平相比升高，和/或待测受试者的样本中XYLB的表达水平与对照样本中XYLB的表达水平相比升高，则诊断所述待测受试者患有非小细胞肺癌或处于患有非小细胞肺癌的风险中。

进一步地，所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织。

进一步地，所述非小细胞肺癌的预后判断包括以下步骤：

（1）收集预后非小细胞肺癌患者的样本为待测组，并以预前非小细胞肺癌患者的样本为对照组；

（2）检测并比较待测组和对照组的样本中ECHS1和/或XYLB的表达水平；

如果待测组样本中ECHS1的表达水平与对照组样本中ECHS1的表达水平相比降低，和/或待测组样本中XYLB的表达水平与对照组样本中XYLB的表达水平相比降低，则判断待测组的预后良好。

如本文所用，所述受试者包括哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。

如本文所用，所述待测受试者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或外泌体中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本包括待测受试者的肺组织，例如肺活检样本，所述对照样本来源于健康受试者的肺组织，例如肺活检样本，或待测受试者的健康组织，例如癌旁组织。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本为循环肿瘤细胞。

如本文所用，所述预后和预前非小细胞肺癌患者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述预后和预前非小细胞肺癌患者的样本包括待测受试者的肺组织，例如肺活检样本。在优选的实施方案中，所述预后和预前非小细胞肺癌患者的样本为循环肿瘤细胞。

如本文所用，检测待测受试者的样本中ECHS1和/或XYLB的表达的试剂没有特别限制，并且是本领域技术人员熟知且容易获得的用于检测受试者样本中ECHS1和/或XYLB在mRNA或蛋白质水平上的表达的试剂。例如，用于检测受试者样本中ECHS1和/或XYLB的表达的试剂可以包括用于实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫的相应试剂。

本发明的有益效果

本发明人已发现，ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌患者中的表达水平明显高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，ECHS1和/或XYLB的高水平表达，尤其是这两者在联合使用时，在用于诊断非小细胞肺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与非小细胞肺癌患者的预后相关，因此可以作为用于非小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物。此外，本发明还发现可以通过收获受试者的循环肿瘤细胞并检测其中ECHS1和XYLB的表达水平来对非小细胞肺癌进行诊断和预后判断。

附图说明

图1显示了ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的表达水平。

图2显示了ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞中的表达水平。

图3显示了ECHS1和XYLB在人非小细胞肺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞Beas-2b中的表达水平。

图4显示了在干扰ECHS1和/或XYLB表达后，人非小细胞肺癌细胞A549的迁移能力和侵袭能力的变化。

图5显示了ECHS1和XYLB单独和联合地在非小细胞肺癌患者与健康人群中的ROC曲线分析。

图6显示了ECHS1和XYLB单独和联合地在非小细胞肺癌患者与健康人群中的Kaplan-Meier生存曲线分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：人非小细胞肺癌与配对正常组织的表达谱芯片分析

肿瘤基因组图谱(TCGA)计划由美国National Cancer Institute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目，利用大规模测序为主的基因组分析技术，针对36种癌症进行大规模实验，TCGA基因组分析中心(GCC)比对肿瘤和正常组织，寻找与各癌症或者亚型相关的基因突变、扩增或者缺失。为理解癌症的分子机制，提高人们对癌症发病分子基础的科学认识提供帮助。

TCGA标准方法下载117对非小细胞肺癌组织和正常组织的全基因表达谱数据及临床信息，统计分析采用R语言(3.1.1版本)软件，需安装及加载的程序包(heatmap，venndiagram，hist等)，然后用DESeq和edgeR程序包进行分析，找出差异表达的基因。判断标准：(1)癌/癌旁的表达量<-2，(2)P<0.05，(3)在非小细胞肺癌中未被报道。最终筛选到在非小细胞肺癌中显著高表达的两种基因，即ECHS1和XYLB。

实施例2：ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌中高表达

收集临床80例非小细胞肺癌组织样本和48例癌旁正常组织样本，分别使用TRIzol法提取上述非小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本的RNA，利用RT-qPCR方法分别检测ECHS1和XYLB的mRNA水平。结果如图1所述，其证实ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌中高表达。

