治疗脊髓损伤或相关神经组织损伤的方法

摘要

描述了选择性地抑制两种基质金属蛋白酶MMP‑9和MMP‑12的单一化合物或化合物的组合在治疗脊髓损伤(SCI)、SCI的继发性效应和相关神经组织损伤，特别是抑制SCI诱导的水肿、治疗神经性疼痛、预防SCI后的功能下降中的用途；和施用方法。

说明书

技术领域

本发明涉及某些抑制基质金属蛋白酶并可用于治疗脊髓损伤(SCI)，特别是与SCI相关的继发性效应，和相关神经组织损伤的化合物。

背景技术

SCI是一种破坏性病状，其会导致严重的残疾和死亡。在全球范围内，SCI发病率在每百万15至40例的范围内，美国和英国每年分别有超过12,000和1,000例新病例。创伤性SCI最常见的原因是机动车事故、跌倒、运动相关损伤和人际间暴力。SCI的临床结果取决于病变的严重程度和位置，并且可能包括损伤水平以下的感觉和/或运动功能部分或完全丧失。目前SCI的治疗，诸如Lyrica(普瑞巴林)，仅能缓解患者的症状，并没有解决导致神经性疼痛(NP)、炎症、感觉/运动功能丧失或血-脊髓屏障(BSCB)分解的潜在机制。SCI的完全恢复性治疗将涉及保护神经元和神经胶质细胞免受进一步损伤、中和抑制分子、抑制神经胶质瘢痕、替换丧失的神经元、轴突再生和适当的突触形成。

然而，SCI领域缺乏FDA或EMEA特别批准的神经保护和神经再生治疗。甲泼尼龙(Medrol)继续用于未标识用途，因为此药物的有效性不确定，而且产生有益作用所需的高剂量会引起严重的有害副作用。几种有前途的SCI治疗目前正在进行临床试验，但大多数都处于早期研究，并且目前，Lyrica是唯一一种FDA批准的用于控制SCI诱导的神经痛和NP的药物。

脊髓损伤(SCI)后最初的机械创伤导致血-脊髓屏障(BSCB)破坏、水肿、神经元死亡、轴突损伤和脱髓鞘，随后是一连串继发性事件，这些事件扩大了初始损伤中心周围的炎症反应。

基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性内肽酶，其靶向细胞外基质(ECM)蛋白、趋化因子、细胞因子和细胞表面受体。迄今为止，已在人类中鉴定出23种MMP，其中MMP-2、MMP-9和MMP-12与SCI有关，并且在SCI后立即显著增加，表达程度与损伤的严重程度成正比。过度的MMP活性导致BSCB的破坏、水肿、兴奋性毒性、线粒体凋亡、炎症、星形胶质细胞增生、NP和功能丧失。因此，阻断SCI后过度的MMP活性是一种有用的策略，其将防止脊髓中的轴突束进一步受损，因为水肿与临床神经功能缺陷相关。

MMP-9表达在SCI后一天内达到峰值，并在损伤后24小时在SCI的神经胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血管成分中检测到。SCI的急性期中MMP-9的过度活性导致BSCB破坏、水肿、兴奋性毒性、白细胞流入、线粒体功能障碍、细胞凋亡、神经元脱髓鞘、炎症反应增加和星形胶质细胞增生。此外，在大鼠坐骨神经结扎模型中，MMP-9过表达通过切割促炎细胞因子、白细胞介素-1(IL-1)和小胶质细胞激活来调节早期神经性疼痛。

MMP-12是弹性蛋白溶解性(elastinolytic)蛋白酶，其主要由巨噬细胞表达，并且在压迫SCI模型中增加189倍，在损伤后5天达到峰值。SCI后MMP-12表达是有害的，并导致炎症反应、急性水肿和继发性损伤反应的发展。因此，阻断水肿(SCI后的关键病理事件)是一种有用的策略，其将防止脊髓中的轴突束进一步受损，因为水肿与神经功能缺陷相关。

在动物研究中，MMP-9和MMP-12的单独基因敲除已证明改善了功能恢复，减少了BSCB分解并减少了神经性疼痛和炎症性疼痛，提供了阻断MMP-9或MMP-12可以具有有益神经保护作用的证据。

已经报道了MMP-12在脑出血(ICH)和SCI中的不利作用，作者提出MMP-12可能是人ICH损伤结果的关键(分别是J.E.Wells，J.Biernaskie，A.Szymanska，P.H.Larsen，V.W.Yong，D.Corbett，Matrix metalloproteinase(MMP)-12 expression has a negativeimpact on sensorimotor function following intracerebral haemorrhage inmice.Eur J Neurosci 21，187-196(2005)和J.E.Wells，T.K.Rice，R.K.Nuttall，D.R.Edwards，H.Zekki，S.Rivest，V.W.Yong，An adverse role for matrixmetalloproteinase 12 after spinal cord injury in mice.J Neurosci 23，10107-10115(2003))。

MMP抑制剂包括广谱抑制剂，已在动物模型中开发和测试，包括GM6001(广谱MMP抑制剂)、抑制剂I(MMP-9选择性抑制剂)、SB-3CT、立普妥(Lipitor)、氟西汀和萝卜硫素(Sulforaphane)。参见以下参考文献：

Y.Kawasaki，Z.Z.Xu，X.Wang，J.Y.Park，Z.Y.Zhuang，P.H.Tan，Y.J.Gao，K.Roy，G.Cortas.E.H.Lo，R.R.Ji，Distinct roles of matrix metalloproteases in theearly-and late-phase development of neuropathic pain.Nat Med 14，331-336(2008).

H.Kobayashi，S.Chattopadhyay，K.Kato，J.Dolkas，S.Kikuchi，R.R.Myers，V.I.Shubayev，MMPs initiate Schwann cell-mediated MBP degradation andmechanical nociception after nerve damage.Mol Cell Neurosci 39，619-627(2008).

F.Yu，H.Kamada，K.Niizuma，H.Endo，P.H.Chan，Induction of mmp-9 expressionand endothelial injury by oxidative stress after spinal cord injury.JNeurotrauma 25，184-195(2008).

C.K.Wada，J.H.Holms，M.L.Curtin，Y.Dai，A.S.Florjancic，R.B.Garland，Y.Guo，H.R.Heyman，J.R.Stacey，D.H.Steinman，D.H.Albert，J.J.Bouska，I.N.Elmore，C.L.Goodfellow，P.A.Marcotte，P.Tapang，D.W.Morgan，M.R.Michaelides，S.K.Davidsen，Phenoxyphenyl sulfone N-formylhydroxylamines(retrohydroxamates)as potent，selective，orally bioavailable matrix metalloproteinase inhibitors.J Med Chem45，219-232(2002).

H.Zhang，M.Chang，C.N.Hansen，D.M.Basso，L.J.Noble-Haeusslein，Role ofmatrix metalloproteinases and therapeutic benefits of their inhibition inspinal cord injury.Neurotherapeutics 8，206-220(2011).

尽管这些抑制剂在早期动物模型中显示出前景，但它们从未在人SCI中进行过测试。这可能是由于担心MMP抑制剂可能的有害肌骨骼(MSK)副作用，所述副作用已在其他病状中由于使用时长(至少6周)而被观察到，尤其是在广谱MMP抑制剂的情况下(J.T.Peterson，Matrix metalloproteinase inhibitor development and theremodeling of drug discovery.Heart Fail Rev 9，63-79(2004))。

美国专利申请US 2003/0139332 A1(Noble等人)涉及MMP(特别是MMP-9)、SCI和相关神经损伤中的抑制剂。

Zhang等人(Neurotherapeutics，第8卷，206-220，2011年4月)涉及MMP(特别是MMP-9)和它们在SCI中的抑制剂。Zhang等人提到MMP-9协助伤口愈合。因此，抑制MMP-9不应有助于伤口愈合，并可能导致瘢痕形成。Zhang还指出，在较慢性损伤的脊髓中使用广谱MMP抑制剂应谨慎。

Wells等人(The Journal of Neuroscience，2003年11月5日-23(31)，10107-10115)涉及MMP-12、其在SCI中的高度上调以及MMP抑制在SCI中的潜在用途。

本公开涉及在SCI或相关神经组织损伤后组合选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。

AZD1236是有效、可逆和特异性的人MMP-9和MMP-12抑制剂，相对MMP-2和MMP-13具有10至15倍的选择性，并且相对酶家族的其他成员具有＞350倍的选择性。AZD1236的IC

AZD1236的制备描述于WO 2006/004532(参见例如实施例1，第20页)。AZD1236的完整化学名称是(5S)-5-({[4-(2-环丙基嘧啶-5-基)乙炔基]-3，6-二氢吡啶-1(2H)-基]磺酰基}甲基]-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮。

AZD3342是另一种有效的人MMP-9和MMP-12抑制剂，对于MMP-9和MMP-12的IC

AZD3342的制备描述于WO 2002/074767(参见例如第65页，第15-27行；第120页，第23-29行)并且新的结晶形式公开于WO 2007/106022。AZD3342的完整化学名称是(5S)-5-[4-(5-氯-吡啶-2-基氧基)-哌啶-1-磺酰基甲基]-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮。

发明内容

本文已证明某些选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的化合物可用于治疗SCI或相关神经组织损伤。具体地，已证明，某些选择性地抑制两种基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-12的化合物在SCI和相关神经组织损伤后阻断SCI诱导的水肿，抑制炎症性疼痛(包括神经性疼痛)，减少BSCB分解，减少瘢痕形成并防止感觉和运动功能下降。某些选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的化合物也促进SCI病变部位上方和下方的轴突再生和轴突保留。

因此，在一个实施方案中，提供了一种化合物或化合物的组合，用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤(诸如创伤性脑损伤(TBI))或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤(诸如TBI)有关的继发性效应，包括在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。

在另一个实施方案中，提供了一种化合物或化合物的组合，用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应，包括在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的一种化合物或化合物的组合，其中使用单一选择性MMP-9和MMP-12抑制剂或一种或多种选择性MMP-9抑制剂与一种或多种单独的选择性MMP-12抑制剂的组合。

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的化合物的组合，其中使用一种或多种单独的选择性MMP-9抑制剂和一种或多种单独的选择性MMP-12抑制剂。

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的化合物的组合，其中使用一种或多种单独的选择性MMP-9抑制剂与一种或多种单独的选择性MMP-12抑制剂的组合(优选单一MMP-9抑制剂和单一MMP-12抑制剂，即两种化合物的组合)。

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的单一化合物，其中使用既是选择性MMP-9抑制剂又是MMP-12抑制剂的单一化合物。

在另一个实施方案中，一种或多种MMP-12抑制剂比使用的一种或多种MMP-9抑制剂具有更高的活性。在其他实施方案中，MMP-12抑制活性比MMP-9抑制活性高10、100或1,000倍。

在另一个实施方案中，一种或多种MMP-9抑制剂比使用的一种或多种MMP-12抑制剂具有更高的活性。在其他实施方案中，MMP-9抑制活性比MMP-12抑制活性高10、100或1,000倍。

“选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的活性或表达”是指MMP-9和MMP-12两者的活性或表达均受到抑制，并且抑制程度高于对其他MMP，特别是MMP-2的抑制。当MMP-9和MMP-12两者同时受到抑制时，对MMP-9和MMP-12两者的抑制是同时的，尽管如果MMP-9和MMP-12的水平在治疗过程中波动并且MMP-9或MMP-12中的一个初始时受到更多抑制，然后另一个在治疗后期受到更显著的抑制，则这在本质上可能更具连续性。然而，尽管MMP-9和MMP-12水平在治疗期间可能会波动，但两者都应始终在一定程度存在(即始终存在至少一些对MMP-9和MMP-12两者的同时抑制)。因此，在本文所述的用途/治疗中，MMP-9和MMP-12两者的一种或多种选择性抑制剂应始终同时存在。

因此，提供了一种化合物或化合物的组合，用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应，包括在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地(并且同时)抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达，其抑制程度高于对其他MMP，特别是MMP-2的抑制。

在一个实施方案中，选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的活性和表达。在另一个实施方案中，选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的活性。

在一个实施方案中，对MMP-9和MMP-12的抑制比对任何其他MMP的抑制的选择性高至少10倍。在另一个实施方案中，对MMP-9和MMP-12的抑制比对任何其他MMP的抑制的选择性高至少50或100倍。在又一个实施方案中，对MMP-9和MMP-12的抑制比对任何其他MMP的抑制的选择性高至少300倍。

MMP-9和MMP-12可同时被具有MMP-9和MMP-12两者的抑制活性的单一化合物或被单独的化合物(一种为选择性MMP-9抑制剂，并且另一种为选择性MMP-12抑制剂)的组合抑制。单独的化合物的施用可以包含两种化合物的固定剂量组合组合物的形式，或者通过单独、连续或同时施用包含个别化合物的组合物，前提是施用两种化合物使得对MMP-9和MMP-12两者的抑制同时发生。

在一个实施方案中，“选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的活性或表达”还意味着使用的化合物或化合物的组合对MMP-9和MMP-12两者具有大致相等的活性。例如，AZD1236的IC

在一个实施方案中，提供了如本文所述使用的单一化合物，其中单一选择性MMP-9和MMP-12抑制剂化合物具有针对MMP-9和MMP-12两者的在1nM至50nM范围内，或在另一个实施方案中在1nM至100nM范围内的IC

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的单一化合物，其中单一选择性MMP-9和MMP-12抑制剂化合物具有针对MMP-2的大于100nM，或在另一个实施方案中大于200nM的IC

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的单一化合物，其中单一选择性MMP-9和MMP-12抑制剂化合物具有针对MMP-9和MMP-12两者的在1nM至50nM范围内(或在另一个实施方案中在1nM至100nM范围内)的IC

在另一个实施方案中，如本文所述使用的单一选择性MMP-9和MMP-12抑制剂化合物是AZD1236或AZD3342，或它们的药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，如本文所述使用的单一选择性MMP-9和MMP-12抑制剂化合物是AZD1236，或其药学上可接受的盐。

在其他实施方案中，MMP-12抑制活性比MMP-9抑制活性高10、100或1,000倍。

在其他实施方案中，MMP-9抑制活性比MMP-12抑制活性高10、100或1,000倍。

在另一个实施方案中，提供了一种化合物或化合物的组合，用于治疗神经性疼痛，包括选择性地抑制MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。神经性疼痛是由影响体感神经系统的损伤或疾病引起的疼痛。在一个实施方案中，提供了用于治疗神经性疼痛的AZD1236或其药学上可接受的盐。

附图说明

本公开由附图说明和支持。

图1.MMP-9和MMP-12水平及其酶活性在DC损伤后急剧增加。(A)MMP-9 mRNA在损伤后1天增加到最大值，而(B)MMP-12在损伤后5天达到峰值。(C)MMP-9蛋白水平也在损伤后1天达到峰值。(D)MMP-12蛋白水平也在损伤后5天达到峰值。(E)MMP-9活性在损伤后1天时很高，并在损伤后3天达到峰值。RFU＝相对荧光单位。(F)MMP-12活性在损伤后5天达到峰值。RFU＝相对荧光单位。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。

图2.AZD1236显著抑制MMP-9和MMP-12活性。(A)和(B)MMP-9和MMP-12活性分别在血清和CSF两者中被口服递送AZD1236抑制。(C)和(D)MMP-9和MMP-12活性分别在血清和CSF两者中被鞘内递送AZD1236抑制。(E)示出分别在口服和鞘内递送后血清和CSF中AZD1236对MMP-9和MMP-12活性的％抑制的汇总表。(F)最佳剂量的AZD1236也显著抑制脊髓匀浆中的MMP-9和MMP-12活性(RFU＝相对荧光单位)。(G)原位酶谱示出在口服和鞘内递送最佳剂量的AZD1236后，脊髓切片中DC损伤后高水平的明胶酶活性(绿色；箭头)受到抑制。切片用GFAP(红色)复染以将星形胶质细胞标记为红色。#＝病变部位。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(G)中的比例尺＝200μm。

图3.脊髓含水量。(A)与假治疗对照水平相比，脊髓中的平均含水量(水肿)在DC损伤后上升并在3天时达到峰值，此后下降。在损伤后立即口服和鞘内递送后3天时，AZD1236分别在(B)200mg/kg和在(C)5mg/kg时减弱DC损伤诱导的脊髓含水量升高。(D)需要抑制MMP-9和MMP-12两者来消除SCI诱导的水肿。注意：MMP408和抑制剂I在单独使用时以上述剂量使用，但是，当组合使用时，剂量减半(即100mg/kg＝50mg/kg MMP408/50mg/kg抑制剂I，200mg/kg＝100mg/kg MMP408/100mg/kg抑制剂I，300mg/kg＝150mg/kg MMP408/150mg/kg抑制剂I)。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。**＝P＝0.01；***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。在损伤后立即通过口服灌胃递送AZD1236。

图4.DC损伤后3天MMP抑制剂及其抑制脊髓含水量的能力的比较。背柱(DC)损伤诱导含水量增加，所述含水量只能被不同的MMP抑制剂部分抑制。(A)用GM6001(广谱MMP抑制剂；抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8和MMP-9)治疗后脊髓的平均含水量。*P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(B)用SB-3CT(选择性MMP-2抑制剂)治疗后脊髓的平均含水量。(C)用MMP-9抑制剂I治疗后脊髓的平均含水量。*＝P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(D)用SD2590(抑制MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-13和MMP-14)治疗后脊髓的平均含水量。*＝P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(E)用ND378(抑制MMP-2)治疗后脊髓的平均含水量。(F)用米诺环素(对MMP活性无影响)治疗后脊髓的平均含水量。(G)用利鲁唑(GABA摄取抑制剂)治疗后脊髓的平均含水量。*＝P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(H)用格列本脲(Sur1调节的NCCa-ATP)治疗后脊髓的平均含水量。*＝P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(I)用褪黑激素(水通道蛋白-4)治疗后脊髓的平均含水量。*＝P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(J)与此研究中使用的所有MMP抑制剂相比，AZD1236优越得多，几乎完全消除了DC损伤诱导的升高，并将这些水平抑制回到假治疗对照水平。***＝P＝0.00012，单向ANOVA与Dunnett事后检验。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。*＝P＝0.05，单向ANOVA与Dunnett事后检验。在损伤后立即通过口服灌胃递送AZD1236。

图5.对MMP-9和MMP-12的抑制可抑制DC损伤后的促炎性疼痛标志物。(A)和(B)在DC损伤模型中，在口服和鞘内递送后，AZD1236对MMP-9和MMP-12的抑制分别减弱了促炎性疼痛标志物白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的mRNA水平。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。***＝P＜0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。

图6.在SCI的夹压(CC)模型中，AZD1236抑制脊髓含水量、促炎性疼痛标志物、MMP活性和疼痛行为的提高。AZD1236通过口服或鞘内(it)递送减弱：(A)损伤诱导的脊髓含水量升高，(B)促炎性疼痛标志物的相对表达，(C)MMP-9和MMP-12活性，并且口服递送改善对(D)触觉、(E)热和(F)冷痛觉异常的反应。注意：与目前使用的神经性止痛药普瑞巴林(30mg/kg)和加巴喷丁(100mg/kg)(在完整实验之前在CC模型中的初步测试中确定的预优化浓度)相比，AZD1236可显著减少疼痛行为。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。*＝P＝0.04**＝P＝0.01；***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。在损伤后立即通过口服灌胃递送AZD1236。

图7.AZD1236在减少CC损伤后的促炎性疼痛标志物方面比目前使用的其他止痛药更有效。与效果较差的预优化普瑞巴林和加巴喷丁相比，AZD1236显著减弱CC损伤后的促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和IL-6。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。*＝P＝0.04**＝P＝0.01；***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。在损伤后立即通过口服灌胃递送所有药物。

图8.口服递送AZD1236改善DC损伤后的电生理、运动和感觉结果。(A)口服递送AZD1236后的代表性叠加CAP迹线。在用AZD1236治疗后，(B)CAP幅值和(C)CAP面积均显示出显著改善。在用AZD1236治疗后，(D)梯子跨越(运动功能)和(E)平均胶带感觉/去除时间(感觉功能)均显示出显著改善。#＝P＜0.00147，线性混合模型；##＝P＜0.00114，广义线性混合模型；***＝P＜0.0001，ANOVA。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，3次独立实验，总共n＝18只小鼠/组。

图9.鞘内递送AZD1236改善DC损伤后的电生理、运动和感觉结果。(A)鞘内递送AZD1236后的代表性叠加CAP迹线。在用AZD1236治疗后，(B)CAP幅值和(C)CAP面积均显示出显著改善。在用AZD1236治疗后，(D)梯子跨越(运动功能)和(E)平均胶带感觉/去除时间(感觉功能)均显示出显著改善。#＝P＜0.0015，线性混合模型；##＝P＜0.0011，广义线性混合模型；***＝P＜0.0001，ANOVA。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，3次独立实验，总共n＝18只小鼠/组。

图10.使用AZD1236抑制MMP-9和MMP-12促进小鼠DC损伤中病变上方和下方的DC轴突再生和轴突保留。(A)霍乱毒素B(CTB)逆行标记轴突以在DC病变部位内再生/萌生并长入用DC+AZD126治疗的动物吻侧部脊髓，而没有证据表明CTB标记的轴突存在于DC+媒介物治疗的对照中的病变部位或其他部位。比例尺＝200μm。(B)与DC+媒介物治疗的对照相比，显著更大比例的CTB标记轴突定量于DC-AZD1236治疗的动物中病变部位的吻侧部/尾部。(C)检测来自DC+媒介物和DC+AZD1236治疗的动物，病变部位上方(T9)和下方(T7)的脊髓截面的神经丝(NF)200

图11.AZD1236比其他MMP抑制剂促进显著更多的DC轴突再生

图12.用AZD1236延迟24小时治疗与立即治疗一样有益。(A)显示AZD1236显著抑制SCI诱导的脊髓含水量的数据。***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(B)促炎性疼痛标志物的表达被显著抑制。***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(C)MMP-9和MMP-12活性也被AZD1236抑制。***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(D)在用AZD1236延迟治疗后，代表性Spike 2处理CAP迹线。注意：在记录结束时，脊髓背侧半切导致CAP迹线消失，证明实验在技术上取得成功。(E)在用AZD1236治疗后观察到(E)CAP幅值和(F)CAP面积的显著改善。***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。(G)梯子跨越和(H)胶带感觉/去除表现通过AZD1236治疗得到改善。数据表示为平均值±SEM。##＝P＜0.0012，广义线性混合模型。#＝P＜0.0011，线性混合模型。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。

图13.用AZD1236延迟24小时治疗促进轴突再生的比例与立即治疗类似。(A)CTB

图14.口服递送AZD1236减弱病变部位的血脊髓屏障(BSCB)分解和瘢痕组织。(A)对MMP-9和MMP-12的抑制可抑制如病变部位(#)的白蛋白免疫反应性所检测到的白蛋白外渗，并且(B)量化证明，与媒介物治疗的动物相比，在DC损伤和用AZD1236治疗后3天，BSCB分解受到抑制。(C)在DC损伤和治疗后4周，病变部位(#)的层粘连蛋白免疫反应性(瘢痕组织)显示出与媒介物治疗组相比，AZD1236治疗的动物中的瘢痕组织受到显著抑制。(D)层粘连蛋白免疫反应像素数量的量化证明病变部位的层粘连蛋白瘢痕组织水平显著减弱。显示AZD1236在损伤后立即或24小时内递送时减少损伤部位(#)的脑信号蛋白-3A(Sema-3A)沉积的(E)Sema-3A免疫反应性和(F)定量。显示AZD1236在损伤后立即或24小时内递送时减少损伤部位的CS-56沉积的(G)CS-56免疫反应性和(H)定量。(I)分别来自DC+媒介物和DC+AZD1236治疗的动物的矢状截面的CD11b、CD68和GFAP免疫反应性。E、G和I中的比例尺＝100μm，在(I)中的插图i和插图ii中＝200μm。(J至L)证明DC+AZD1236治疗(立即和延迟24小时后)的动物中显著抑制水平的CD11b、CD68和GFAP