实施例3：非小细胞肺癌患者的循环肿瘤细胞中ECHS1和XYLB表达水平的检测

1）抽取非小细胞肺癌患者静脉血10mL于ACD抗凝管中，常规离心分离血浆备用；

2）对血浆中CTC细胞进行富集及分离，具体步骤为：通过向血浆中加入样本密度分离液（Cytelligen）提取血浆中单细胞层，之后加入免疫细胞去除磁珠对所提取单细胞层中的CD45

3）离心收获富集的CTC细胞，加入1ml的RNA裂解液吸至无酶EP管中；向EP管中加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温静止3min，反复3次；12000×g、4℃离心15min；将上层水相加入新的无酶的EP管，在EP管中加入等体积异丙醇，颠倒、混匀，静置10min；12000×g、4℃离心15min；弃掉EP管液体，加入75％的乙醇1ml，震荡EP管；12000×g、4℃离心5min；弃净上清后室温放置干燥；加入适量DEPC水溶解RNA；检测RNA的纯度和浓度并通过RT-qPCR检测CTC细胞中ECHS1和XYLB的表达，并将其与收获自正常肺组织的细胞中ECHS1和XYLB的表达进行比较，结果如图2所述，其证实ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌患者CTC细胞中高表达。

实施例4：ECHS1和XYLB影响非小细胞肺癌细胞的侵袭及迁移

将人非小细胞肺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞Beas-2b用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100U·mL

将培养的细胞消化收集后如实施例3所述提取RNA并通过RT-qPCR检测正常细胞及癌细胞中ECHS1和XYLB的表达。结果如图3所示，其显示ECHS1和XYLB在人非小细胞肺癌细胞A549中的表达显著高于在人正常肺上皮细胞Beas-2b中的表达。

通过siRNA干扰ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌细胞中的表达(siRNA序列：siNC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUCAUACTT-3’(SEQ ID No.1)；siECHS1：5’-GCAGCUGGAGCUGAUAUCAAGGAAATT-3’(SEQ ID No.2); siXYLB：5’-CAGCGCCGCUGGGUUGGAGUCUCCATT-3’(SEQ ID No.3))(干扰结果如图3所示)，然后进行Transwell细胞迁移及侵袭实验验证。细胞迁移实验结果如图4的A部分和B部分所示，侵袭实验结果如图4的C部分所示，其显示在单独和联合干扰ECHS1和XYLB基因的表达后，人非小细胞肺癌细胞A549的迁移能力和侵袭能力显著下降，其中联合干扰后的下降更为显著。

实施例5：ECHS1和XYLB的非小细胞肺癌诊断价值

利用实施例2测定的ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平通过受试者工作曲线(ROC)对ECHS1和XYLB的独立诊断及联合诊断实验结果进行分析。结果如图5所示，其显示ECHS1（灵敏度41.25％，特异性68.75％）和XYLB（灵敏度47.5％，特异性79.17％）mRNA表达对非小细胞肺癌具有比较一般的诊断效果，但联合诊断效果良好，ROC曲线下面积AUC(area under the ROC curve)＝0.7508，灵敏度可达62.50％，特异性可达79.17％。从此结果可知，单独的ECHS1和XYLB具有一定的诊断效用，但诊断特异性和灵敏度仍不足，而两者联合使用时可以实现良好的灵敏度和特异性。因此，ECHS1和XYLB可以用于单独和联合诊断非小细胞肺癌。

实施例6：ECHS1和XYLB与非小细胞肺癌临床预后的关系

利用实施例2测定的ECHS1和XYLB在非小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平，统计分析ECHS1和XYLB与非小细胞肺癌患者的整体生存率的关系。结果如图6所示，可以看出，ECHS1低表达(ECHS1Low+XYLB High)或XYLB低表达(ECHS1 High+XYLBLow)的非小细胞肺癌患者组的五年总体生存率高于ECHS1和XYLB高表达(ECHS1 High+XYLBHigh)的非小细胞肺癌患者组，并且ECHS1低表达且同时XYLB低表达(ECHS1 Low+XYLBLow)的非小细胞肺癌患者组的五年总体生存率最高。这说明：ECHS1和/或XYLB高表达会导致非小细胞肺癌患者的不良预后。

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。