图15.SCI的常见CSF生物标志物也被AZD1236减弱。相比之下，(A)S100β、(B)NSE、(C)GFAP、(D)pNF-H和(E)NF-L均被褪黑激素略微地减少，但被AZD1236显著减弱。n＝12只小鼠/组。***＝P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。

图16.AZD1236减弱LPS刺激的小胶质细胞释放的促炎细胞因子，但不影响巨噬细胞的体外迁移。LPS刺激的初级小胶质细胞产生的(A)TNF-α、(B)IL-1β和(C)IL-6被AZD1236抑制。相比之下，其他MMP抑制剂诸如GM6001、SD2590和MMP抑制剂I仅略微减弱TNF-α、IL-1β和IL-6水平。(D)巨噬细胞迁移不受AZD1236、GM6001、Sd2590或MMP9抑制剂I的影响，但阳性对照MCP-1和PMA显著增加所有巨噬细胞群体的迁移指数。n＝3孔/治疗，3次独立重复(总共n＝9孔/治疗)。**＝P＜0.001；***＝P＜0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。

图17.使用AZD3342抑制MMP-9和MMP-12在大鼠DC损伤模型中也有效。(A)大鼠的MMP-9mRNA水平也在DC损伤后1天达到峰值。(B)大鼠的MMP-12mRNA水平也在DC损伤后5天达到峰值。(C)在抑制MMP-9和MMP-12后3天，大鼠的脊髓含水量(水肿)消除。作为比较，褪黑激素只有略微的作用。(D)AZD3342显著抑制MMP-9和MMP-12活性。(E)AZD3342显著抑制促炎性疼痛细胞因子的表达，而褪黑激素的作用很小。(F)在用AZD3342和褪黑激素治疗后6周，代表性Spike 2处理CAP迹线。在DC损伤后，AZD3342恢复了显著的CAP波。(G)AZD3342在6周内改善了梯子跨越表现(运动功能)。(H)与媒介物或褪黑激素治疗的大鼠相比，AZD3342在6周内改善了胶带感觉和去除表现时间(感觉功能)。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。***P＝0.0001，单向ANOVA与Dunnett事后检验。#＝P＜0.0011，线性混合模型；##＝P＜0.0011，广义线性混合模型。在损伤后立即通过口服灌胃递送AZD3342。

图18.在最后一次口服剂量的AZD1236后4-5天，病变部位的MMP-9和MMP-12活性恢复到正常的DC损伤诱导的水平。(A)MMP-9活性在第7天恢复到损伤诱导的水平，在停用AZD1236后需要4天恢复到这些水平。(B)MMP-12活性在第8天恢复到损伤诱导的水平，在停用AZD1236后需要5天恢复到这些水平。在损伤后立即通过口服灌胃递送AZD1236。

图19.口服和鞘内AZD1236施用后的MMP-2活性。口服和鞘内AZD1236施用后MMP-2活性没有变化，表明AZD1236的作用对MMP-9和MMP-12抑制具有特异性。数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/组，2次独立实验，总共n＝12只小鼠/组。

图20.脊髓含水量作为损伤诱导的水肿的度量。背柱(DC)损伤诱导含水量增加，这被AZD1236和AZD3342(MMP-9和MMP-12的特异性抑制剂)两者完全抑制。

图21.抑制水通道蛋白-4后的含水量。水通道蛋白-4重定位抑制剂三氟拉嗪(TFP)、蛋白激酶抑制剂(PKAi)和TGN-020可抑制SCI诱导的水肿。蛋白激酶C抑制剂对SCI诱导的水肿没有影响。

具体实施方式

本文已证明抑制两种基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-12可用于治疗SCI或相关神经组织损伤，或可用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应。

在一些实施方案中，这可通过使用分别具有MMP-9和MMP-12抑制活性的单独化合物的组合来实现。在其他实施方案中，可使用具有MMP-9和MMP-12两者的抑制活性的单一化合物。

使用了AZD1236，一种特异性MMP-9和MMP-12抑制剂，并在口服和鞘内递送后测定其对水肿、BSCB分解、NP、瘢痕形成以及功能和行为恢复的影响。发现AZD1236抑制脊髓组织、血清和脑脊液中的MMP-9和MMP-12，并抑制SCI诱导的水肿，减少炎症性疼痛标志物和NP反应(机械、热和冷痛觉异常)，改善整个SCI部位的电生理反应，改善运动和感觉功能，并减少BSCB分解和病变部位的瘢痕形成，有助于保持长期功能。此外，发现AZD1236对MMP-9和MMP-12的抑制抑制了病变部位的小胶质细胞激活和巨噬细胞浸润，并减少了瘢痕组织衍生的轴突生长抑制分子(例如，Sema-3A和CS-56)。所有这些作用都有助于改善轴突再生的环境，并且这促进了病变部位上方和下方轴突的保留。

本文公开的结果还证明AZD3342抑制SCI诱导的水肿，并且特异性MMP-12抑制剂MMP408与MMP-9抑制剂抑制剂I组合也抑制SCI诱导的水肿。

本文已经证明减少SCI诱导的水肿依赖于MMP-9和MMP-12的组合被抑制，因为单独抑制其中任何一个都提供次优作用。SCI后的临床结果受脊髓水肿的影响很大，如果不加以控制，可导致进一步的损伤和死亡。

还发现MMP-12比MMP-9的表达水平高得多，并且其表达在SCI后5天达到峰值，表明抑制MMP-12在SCI后特别是在减少BSCB分解和更好功能恢复方面具有积极作用。

有利的是，使用MMP-9和MMP-12抑制剂(例如，AZD1236、AZD3342或特异性MMP-9抑制剂和特异性MMP-12抑制剂)来抑制水肿提供了减少肿胀的非手术方式；因此，防止任何进一步的并发症和/或手术对创伤部位造成的损伤。

如实施例中所示，还发现抑制MMP-9和MMP-12两者活性有利于减少BSCB分解，从而抑制SCI诱导的水肿并改善功能恢复。SCI后的结果受脊髓水肿的影响很大。这些结果可能会持续很长时间，并对神经外科医生构成重大挑战。此外，急性抑制BSCB破坏可能保护脊髓免受炎症细胞的流入，并阻止分子诸如血浆的外渗，减少在高浓度下可能有毒的炎症细胞、谷氨酸和甘氨酸的毒性作用。

如实施例中所示，AZD1236对MMP9和12的抑制也减少了SCI后的中性粒细胞浸润并减少了白质损伤，表明嗜中性粒细胞参与受损的运动恢复。中性粒细胞通过生成活性氧和蛋白酶(包括MMP)损伤脑组织。还观察到，在AZD1236治疗的动物中，在病变部位及其周围发生了巨噬细胞和小神经胶质细胞激活的显著抑制。此外，实施例显示AZD1236抑制LPS激活的促炎和神经性疼痛相关细胞因子从原代小胶质细胞的体外释放。此外，实施例显示AZD1236对巨噬细胞的体外迁移没有影响，而在体内观察到AZD1236治疗的动物病变部位的巨噬细胞数量减少。AZD1236治疗的动物病变部位巨噬细胞数量减少被认为与BSCB减少有关。总的来说，AZD1236的所有这些作用都有助于减少脊髓的整体损伤和后续的感觉和运动功能受损。

本文公开的结果通过白蛋白标记证明减少了BSCB分解，所述白蛋白通常由于BSCB分解而外渗到脊髓实质中。AZD1236还促进了病变部位瘢痕形成的减少，并如GFAP标记测量抑制了星形胶质细胞的激活，表明增强了对脊髓组织及其正常结构的保护。Sema-3A和CSPG都是存在于SCI部位的ECM分子，并且都是有效的轴突生长抑制剂。药理学抑制Sema-3A和酶促降解CSPG导致SCI后显著的轴突再生，因此AZD1236减少这些分子可能是观察到的DC轴突再生增加的原因。

本文的结果公开AZD1236对MMP-9和MMP-12的抑制促进了DC损伤后的CNS轴突再生/萌生，使得AZD1236治疗的动物在病变部位含有显著增强的再生轴突，所述轴突在吻侧部延伸长距离。为了符合这一点，病变部位上方和下方的保留的纤维显著增加，并且可能还有助于在AZD1236治疗后观察到增强的功能恢复。增强的保留可能是由于AZD1236治疗后观察到的病变部位组织损伤减弱、浸润细胞减少和小胶质细胞激活减少。增强的轴突再生也可以是直接的或间接的。例如，MMP-9和MMP-12的急性激活都与BSCB的破坏有关(Wang X，Jung J，Asahi M，Chwang W，Russo L，Moskowitz MA等人Effects of matrixmetalloproteinase-9 gene knock-out on morphological and motor outcomes aftertraumatic brain injury.J Neurosci 2000；20(18)：7037-42；Noble LJ，Donovan F，Igarashi T，Goussev S，Werb Z.Matrix metalloproteinases limit functionalrecovery after spinal cord injury by modulation of early vascular events.JNeurosci 2002；22(17)：7526-35)，但MMP-9

因此，MMP-9和MMP-12具有多种功能，并且实验证据表明在受损CNS轴突再生的各个方面具有复杂的调节作用(Andries L，Van Hove I，Moons L，De Groef L.MatrixMetalloprote inases During Axonal Regeneration，a Multifactorial Role fromStart to Finish.Mol Neurobiol 2017；54(3)：2114-25)。例如，它们有助于早期吞噬作用和神经胶质瘢痕形成反应，同时它们促进髓鞘衍生抑制剂的降解、生长因子的激活、轴突导航、轴突伸长、生长锥运动、突触生成和神经再支配以及最终的髓鞘再生(Gijbels K，Proost P，Masure S，Carton H，Billiau A，Opdenakker G.Gelatinase B is present inthe cerebrospinal fluid during experimental autoimmune encephalomyelitis andcleaves myelin basic protein.J Neurosci Res 1993；36(4)：432-40；Proost P，VanDamme J，Opdenakker G.Leukocyte gelatinase B cleavage releases encephalitogensfrom human myelin basic protein.Biochem Biophys Res Commun 1993；192(3)：1175-81；Andries L，Van Hove I，Moons L，De Groef L.Matrix Metalloproteinases DuringAxonal Regeneration，a Multifactorial Role from Start to Finish.Mol Neurobiol2017；54(3)：2114-25)。本文公开了在SCI后减弱MMP-9和MMP-12的早期上升是有益的。由于MMP-9和MMP-12的活性在停止AZD1236治疗后5天恢复至正常，预计MMP-9和MMP-12可参与损伤后的正常愈合反应(Andries L，Van Hove I，Moons L，De Groef L.MatrixMetalloproteinases During Axonal Regeneration，a Muitifactorial Role fromStart to Finish.Mol Neurobiol 2017；54(3)：2114-25)。

本文公开的结果证明AZD1236抑制促炎性疼痛标志物并减少触觉、热和冷痛觉异常，这些都是神经性疼痛(NP)的标志。此数据支持AZD1236在限制SCI诱导的NP方面的效用，很可能是通过减少水肿来实现的。然而，抑制脊髓中巨噬细胞和小胶质细胞活性也可能有助于抑制NP，因为巨噬细胞浸润、小胶质细胞激活和BSCB屏障分解与NP相关(Zhao H，AlamA，Chen Q，M AE，Pal A，Eguchi S等人The role of microglia in the pathobiology ofneuropathic pain development：what do we know？Br J Anaesth 2017；118(4)：504-16；Honjoh K，Nakajima H，Hirai T，Watanabe S，Matsumine A.Relationship ofInflammatory Cytokines From M 1-Type Microglia/Macrophages at the Injured Site and Lumbar Enlargemert With Neuropathic Pain After Spinal Cord Injury inthe CCL21 Knockout(plt)Mouse.Front Cell Neurosci 2019；13：525；Takeura N，Nakajima H，Watanabe S，Honjoh K，Takahashi A，Matsumine A.Role of macrophagesand activated microglia in neuropathic pain associated with chronicprogressive spinal cord compression.Sci Rep 2019；9(1)：15656)。

因此，AZD1236减少巨噬细胞和小胶质细胞激活、BSCB分解以及中和潜在毒性MMP-9和MMP-12的特性可能都有助于限制浸润细胞，从而减少促炎细胞因子的产生。所有这些因素连同抑制的水肿都有助于减少AZD1236治疗的动物的NP。NP是SCI后常见的继发性并发症，并且估计在61％的报告病例中普遍存在。损伤后NP出现在损伤水平或损伤水平下方，并导致生活质量下降、抑郁和睡眠障碍。目前的药物疗法难以治疗NP，其中Lyrica在一项随机对照临床试验中显示为最有前途(Siddall PJ，McClelland JM，Rutkowski SB，CousinsMJ.A longitudinal study of the prevalence and characteristics of pain in thefirst 5 years following spinal cord injury.Pain 2003；103(3)：249-57；CardenasDD，Nieshoff EC，Suda K，Goto S，Sanin L，Kaneko T等人A randomized trial ofpregabalin in patients with neuropathic pain due to spinal cordinjury.Neurology 2013；80(6)：533-9)。SCI后NP发展的潜在机制已在文献别处详细描述，但涉及外周、脊髓和大脑机制(Siddall PJ.Management of neuropathic pain followingspinal cord injury：now and in the future.Spinal Cord 2009；47(5)：352-9；Finnerup NB，Baastrup C.Spinal cord injury pain：mechanisms and management.CurrPain Headache Rep 2012；16(3)：207-16；D′Angelo R，Morreale A，Donadio V，BorianiS，Maraldi N，Plazzi G等人Neuropathic pain following spinal cord injury：what weknow about mechanisms，assessment and management.Eur Rev Med Pharmacol Sci2013；17(23)：3257-61)。

本文公开的结果表明，AZD1236相对于其他MMP抑制剂有几个令人惊讶的优势，这保证了它在SCI中的应用。例如，(1)与其他工具和临床MMP抑制剂相比，AZD1236在抑制水肿方面更优异；(2)与FDA批准的其他神经性疼痛药物(例如普瑞巴林和加巴喷丁)相比，AZD1236在抑制促炎性疼痛标志物和减少神经性疼痛行为方面具更优异；(3)AZD1236在SCI后立即递送或24小时递送时，在我们的SCI模型中测量的所有参数都发生了类似的变化；(4)短期递送AZD1236(3天)显著降低了长期使用MMP抑制剂时观察到的肌肉骨骼副作用的可能性；(5)AZD1236促进轴突再生和功能恢复；(6)AZD1236抑制病变部位处的瘢痕组织沉积；(6)AZD1236减少血源性细胞浸润到CNS；以及(7)AZD1236促进感觉和运动恢复，使其独一无二，因为它满足了SCI恢复性治疗的许多方面。

本文公开的结果证明，短期抑制MMP-9和MMP-12极大地限制了脊髓继发性损伤的程度，因此代表了一种潜在的方法，可以将主要病理生理学作为SCI的一线治疗。

此外，本文的结果公开AZD1236通过特异性抑制MMP-9和MMP-12成为第一个针对SCI病理生理学所有四个方面的实验治疗。AZD1236减少SCI诱导的水肿，抑制疼痛的促炎标志物，并改善动物对各种NP来源的反应，改善运动和感觉功能，并减少BSCB分解和病变部位处的瘢痕组织形成。AZD1236治疗还导致抑制巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，促进了通过病变部位的DC轴突再生，并增强了病变部位上方和下方轴突的保留。AZD1236治疗的所有这些有益作用有助于在本文公开的研究中观察到的感觉和运动功能的整体改善。

此外，鞘内递送AZD1236需要口服剂量的1/40以在SCI后引起相同有益作用。这些结果表明，通过口服或鞘内递送，使用AZD1236抑制MMP-9和MMP-12是治疗SCI的一种有前途的治疗方法。

使用比口服施用更低的剂量和更有针对性的途径也可以限制潜在的副作用。有利地，鞘内给药可导致一种或多种化合物的水平在比口服施用一种或多种化合物更短的时间范围内达到稳定水平。

此外，令人惊讶的是，观察到的作用在仅短时间内(例如只在SCI后的前3天)施用后就很明显。此外，如果在SCI后达到24小时开始治疗，也观察到益处。有利的是，这为医疗保健专业人员提供了一个工作窗口，可以在不减少与治疗相关的任何益处的情况下治疗SCI后的患者，即，在某些情况下，可能会延迟开始治疗患者，例如，可能需要用于在SCI后紧急服务到达患者处需要的时间。

本文公开的结果被认为是由于选择性地抑制MMP-9和MMP-12，它们在SCI中上调(与其他MMP一起)。目前对SCI的对症治疗(例如Lyrica)针对NP并且很容易上瘾。其他MMP抑制剂(例如在COPD和癌症治疗中)具有已知的副作用(例如肌肉骨骼副作用)，因此不会被视为有吸引力的候选药物。使用广谱MMP抑制剂或MMP-2抑制剂，即使持续时间更长，例如超过2周，也不会提供本文用AZD1236所见的作用。

选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者在SCI中以前从未使用过，并且对水肿和NP的快速和显著影响令人惊讶。特别是对水肿的影响可帮助防止通常与肿胀相关的进一步损伤，因此避免进一步的手术(减压)干预。此外，由于没有针对大麻素受体，可以避免成瘾问题。

如本文所述用于选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的特定化合物是化合物或它们药学上可接受的盐，其描述于WO2002/074767、WO 2007/106022和WO 2006/004532。还包括此类化合物的互变异构体、物理形式、多晶型物、溶剂化物、水合物以及此类化合物的对映异构体、非对映异构体和混合物和外消旋体。

如本文所述使用的特定化合物是AZD1236和AZD3342或它们药学上可接受的盐。如本文所述使用的其他特定化合物是特异性MMP-12抑制剂MMP408(参见Li，W.等人2009.J.Med.Chem.52，1799)和MMP-9抑制剂，抑制剂I(参见Levin，J.I.等人2001.Bioorg.Med.Chem.Lett.11，2189)。

此外，对水肿的影响表明，化合物(诸如TFP、PKAi和TGN-020)对水通道蛋白通道(AQP4)的短期抑制也可能迅速抑制SCI中的水肿，并提供与AZD1236类似的作用。因此，组合治疗也是可能的，并且可以允许使用显著更低剂量的每种剂。AQP4抑制剂的这种短期(一周)作用有助于避免长期副作用(诸如水中毒)。

在CNS中，水通道蛋白-4(AQP4)是一种主要的水通道蛋白，在脊髓水肿期间调节BSCB的通透性。SCI引起AQP4表达的变化，从而引起脊髓中含水量的变化。AQP4还调节星形胶质细胞的肿胀，这在急性SCI后的细胞毒性水肿中起主要作用。AQP4空(null)小鼠在SCI后的急性期表现出减少的SCI诱导的水肿和改善的功能恢复。水肿的药理学抑制剂诸如褪黑激素和手术干预诸如脊髓切开术也通过抑制AQP4减少了SCI诱导的水肿。

药物组合物和剂量

根据另一方面，提供了一种药物组合物，其包含选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合，或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。

组合物可以是适合口服使用(例如作为片剂、锭剂、硬或软胶囊、水性或油性悬浮液、乳剂、可分散的粉末或颗粒、糖浆或酏剂)、适合局部使用(例如作为乳膏、软膏、凝胶或水性或油性溶液或悬浮液)、适合吸入施用(例如作为细粉或液体气雾剂)、适合吹入施用(例如作为细粉)或适合肠胃外或鞘内施用(例如作为用于静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内给药的无菌水性或油性溶液或作为用于直肠给药的栓剂)的形式。在优选的实施方案中，组合物是片剂。

组合物可以使用本领域熟知的常规药物赋形剂通过常规程序获得。因此，用于口服使用的组合物可能含有，例如，一种或多种着色剂、甜味剂、调味剂和/或防腐剂。

用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤，或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物组合的有效量是足以治疗或预防本文所指病状、减缓其进展和/或减少与病状相关的症状的量。

与一种或多种赋形剂组合以产生单剂型的活性成分的量将根据治疗个体和特定施用途径而必要地变化。例如，用于人类口服施用的制剂通常含有例如0.5mg至1.0g的活性剂(更合适的是0.5至100mg，例如1至30mg)与适当且方便量的赋形剂的混合物，该赋形剂可以在总组合物重量的约5％至约98％之间变化。

根据众所周知的医学原理，用于治疗或预防目的的剂量大小将自然根据病状的性质和严重程度、动物或患者的年龄和性别以及施用途径而变化。

在此类治疗或预防目的中，通常施用的日剂量在例如0.1mg/kg至250mg/kg(更合适的是0.1mg/kg至50mg/kg)体重的范围内，如果需要可分次给药。当采用肠胃外或鞘内途径时，通常会施用较低的剂量。因此，例如，对于静脉内或腹膜内施用，一般会使用例如，0.1mg/kg至30mg/kg体重范围内的剂量。类似地，对于吸入施用，使用例如，0.05mg/kg至25mg/kg体重范围内的剂量。口服施用也可能是合适的，尤其是片剂形式。通常，单位剂型将含有约0.5mg至0.5g的本发明的化合物。

在一个实施方案中，活性成分每天施用一次或每天施用两次。

在一个实施方案中，活性成分每天施用两次。在一个实施方案中，第一每日剂量在早晨施用，并且第二每日剂量在晚上施用。

在一个实施方案中，AZD1236或其药学上可接受的盐每天给药两次。

在一个实施方案中，AZD1236或其药学上可接受的盐每天两次口服给药50至200mg，诸如每天两次约100mg，更方便地，每天两次约75mg。在一个实施方案中，AZD1236或其药学上可接受的盐每天两次鞘内给药1至5mg，方便地，每天两次1至2.5mg，诸如每天两次约1.9mg。

在一个实施方案中，选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合施用持续最多3天，诸如持续最多1天或最多2天。方便地，选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合施用持续1天、2天或3天，方便地，3天。有利地，已发现在化合物或化合物组合的最后一次给药后4-5天，即在中枢神经系统的愈合阶段之前，MMP-9和MMP-12活性恢复正常。由于MMP-9在伤口愈合中的作用，长期抑制MMP-9可能会导致有害影响，但已发现短期抑制MMP-9和MMP-12可以控制SCI后这些酶的初始过度激活。

在一个实施方案中，选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物组合的第一剂量在SCI或相关神经组织损伤后最多24小时的时间段内施用。有利地，已经证明，如果化合物或化合物的组合在SCI或相关神经组织损伤后立即施用或在损伤后24小时施用，由于施用选择性地抑制MMP-9和MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合的有益作用是类似的。

在一个实施方案中，选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物组合的第一剂量在SCI或相关神经组织损伤后最多24小时的时间段内施用，并且化合物或化合物组合的后续剂量在其后持续1天、2天或3天，方便地在其后3天施用。例如，如果第一剂量在损伤后24小时给予，则后续剂量将在之后的1至3天时间段内施用。

在一个实施方案中，第一剂AZD1236或其药学上可接受的盐在SCI或相关神经组织损伤后最多24小时的时间段内施用，并且化合物或化合物组合的后续剂量在其后持续3天施用。

在一个实施方案中，第一剂AZD1236或其药学上可接受的盐在SCI或相关神经组织损伤后最多24小时的时间段内施用，并且化合物或化合物组合的后续剂量在其后持续3天施用，其中AZD1236每天给药两次，例如每天两次口服给药。

在一个实施方案中，第一剂AZD1236或其药学上可接受的盐在SCI或相关神经组织损伤后最多24小时的时间段内施用，并且化合物或化合物组合的后续剂量在其后持续3天施用，其中AZD1236每天两次口服给药50至200mg，诸如每天两次约100mg，更方便地，每天两次约75mg。

在一个实施方案中，第一剂AZD1236或其药学上可接受的盐在SCI或相关神经组织损伤后最多24小时的时间段内施用，并且化合物或化合物组合的后续剂量在其后持续3天施用，其中AZD1236每天两次鞘内给药1至5mg，方便地每天两次1至2.5mg，诸如每天两次约1.9mg。

在一个实施方案中，化合物或化合物的组合与食物一起施用。在一个实施方案中，化合物或化合物的组合不与食物一起施用。

治疗用途和应用

在一个实施方案中，提供了用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤，或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物组合。SCI是指引起创伤并导致血-脊髓屏障(BSCB)破坏、水肿、神经元死亡、轴突损伤和脱髓鞘的任何损伤。

相关神经组织损伤是指引起创伤并导致神经组织破坏、水肿、神经元死亡、轴突损伤和脱髓鞘的任何损伤。在一个实施方案中，相关神经组织损伤是创伤性脑损伤(TBI)。TBI是一种获得性脑损伤，发生在突然的创伤引起大脑受损时。当头部突然猛烈撞击物体，或当物体刺穿头骨并进入脑组织时，就会导致TBI。

在另一个实施方案中，用于治疗与SCI或相关神经组织损伤相关的继发性效应的化合物或化合物的组合用于治疗SCI诱导的水肿或神经性疼痛(NP)。

合适地，化合物或化合物的组合用于治疗神经性疼痛。合适地，化合物或化合物的组合抑制SCI或相关神经组织损伤后的促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和/或Il-6。合适地，化合物或化合物的组合抑制SCI或相关神经组织损伤后的促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和/或Il-6至少10％、20％、30％、40％、50％、60％70％、80％或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，促炎性疼痛标志物的抑制是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者中的水平。

合适地，化合物或化合物的组合用于治疗SCI诱导的水肿。合适地，化合物或化合物的组合使SCI诱导的水肿减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，减少是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者的水肿。

与SCI或相关神经组织损伤有关的其他继发性效应包括减少BSCB分解和SCI病变部位的瘢痕形成、保存长期(神经)功能、治疗伤口、预防瘢痕形成(包括与核心蛋白聚糖的组合治疗)，和/或促进轴突再生。

合适地，化合物或化合物的组合用于治疗CNS中的瘢痕形成。合适地，化合物或化合物的组合使瘢痕相关的Sema-3A和CS-56的沉积减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，减少是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者的瘢痕形成。

合适地，化合物或化合物的组合用于抑制血源性细胞浸润到CNS中。合适地，化合物或化合物的组合使血源性细胞，诸如单核细胞、中性粒细胞、粒细胞、巨噬细胞和/或自然杀伤细胞减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，减少是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者的血源性细胞浸润。

可以通过使用选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合来治疗的其他病状的实例包括但不限于高血压(high blood pressure或hypertension)、阿尔茨海默病、亨延顿病、癫痫、肝硬化和中风。在一个实施方案中，病状为中风。

阿尔茨海默病、SCI、水肿和中风可以通过MRI进行监测，因此这些病状的改善将导致脑中高信号区域的减少。结果之后还可进行运动和感觉功能的神经学评估，监测神经学改善，例如，通过测量反射、肌张力、感觉和改善的精神状态。例如通过MRI测量的改进，诸如25％-50％，例如30％，对患者很重要。

在另一个实施方案中，提供了化合物或化合物的组合在制备用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的药物中的用途，包括在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。

在另一个实施方案中，提供了一种在需要此类治疗的患者中用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。在一个实施方案中，相关神经组织损伤是创伤性脑损伤(TBI)。

在另一个实施方案中，提供了用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的治疗成套试剂盒(kit of parts)，包含：

(i)在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合，和

(ii)用于教导将所述化合物或化合物的组合施用于需要此类治疗的患者的指导材料。

本文所述的用途和方法也可预防性地使用，例如与脑或脊柱手术相关。

在另一个实施方案中，提供了选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合，用于治疗神经性疼痛。

在另一个实施方案中，提供了化合物或化合物的组合在制备用于治疗神经性疼痛的药物中的用途，包括选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。

在另一个实施方案中，提供了一种在需要此类治疗的患者中用于治疗神经性疼痛的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。

在另一个实施方案中，提供了用于治疗神经性疼痛的治疗成套试剂盒，包含

(i)在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合，和

(ii)用于教导将所述化合物或化合物的组合施用于需要此类治疗的患者的指导材料。

在一个实施方案中，提供了一种用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的方法，包括在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达。

在一个实施方案中，提供了一种用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。

在一个实施方案中，与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应是SCI诱导的水肿和/或神经性疼痛(NP)。

合适地，提供了一种用于治疗神经性疼痛的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。合适地，化合物或化合物的组合抑制SCI或相关神经组织损伤后的促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和/或Il-6。合适地，化合物或化合物的组合抑制SCI或相关神经组织损伤后的促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和/或Il-6至少10％、20％、30％、40％、50％、60％70％、80％或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，促炎性疼痛标志物的抑制是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者中的水平。

合适地，提供了一种用于治疗SCI诱导的水肿的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。合适地，化合物或化合物的组合使SCI诱导的水肿减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，减少是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者的水肿。

与SCI或相关神经组织损伤有关的其他继发性效应包括减少BSCB分解和SCI病变部位的瘢痕形成、保存长期(神经)功能、治疗伤口、预防瘢痕形成(包括与核心蛋白聚糖的组合治疗)，和/或促进轴突再生。

合适地，提供了一种用于治疗CNS中瘢痕形成的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。合适地，化合物或化合物的组合使瘢痕相关的Sema-3A和CS-56的沉积减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，减少是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者的瘢痕形成。

合适地，提供了一种用于抑制血源性细胞浸润到CNS中的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合。合适地，化合物或化合物的组合使血源性细胞，诸如单核细胞、中性粒细胞、粒细胞、巨噬细胞和/或自然杀伤细胞减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。方便地，化合物是AZD1236或其药学上可接受的盐。应当理解，减少是相对于用化合物或化合物的组合治疗之前受试者的血源性细胞浸润。

本文所述的用途和方法特别适用于治疗人类患者。

组合治疗

在特定的实施方案中，除了常规手术和/或其他化学疗法外，还可以使用本文定义的用于治疗脊髓损伤(SCI)或相关神经组织损伤或用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的化合物或化合物的组合。联合治疗中使用的其他化学疗法可包括一种或多种用于治疗SCI或相关神经组织损伤的药物活性剂，例如Lyrica(普瑞巴林)或甲泼尼龙。

此类联合治疗可以通过治疗的各个组分的同时、顺序或单独给药来实现。此类联合治疗采用本文所述剂量范围内的本公开的一种或多种化合物和批准剂量范围内的其他药物活性剂。

在本文中，在使用术语“联合治疗”的情况下，应当理解这是指同时、单独或顺序施用。在一个方面，“联合治疗”是指同时施用。在另一个方面，“联合治疗”是指单独施用。在又一个方面，“联合治疗”是指顺序施用。当施用是顺序的或单独的情况下，第二组分施用的延迟不应失去组合的有益作用。

根据另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含联合治疗的所有组分，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。

在另一个实施方案中，提供了如本文所述使用的一种或多种化合物，其中所述使用还包括施用一种或多种水通道蛋白-4抑制剂，诸如TFP、PKAi或TGN-020。

在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗与SCI或相关神经组织损伤有关的继发性效应的方法，包括在此类SCI或相关神经组织损伤后选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达，其中所述方法还包括施用一种或多种水通道蛋白-4抑制剂，诸如TFP、PKAi或TGN-020。

根据另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含联合治疗的所有组分，包括一种或多种水通道蛋白-4抑制剂，以及药学上可接受的稀释剂或载剂。

施用途径

选择性地抑制基质金属蛋白酶MMP-9(明胶酶-B)和金属弹性蛋白酶MMP-12两者的活性或表达的化合物或化合物的组合，或包含所述一种或多种化合物的药物组合物，或任何联合治疗，可以通过任何方便的施用途径向受试者施用，无论是全身施用、外周施用、局部施用还是鞘内施用(即在所需作用部位)。

施用途径包括但不限于，口服(例如通过摄食)；经颊；舌下；透皮(包括例如通过贴片、敷贴等)；经粘膜(包括例如通过贴片、敷贴等)；鼻内(例如通过鼻喷剂)；经眼(例如通过滴眼剂)；经肺(例如通过使用例如经气雾剂例如通过嘴或鼻吸入或吹入治疗)；经直肠(例如通过栓剂或灌肠剂)；经阴道(例如通过子宫栓)；胃肠外，例如通过注射，包括皮下、真皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、心室内、囊内、囊下、眼眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过植入储留槽或贮器，例如在皮下或肌肉内。

在特定实施方案中，提供口服或鞘内递送，特别是鞘内递送。此类鞘内递送可以使用口服使用所需剂量的1/10至1/50(例如，1/20至1/60)，特别是在SCI或相关神经组织损伤后引起相同有益作用的口服剂量的1/40。例如，如果使用口服剂量为200mg/kg，那么鞘内递送可以使用5mg/kg的剂量。合适地，化合物或化合物的组合通过留置的鞘内导管鞘内递送。

在另一个实施方案中，提供施用最多一周或两周的时间段，特别是短持续时间，例如在SCI或相关神经组织损伤后的最多前3天，或一天。

在一个实施方案中，在治疗开始时以一个剂量提供施用。在另一个实施方案中，在治疗期间连续提供施用，例如通过输注。

实施例

提供以下实施例用于说明但不限制本公开。

动物

所有动物实验均获得英国内政部授权，并获得伯明翰大学动物和伦理审查委员会的伦理批准。实验严格按照1986年英国动物科学程序法和修订后的欧洲指令的指导方针1010/63/EU进行，并且符合欧洲实验动物科学协会联合会和动物研究：体内实验报告(ARRIVE指南)的动物使用指南和建议。

将野生型成年雄性/雌性C57BL/6小鼠(比例大致相等)，7-9周龄，且体重在20-30g之间和雄性/雌性Sprague-Dawley大鼠(比例大致相等)，6-8周龄，并且体重在170-220g之间(购自Charles River，Margate，UK)，保持在温度和湿度受控的无病原体设施中的12小时明亮/黑暗循环环境下，并自由采食。

研究设计

一般来说，所有实验都是用n＝6只动物/组进行的，并且在2-3个独立的场合重复(总共n＝12-18只动物/组)。在此研究期间，没有动物因任何原因被排除在外。将所有动物随机分配到不同的实验组，确保每个实验组中每个动物笼子具有等效代表性。所有的治疗和实验条件也是研究人员不知情的。

AZD1236通过口服或鞘内注射递送。

实施例1

AZD1236在小鼠SCI背柱(DC)挤压和夹压(CC)模型中的测试

选择SCI的DC挤压模型是因为它是横切下行皮质脊髓束和上行感觉纤细束和楔形束的中等严重程度的损伤；其轴突分别来源于对侧额叶运动新皮层的V层和同侧背根神经节神经元(DRGN)的锥体运动神经元。小鼠DC病变后的损伤反应先前已被表征(Z.Ahmed，D.Bansal，K.Tizzard，S.Surey，M.Esmaeili，A.M.Gonzalez，M.Berry，A.Logan，Decorinblocks scarring and cystic cavitation in acute and induces scar dissolutionin chronic spinal cord wounds.Neurobiol Dis 64，163-176(2014))，并且其他人已经证明，它是用于分析再生结果的良好模型。然而，此模型仅显示手术后最初几个小时内对疼痛的损伤后敏感性，并且不能用于评估疼痛行为(S.Surey，M.Berry，A.Logan，R.Bicknell，Z.Ahmed，Differential cavitation，angiogenesis and wound-healing responses ininjured mouse and rat spinal cords.Neuroscience 275，62-80(2014))。因此，我们使用SCI的夹压(CC)模型(如下所述)来评估用AZD1236治疗后的疼痛行为。

体内实验

对于口服递送AZD1236，将n＝6只成年雄性C57BL6小鼠/组(Charles River，Margate，UK)随机分配至：(1)假(对照；部分椎板切除术但没有DC挤压损伤)；(2)DC挤压损伤+媒介物(部分椎板切除术，然后是DC挤压损伤和媒介物注射)；(3)DC挤压损伤+100mg/kgAZD1236；(4)DC挤压损伤+200mg/kg AZD1236；和(5)DC挤压损伤+300mg/kg AZD1236。对于鞘内(it)递送AZD1236，将成年雄性C57BL6小鼠(25-30g)(Charles River，Margate，UK)随机分配至：(1)假(对照；部分椎板切除术但没有DC挤压损伤)；(2)DC挤压损伤+媒介物(部分椎板切除术，然后是DC挤压损伤和媒介物注射)；(3)DC挤压损伤+2.5mg/kg AZD1236；(4)DC挤压损伤+5mg/kg AZD1236；和(5)DC挤压损伤+10mg/kg AZD1236。对于鞘内递送，将留置寰枕鞘内导管插入鞘内空间，如前所述(F.A.Oladosu，B.P.Ciszek，S.C.O′Buckley，A.G.Nackley，Novel intrathecal and subcutaneous catheter delivery systems inthe mouse.JNeurosci Methods 264，119-128(2016))。简而言之，小鼠在胸骨卧位时，在颈背处做一个小切口，然后剥离枕骨外嵴两侧的肌肉以暴露A-O膜。切开膜，将6cm Alzet小鼠鞘内导管(Alzet，Cupertino，CA，USA)和聚氨酯片段轻轻引导至鞘内空间2.5cm。使用4-0丝线缝合线(Oasis Medical，IL)固定导管，并且导管的暴露端用不锈钢塞密封并固定到上背部。向动物立即注射媒介物或AZD1236，然后是10μl PBS导管冲洗。在损伤后的前3天，每天重复注射两次，并使用Hamilton微升注射器(Hamilton Co，USA)在1分钟的时间段内递送药物和媒介物试剂。还使用没有外科手术的指定的完整动物。所有病变均在5％异氟烷诱导的吸入麻醉，与1.5l/min O

如前所述，在T8脊椎水平双侧实施DC挤压损伤(S.Surey，M.Berry，A.Logan，R.Bicknell，Z.Ahmed，Differential cavitation，angiogenesis and wound-healingresponses in injured mouse and rat spinal cords.Neuroscience 275，62-80(2014)；M.L.Read，S.Mir，R.Spice，R.J.Seabright，E.L.Suggate，Z.Ahmed，M.Berry，A.Logan，Profiling RNA interference(RNAi)-mediated toxicity in neural cultures foreffective shorr interfering RNA design.J Gene Med 11，523-534(2009))。简而言之，经过校准的制表钳在小鼠中间隔0.5mm并通过脊髓背侧脑膜插入至深度为0.45mm，在大鼠中间隔1mm并通过脊髓背侧脑膜插入至深度为1.0mm，并且DC被挤压3秒。AZD1236或媒介物通过口服灌胃或鞘内每天施用两次，在损伤后的前3天或24小时内立即施用，并且每天治疗两次直至第4天(即AZD1236给药的第3天)。所有实验都是用n＝6只小鼠/组进行的，并且在2-3个独立的场合重复(总共＝12-18只动物/组/测试)。

在通过椎板切除术暴露T6-T9后，在T7-T8脊椎水平实施CC SCI。动脉瘤夹施加器朝向双侧方向，并在硬膜外施加24g闭合力的动脉瘤夹60秒，如前所述(A.S.Rivlin，C.H.Tator，Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acutecord injury model in the rat.Surg Neurol 10，38-43(1978)：E.Esposito，I.Paterniti，E.Mazzon，T.Genovese，M.Galuppo，R.Meli，P.Bramanti，S.Cuzzocrea，MK801attenuates secondary injury in a mouse experimental compression model ofspinal cord trauma.BMC Neurosci 12，31(2011))。

每天两次手动排空膀胱直至膀胱功能恢复。将成年雄性C57BL6小鼠(25-30g)(Charles River，Margate，UK)随机分配到：(1)假(对照；椎板切除术但没有CC SCI)；(2)CCSCI+媒介物；(3)CC SCI+200mg/kg AZD1236(口服)；(4)CC SCI+5mg/kg AZD1236(it)。所有实验都是用n＝6只小鼠/组进行的，并且在3个独立的场合重复(总共＝18只小鼠/组/测试)。

还评估了口服AZD3342在成年Sprague-Dawley大鼠DC损伤模型中的功效。将动物分成6组：(1)假(对照)；(2)DC挤压损伤+媒介物；(3)DC挤压损伤+15mg/kg AZD3342；(4)DC挤压损伤+75mg/kg AZD1236；(5)DC挤压损伤+375mg/kg AZD3342；和(6)DC挤压损伤+褪黑激素。动物每天用口服AZD3342或媒介物给药两次，实验者对治疗条件不知情。这些实验都是用n＝6只大鼠/组进行的，并且在2-3个独立的场合重复(总共n＝12-18只大鼠/组/测试)。

所有工具和临床相关的MMP抑制剂都在我们的损伤模型中递送和预优化，如下表所示：

表1.此研究中使用的MMP抑制剂浓度。除非提及，否则所有剂量均已在本研究中进行了测试。IP＝腹膜内注射，It＝鞘内注射，SC＝皮下注射。Sur1调节的NCCa-ATP＝磺酰脲类受体1调节的NC

1.Noble，L.J.，Donovan，F.，Igarashi，T.，Goussev，S.&Werb，Z.J Neurosci 22，7526-7535(2002)。

2.Cui，J.等人Mol Neurodegener 7，21(2012)。

3.Gao，M.等人ACS Chem Neurosci 7，1482-1487(2016)。

4.Li，C.等人Neural Regen Res9，2205-2210(2014)。

5.Wells，J.E.，Hurlbert，R.J.，Fehlings，M.G.&Yong，V.W.Brain 126，1628-1637(2003)。

6.Caglar，Y.S.等人World Neurosurg 114，e247-e253(2018)。

7.Simard，J.M.等人Exp Neurol 233，566-574(2012)。

轴突的霍乱毒素B标记

为进行轴突的逆行追踪，在大腿中部水平暴露后，使用玻璃微针将1％霍乱毒素B(CTB)(#104，List Biologicals Laboratories，Campbell，CA，USA)注射到坐骨神经中。重新缝合皮肤并让动物恢复1周，然后使用升高浓度的CO

SCI诱导的水肿的量化

在DC和CC SCI后3天切出小鼠病变部位+3mm(两侧)和大鼠DC模型的病变部位+5mm(两侧)，并测定脊髓含水量(作为水肿的量度)，如前所述(S.Li，C.H.Tator，Effects ofMK801 on evoked potentials，spinal cord blood flow and cord edema in acutespinal cord injury in rats.Spinal Cord 37，820-832(1999))。将含有病变部位的脊髓在铝箔上称重，在105℃下干燥24小时，然后重新称重。含水量百分比计算如下：含水量(％)＝[(湿重-干重)/湿重]x 100％。

定量RT-PCR(qRT-PCR)

切出病变部位+5mm(两侧)(DC和CC SCI，n＝6只小鼠/大鼠/组，2次独立重复(总共n＝12只小鼠/大鼠/组))并在液态N2中快速冷冻，储存在-80℃下直至需要。根据制造商的说明(Invitrogen)，在有或没有使用TRIzol试剂的治疗的情况下，在损伤后的适当时间点从脊髓中提取总RNA。使用来自从提取的mRNA制备的互补DNA的预先验证的小鼠引物序列测定MMP-9、MMP-12、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平中，并使用LightCycler PCR仪(Roche，Burgess Hill，UK)进行qRT-PCR(M.L.Read，S.Mir，R.Spice，R.J.Seabright，E.L.Suggate，Z.Ahmed，M.Berry，A.Logan，Profiling RNA interference(RNAi)-mediated toxicity inneural cultures for effective short interfering RNA design.J Gene Med 11，523-534(2009))。

小鼠的引物序列包括：MMP-9-目录号4331182，Mm0044299_m1；MMP-12-目录号4331182，Mm00500554_m1；IL-1β-目录号4331182，Mm00434228_m1；TNF-α-目录号4331182，Mm00443258_m1；和IL-6-目录号4331182，Mm00446190_m1；大鼠的引物序列包括：MMP-9-目录号4331182，Rn00579162_m1；MMP-12-目录号4331182，Rn00588640_m1；IL-1β-目录号4331182，Rn00580432_m1；TNF-α-目录号4331182，Rn01525859_g1；和IL-6-目录号4881182，Rn01410330_m1(全部来自ThermoFisher Scientific，Leicestershire，UK)。使用ΔΔCt方法计算倍数变化(M.L.Read，S.Mir，R.Spice，R.J.Seabright，E.L.Suggate，Z.Ahmed，M.Berry，A.Logan，Profiling RNA interference(RNAi)-mediated toxicity in neuralcultures for effective shorr interfering RNA design.J Gene Med 11，523-534(2009)。

检测脊髓中的MMP-9和MMP-12水平

切出小鼠(DC和CC SCI)的病变部位+3mm(两侧)(n＝6只小鼠/大鼠/组，2次独立重复，总共n＝12只小鼠/大鼠/组)并在液态N

检测MMP-9和MMP-12酶活性

切出小鼠(DC和CC SCI)的病变部位+3mm(两侧)和大鼠的损伤部位+5mm(两侧)(n＝6只小鼠/大鼠/组，2次独立重复，总共n＝12只小鼠/大鼠/组)并在液态N2中快速冷冻，储存在-80℃下直至需要。根据制造商的说明(AnaSpec，Fremont，CA，USA)，使用SensoLyte520MMP-9和MMP-12荧光测定试剂盒在96孔板中测定MMP-9和MMP-12的酶活性。使用SynergyH1酶标仪(BioTek UK，Swindon，UK)在Ex/Em＝490/520nm时测量荧光强度。

原位酶谱法，然后进行星形胶质细胞定位

用温PBS通过CO

简而言之，在冰冻切片机上切下15μm厚的未固定冷冻脊髓纵向切片，并在25℃下，在50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、5mM CaCl

免疫组织化学

通过暴露于升高浓度的CO

在损伤后3天，使用脊髓中的白蛋白免疫反应性评估BSCB的完整性，作为BSCB破坏的替代标志物。将切片在室温下解冻并在PBS中洗涤，然后在H

如前所述进行荧光免疫组织化学(S.Surey，M.Berry，A.Logan，R.Bicknell，Z.Ahmed，Differential cavitation，angiogenesis and wound-healing responses ininjured mouse and rat spinal cords.Neuroscience 275，62-80(2014))。简而言之，将纵向脊髓切片在PBS中洗涤，然后在含有1％(体积/体积)Triton X-100(Sigma)的PBS中孵育以透化细胞。然后在室温(RT)下使用含有0.05％(重量/体积)牛血清白蛋白(Sigma，Poole，UK)和0.05％Tween-20(Sigma)的PBS封闭切片30min，并在4℃下在含有适当抗体的加湿室中孵育过夜。在DC损伤和治疗后4周使用兔多克隆抗层粘连蛋白一抗(ab11575；1∶400稀释，Abcam)检测层粘连蛋白。用兔多克隆抗CD68抗体(ab1525212；1∶500稀释，Abcam)检测巨噬细胞；使用针对CD11b的兔多克隆抗体(ab128797，1∶500稀释，Abcam)检测微凝胶；使用多克隆抗GFAP抗体(SAB5700611，1∶400稀释，Sigma)检测GFAP，全部在DC损伤和治疗后10天被检测到。在损伤后7天使用单克隆抗CS-56抗体(C8035；1∶200稀释，Sigma)检测到脑信号蛋白-3A(Sema-3A)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)。选择此时间点是因为许多研究表明在损伤后7天在病变部位周围观察到CSPG(例如Tang X，Davies JE，Davies SJ.Changes indistribution，cell associations，and protein expression levels of NG2，neurocan，phosphacan，brevican，versican V2，and tenascin-C during acute to chronicmaturation of spinal cord scar tissue.J Neurosci Res 2003；71(3)：427-44；)。在DC损伤后6周使用山羊多克隆抗CTB抗体(#703；1∶1000稀释，List Biological Labs)检测到小鼠中CTB标记的轴突。

然后将切片在PBS中洗涤，然后在室温下与Alexa488和Alex595缀合的二抗(全部1∶400稀释使用；Invitrogen)孵育1h。然后将切片在PBS中洗涤，并使用Vectashield安装介质(含有DAPI)(Vector Laboratories，Peterborough，UK)安装盖玻片。

每次运行都包括阴性对照，其中省略了一抗，并且在图像捕获之前使用这些载玻片设置背景阈值水平。使用配备AxioCam HRc和Axiovision软件(均来自Zeiss，Hertfordshire，UK)的Axioplan 2荧光显微镜观察切片(荧光和DAB染色)。

免疫荧光定量

所有分析均由对实验组不知情的研究人员进行。如前所述通过图像分析计算相对荧光染色强度(Surey S，Berry M，Logan A，Bicknell R，Ahmed Z.Differentialcavitation，angiogenesis and wound-healing responses in injured mouse and ratspinal cords.Neuroscience 2014；275：62-80)。简而言之，对每种抗体使用相同的标准化曝光设置在5倍放大倍数下拍摄的显微照片进行阈值处理，并使用ImageJ(NIH，USA)记录来自n＝12只小鼠/抗体的每种抗体的像素/单位面积的平均积分强度。

由每只小鼠的整个组织系列的矢状脊髓切片量化DC轴突再生(总共n＝12只小鼠/组)。使用ImageJ软件在距损伤中心设定距离处量化CTB强度，并表示为尾部比损伤部位的CTB强度百分比，以控制追踪效率的变化。

原代小胶质细胞培养和治疗

根据先前所述的方案制备来自6-8周龄C57BL/6小鼠大脑的原代小鼠小胶质细胞(Moussaud S，Draheim HJ.A new method to isolate microglia from adult mice andculture them for an extended period of time.J Neurosci Methods 2010；187(2)：243-53)。简而言之，切出大脑的脑膜，切碎使用20单位/ml木瓜蛋白酶(全部来自Sigma)酶促消化。在37℃孵育90min后，将悬浮液以200g离心7min，并将沉淀重悬于0.5mg/ml DNA酶I(Roche，Manheim，Germany)中并用直径递减的火焰抛光巴斯德移液器研磨。然后将匀浆通过70μm细胞过滤器(Beckton Dickinson，Watford，UK)过滤，并通过Percoll(GEHealthcare，Amersham，UK)梯度离心。最后将细胞悬浮液重悬于补充有10％FBS(全部来自Invitrogen)和5ng/ml粒细胞集落和巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)的DMEM/F12培养基(#415-ML，R&D Systems.Watford，UK)中，铺在预涂有聚L-赖氨酸的T75细胞培养瓶(BecktonDickinson)中，并保持在37℃和5％CO

小胶质细胞用于体外年龄在15至20体外天数(DIV)的所有实验，并以3x 10

测定细胞因子水平的ELISA

遵循制造商的说明，使用来自R&D Systems的市售试剂盒测定TNF-α(#MTA00B)、IL-1β(#MLB00C)和IL-6(#M6000B)。

细胞培养

在补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg两性霉素B的DMEM中培养J774A.1细胞(#TIB-67；ATCC，Middlesex，UK)。将细胞接种在T75组织培养瓶中并保持在37℃和5％CO

腹膜巨噬细胞制备

驻留腹膜细胞是通过使用21G针头将10ml PBS注射到腹膜腔并收获细胞悬浮液从成年C57BL/6小鼠(6-8周龄)收获的，如前所述(Rosas M，Davies LC，Giles PJ，Liao CT，Kharfan B，Stone TC等人The transcription factor Gata6 links tissue macrophagephenotype and proliferative renewal.Science 2014；344(6184)：645-8)。然后将腹膜细胞以100x g离心10min，并将细胞沉淀重悬于DMEM/F12培养基中。将细胞在37℃下孵育2h，并通过温和洗涤去除非贴壁细胞。细胞在含有10％FBS的DMEM/F12培养基中扩增。对于迁移测定，细胞在含有0.02％BSA的RPMI中生长24h以获得静止期细胞，然后在Transwell迁移测定中使用它们，如下所述。

Transwell迁移测定

如前所述(Green等人，2012)，在具有8μm孔插入物的6.5mm Transwell板(ThermoFisher)中用J774A.1、RAW 264.7和原代小鼠腹腔巨噬细胞进行迁移测定。简而言之，将插入物用鼠尾I型胶原蛋白包被，并在有或没有已知的趋化因子MCP-1(100ng/ml)和PMA(100nM)，或AZD1236、GM6001、SD2590和MMP-9抑制剂I(均以1、10、100、1000ng/ml使用)添加到下室的情况下，将1x 10

电生理学

在DC损伤和治疗后6周记录复合动作电位(CAP)，如前所述-例如B.C.Hains，C.Y.Saab，A.C.Lo，S.G.Waxman，Sodium channel blockade with phenytoin protectsspinal cord axons，enhances axonal conduction，and improves functional motorrecovery aner contusion SCI.Exp Neurol 188，365-377(2004)。

简而言之，实验人员对动物的治疗状态不知情，并在人为刺激后的负偏转和波的下一个峰值之间计算CAP幅值。CAP面积也通过整流CAP组件(全波整流)并测量其面积来计算。为了确认我们的记录并且不记录CAP，在刺激电极和记录电极之间的每次实验后，将脊髓的背侧一半横切。

功能测试

DC病变和治疗后的功能测试如前所述进行(N.D.Fagoe，C.L.Attwell，R.Eggers，L.Tuinenbreijer，D.Kouwenhoven，J.Verhaagen，M.R.Mason，Evaluation of Five Testsfor Sensitivity to Functional Deficits following Cervical or Thoracic DorsalColumn Transection in the Rat.PLoS One 11，e0150141(2016))。

简而言之，在功能测试之前，动物(n＝18只/组)首先接受培训1周以掌握横穿水平梯子的能力。通过在损伤前2-3天进行测试来建立基线参数。然后在DC损伤+治疗后2天、1周、2周、3周、4周、5周和6周测试动物。由对治疗条件不知情的观察人员以相同的顺序和一天中的时间进行实验，每个测试进行3次单独试验。

水平梯子测试；这测试动物的运动功能，在长0.9米，直径为15.5cm并且有3.5-5.0cm可变间距的随机可调梯级的水平梯子上进行。评估动物横穿梯子的情况，并记录左右后爪打滑以及总步数和平均错误率：打滑数/总步数。

胶带去除测试(感觉功能)；胶带去除测试测定左后爪的接触感知。在握住动物两个伸出的后爪后，记录动物检测到并取下贴在左后爪掌上的15x15mm胶带(Kip Hochkrepp，Bocholt，Germany)所花费的时间并用于计算平均感觉时间。

评估神经性疼痛(NP)

使用由对治疗条件不知情的实验人员施加在后爪跖面的一系列von Frey细丝(0.25g-15g)测量小鼠的机械痛觉异常，并将爪子的缩回记录为阳性反应(F.Nasirinezhad，S.Gajavelli，B.Priddy，S.Jergova，J.Zadina，J.Sagen，Viral vectorsencoding endomorphins and serine histogranin attenuate neuropathic painsymptoms after spinal cord injury in rats.Mol Pain 11，2(2015))。

记录了引发缩爪反应所需的最低力的毛发。测试两只后爪，在测试对侧爪子之间休息5min。

使用先前描述的足底热敏感测试的已建立方法测试热痛觉过敏(S.Surey，M.Berry，A.Logan，R.Bicknell，Z.Ahmed，Differential cavitation，angiogenesis andwound-healing responses in injured mouse and rat spinal cords.Neuroscience275，62-80(2014))。简而言之，在损伤后手术前，动物在透明的有机玻璃隔间中适应环境，并在一天的同一时间收集治疗数据以确保一致性。在测试开始前，动物也适应透明有机玻璃隔间5min。一旦动物静止，就将红外热源(Harvard Apparatus，Kent，UK)施加在后肢的足底表面。在对同一只爪子进行重新测试之前，对每个后肢以30s的间隔进行五次单独测试，记录缩爪的反应时间。对后肢的中间三个分数进行平均以产生每只动物的单一分数。

冷痛觉异常由对治疗条件不知情的实验人员测量为在爪子足底表面滴加丙酮后缩足反应的次数(F.Nasirinezhad，S.Gajavelli，B.Priddy，S.Jergova，J.Zadina，J.Sagen，Viral vectors encoding endomorphins and serine histogranin attenuateneuropathic pain symptoms after spinal cord injury in rats.Mol Pain 11，2(2015))。测试重复五次，每次测试之间间隔5min，并且对丙酮的响应频率表示为响应频率百分比([缩爪次数/试验次数]x 100)。

统计学分析

统计显著性是通过使用SPSS Statistics 19(IBM，New York，USA)用单向方差分析(ANOVA)与事后Dunnett方法从样品平均值计算的。对于水平梯子跨越和胶带去除测试，如前所述分析数据(Tuxworth RIT，M.J.；Anduaga，A-M.；Hussien-Ali，A.；Chatzimatthaiou，S.；Longland，J.；Thompson，A.M.；Almutiri，S.；Alifragis，P.；Kyriacou，C.P.；Kysela，B.；Ahmed，Z.Attenuating the DNA damage response todouble-strand breaks restores function in models of CNSneurodegeneration.Brain Communications 2019；1(1)：fcz005)using R package(

简而言之，对于梯子跨越测试，使用二项式广义线性混合模型(GLMM)比较了病变动物和假治疗动物的整个时间过程。在R中使用具有glmer函数的包lme4填入二项式GLMM。然后使用参数引导程序计算P值。对于胶带去除测试，线性混合模型(LMM)是通过在R中用Kenward-Roger方法使用包pbkrtest进行模型比较计算的，(N.D.Fagoe，C.L.Attwell，R.Eggers，L.Tuinenbreijer，D.Kouwenhoven，J.Verhaagen，M.R.Mason，Evaluation ofFive Tests for Sensitivity to Functional Deficits following Cervical orThoracic Dorsal Column Transection in the Rat.PLoS One 11，e0150141(2016)。

对于疼痛行为测试，使用双向ANOVA与重复测量组间比较数据，然后进行Bonferroni事后检验。

所有结果均以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示，并且图中的误差棒代表SEM。

结果

MMP-9和MMP-12在DC损伤后急剧上调

研究了SCI小鼠模型中MMP-9和MMP-12的时空表达模式，其中背柱(DC)在胸(T)8水平双侧损伤(Surey S，Berry M，Logan A，Bicknell R，Ahmed Z.Differentialcavitation，angiogenesis and wound-healing responses in injured mouse and ratspinal cords.Neuroscience 2014；275：62-80)。

为了确认MMP-9和MMP-12损伤后升高的时间过程，使用了qRT-PCR。与人类SCI中的MMP-9的水平一致(Casha S，Rice T，Stirling DP，Silva C，Gnanapavan S，Giovannoni G等人Cerebrospinal Fluid Biomarkers in Human Spinal Cord Injury from a PhaseII Minocycline Trial.J Neurotrauma 2018；35(16)：1918-28)，与假治疗的小鼠相比，小鼠中的MMP-9 mRNA在损伤后1小时内也上调了1.9倍，并在24小时达到峰值，上升至4.8倍(图1A)。MMP-9水平此后下降，并在DC损伤后6天恢复到对照假治疗水平(图1A)。然而，MMP-12的水平直到DC损伤后3天才升高，在5天达到峰值，此时MMP-12水平与假治疗小鼠相比高11.5倍(图1B)。MMP-12水平在DC损伤后6天下降(图1B)。MMP-9(图1C)和MMP-12(图1D)的蛋白质水平反映了它们的mRNA水平，而这些酶的相对活性(图1E和图1F)与它们的表达水平随时间的变化相关。这些结果证明，MMP-9和MMP-12两者的mRNA蛋白水平和酶活性均在损伤后的前5天内达到峰值，然后下降。

AZD1236有效抑制脊髓、血清和CSF中的MMP-9和MMP-12活性

测定DC损伤和AZD1236给药后血清和CSF中MMP-9和MMP-12活性的水平。在口服递送AZD1236(200mg/kg剂量)后，MMP-9和MMP-12活性分别在血清中被抑制了90±2％和90±3％(图2A和图2E)并且在CSF中被抑制74±2％和69±3％(图2B和图2E)。鞘内递送后，MMP-9和MMP-12活性分别在血清中被抑制了71±2％和71±1％(图2C和图2E)并且在CSF中被抑制了88±2％和90±1％(图2D和图2E)。这些结果证明AZD1236的最低最有效剂量是200mg/kg(通过口服施用)和5mg/kg(通过鞘内注射)。在脊髓中，MMP-9和MMP-12活性在假治疗脊髓中几乎检测不到(图2F)，然而，DC损伤引起MMP-9和MMP-12活性分别增加98±2％和95±2％(图2F)。在口服和鞘内递送后，AZD1236的最低最有效剂量分别将脊髓组织中的MMP-9活性抑制88±4％和87±5％并将MMP-12活性抑制85±3％和86±4％(图2F)。

此外，DC损伤脊髓切片的原位酶谱(Ahmed Z，Dent RG，Leadbeater WE，Smith C，Berry M，Logan A.Matrix metalloproteases：degradation of the inhibitoryenvironment of the transected optic nerve and the scar by regeneratingaxons.Mol Cell Neurosci 2005；28：64-78)证实在病变部位(*)附近的脊髓中DC损伤诱导的明胶酶活性(绿色；箭头)被口服和鞘内施用的AZD1236完全抑制(图2G)。总之，这些数据证明，口服或鞘内递送的AZD1236可显著抑制DC损伤诱导的MMP-9和MMP-12活性。

用AZD1236治疗可降低DC损伤诱导的含水量(水肿)

研究了抑制MMP-9和MMP-12活性的早期升高是否可以减少脊髓中DC损伤诱导的水积聚。DC损伤引起平均脊髓含水量从71.0±1.0显著增加至78.4±1.5％，在第3天达到峰值，然后下降(图3A)。每天两次口服递送临床相关剂量的AZD1236引起脊髓水的剂量依赖性减少，200mg/kg和300mg/kg时降低至假治疗水平(图3B)。鞘内递送AZD1236也显示出类似的脊髓含水量剂量依赖性降低，尽管所需的剂量为引起与口服递送相同的降低所需的剂量的1/40(图3C)。因此，用5.0和10.0mg/kg AZD1236将DC损伤诱导的脊髓含水量增加减少至假治疗水平(图3C)。这些结果证明AZD1236通过口服和鞘内递送抑制DC损伤诱导的水肿，鞘内递送仅需要口服剂量的1/40。

然后确定SCI诱导的水肿的减弱是否依赖于MMP-9或MMP-12的特异性抑制。单独或组合使用工具抑制剂(MMP-9抑制剂I和MMP408)显示要完全阻止SCI诱导的水肿，需要组合抑制MMP-9和MMP-12，并且单独抑制MMP-9或MMP-12提供了次优的治疗益处(图3D)。总之，这些结果显示AZD1236抑制SCI诱导的水肿，并且需要特异性抑制MMP-9和MMP-12两者以有效阻止SCI诱导的水肿。

与其他MMP抑制剂相比，CNS水肿被AZD1236更有效地消除，并且依赖于MMP-9和MMP-12两者的特异性抑制

我们将口服递送AZD1236与其他已发表的临床和工具MMP抑制剂(指定剂量和途径-表1)进行了比较。工具抑制剂包括GM6001(IC50＝200pM)(图4A)、SB-CT(IC50＝400nM)(图4B)、MMP-9抑制剂I(IC50＝5nM)(图4C)、SD2590(IC50＝0.18nM)(图4D)和ND378(图4E)。

GM6001是一种广谱MMP抑制剂，也称为加拉定(Galardin)或伊洛马司他(Ilomastat)，并且具有化学名称(2R)-N

SB-3CT是一种选择性MMP-2抑制剂，并且具有化学名称2-[[(4-苯氧基苯基)磺酰基]甲基]硫氯丙烷。它是可商购获得的，例如来自Tocris。

SD2590是一种有效的MMP抑制剂，并且具有化学名称N-羟基-1-(2-甲氧基乙基)-4-[4-[4-(三氟甲氧基)苯氧基]苯基]磺酰基]-4-哌啶甲酰胺盐酸盐。它是可商购获得的，例如来自Tocris。

抑制剂I是一种MMP-9抑制剂(参考CAS 1177749-58-4)并且可商购获得，例如来自Sigma-Aldrich。

MMP408是一种MMP-12抑制剂(参考CAS 1258003-93-8)并且可商购获得，例如来自Sigma-Aldrich。

据报道可抑制MMP的临床级实验治疗剂包括米诺环素(IC50＝272μM)(图4F)、利鲁唑(图4G)、格列本脲(图4H)和褪黑激素(图4I)。我们的数据显示，虽然当与DC+媒介物治疗的大鼠(P＝0.05-0.01)相比时，褪黑激素、GM6001、MMP-9抑制剂I、SD2590、利鲁唑和格列本脲显著降低脊髓含水量，但AZD1236比这些化合物中的任何一种都有效得多(P＝0.0001，AZD1236与褪黑激素、GM6001、MMP-9抑制剂I、SD2590、利鲁唑和格列本脲)(图4J)。

AZD1236减弱促炎性疼痛标志物和疼痛的行为测量

促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和IL-6在DC损伤后3天均显著上调6-7倍(图5A和图5B)。然而，分别通过口服或鞘内递送200mg/kg和5mg/kg的AZD1236减弱了损伤诱导的这些疼痛标志物的升高，并将它们降低至假治疗水平(图5A和图5B)。这些结果证明AZD1236抑制SCI后的促炎性疼痛标志物。

DC模型是中等严重程度的SCI模型，虽然可以区分感觉和运动缺陷，但它不适合检测AZD1236对触觉、热和冷痛觉异常的影响。然而，夹压(CC)模型是一种严重的损伤，并且可用于评估这些动物的疼痛(Rivlin AS，Tator CH.Effect of duration of acute spinalcord compression in a new acute cord injury modelin the rat.Surg Neurol 1978；10(1)：38-43；Esposito E，Paterniti I，Mazzon E，Genovese T，Galuppo M，Meli R等人MK801 attenuates secondary injury in a mouse experimental compression modelof spinal cord trauma.BMC Neurosci 2011；12：31)。因此，采用SCI的CC模型来研究使用AZD1236抑制MMP-9和MMP-12是否会减弱触觉、热和冷痛觉异常。我们首先证实，用与DC损伤模型相同剂量的AZD1236治疗CC小鼠，在夹压模型中无论是通过口服还是鞘内注射，都会引起脊髓含水量、IL-1β、TNF-α和IL-6表达以及MMP-9/MMP-12活性(图6A-图6C)与在DC模型中看到的类似减弱。AZD1236对促炎标志物、脊髓含水量和MMP-9/MMP-12活性的抑制都显著改善(至＞80％假治疗对照)机械(图6D)、热(图6E)和冷(图6F)痛觉异常的测量。此外，AZD1236治疗的动物在机械、热和冷痛觉异常方面的改善显著好于那些用目前批准的神经性疼痛药物普瑞巴林和加巴喷丁治疗的动物(图6D-图6F)。与普瑞巴林和加巴喷丁相比，这些改善与AZD1236抑制促炎性疼痛标志物IL-1β、TNF-α和IL-6的卓越能力相关(图7)。这些结果表明AZD1236也可用于抑制SCI诱导的神经性疼痛，甚至可能比目前使用的止痛药更有效。

AZD1236保留CAP幅值并改善运动和感觉功能

在使用和不使用AZD1236治疗的情况下，通过电生理学测量脊髓病变部位的复合动作电位(CAP)，以确定AZD1236对脊髓含水量的抑制是否改善了DC损伤后的功能结果。

来自Spike2软件处理的假对照、DC+媒介物和DC+200mg/kg AZD1236的叠加代表性CAP迹线显示与假治疗对照相比，在DC+媒介物组中，负CAP波被消除(图8A)。然而，口服AZD1236治疗恢复了显著的CAP波(图8A)。实验结束时脊髓的背侧半切废除了所有动物的CAP迹线，并证实此实验在技术上是成功的。平均CAP幅值也在DC+媒介物治疗的组中消除，同时在所有刺激强度下的AZD1236治疗后观察到显著更大的CAP幅值(图8B)。同样，假治疗组的CAP面积(0.65±0.02mV x ms)减少至DC+媒介物治疗组的0.06±0.02mV x ms，但恢复到假处理对照组中观察到的80％(0.52±0.09mV x ms)(图8C)。DC病变部位电生理特性的这些改善转化为运动和感觉功能的显著改善(与假治疗动物相比好85％)。例如，在整个6周的时间段内，梯子跨越测试的平均误差率保持在0.15和0之间(图8D)。DC损伤后，平均误差率增加至0.59±0.06并且在整个6周时间段内保持显著缺陷(P＜0.0012，广义线性混合模型)。

然而，用AZD1236治疗改善了所有时间点的平均误差率，使得在损伤后2周，AZD1236治疗的动物有显著改善(P＜0.0001，独立样本t检验)并且无法与假治疗动物区分(图8D)。在DC+媒介物治疗的动物中，平均胶带感觉和去除时间也增加至77.8±5.0s(图8E)。与DC+媒介物治疗组相比，AZD1236治疗显著减少了平均胶带感觉和去除时间，显示出显著改善(P＜0.0001，独立样本t检验)，使得3周时，动物无法与假治疗组区分(图8E)。

与口服AZD1236递送相比，鞘内递送最低有效剂量的AZD1236也在CAP波、CAP幅值、CAP面积、平均误差率和平均胶带感觉和去除时间方面引起类似的显著改善(图9A-图9E)。

这些结果证明，使用AZD1236抑制MMP-9和MMP-12显著改善电生理、运动和感觉功能。这些结果还证明，在DC损伤后口服和鞘内递送AZD1236在电生理、运动和感觉功能方面引起类似的有益改善。

用AZD1236抑制MMP-9和MMP-12促进DC轴突再生和病变部位上方和下方轴突的保留

然后使用逆行示踪剂霍乱毒素B(CTB)标记病变部位的再生纤维研究DC轴突再生/萌生。在DC+媒介物治疗的小鼠中在病变部位(#)以外未观察到CTB标记的轴突(红色)(图10A)。然而，在DC+AZD1236治疗的小鼠中，观察到CTB

NF200

AZD1236比其他MMP抑制剂促进显著更多的DC轴突再生

还将用AZD1236治疗后CTB

延迟抑制MMP-9和MMP-12在DC损伤后也是有益的

由于可能需要几个小时才能为SCI患者建立准确的临床诊断和治疗方案，所以评估了在动物给药AZD1236之前临床相关的24h时间延迟。即使延迟24h，最佳剂量的AZD1236在抑制SCI诱导的含水量(图12A)、促炎细胞因子(图12B)和MMP-9和MMP-12的活性(图12C)以及改善脊髓背表面电位(图11D)、CAP幅值(图12E)、CAP面积(图12F)、运动功能(图12G)和感觉功能(图12H)方面与立即递送同样有效。此外，用AZD1236延迟24h治疗促进相同数量的CTB

这些结果证明AZD1236对SCI临床用途的巨大潜力，因为用AZD1236的治疗的临床相关时间延迟与立即治疗一样有效。

AZD1236(口服剂量)对MMP-9和MMP-12的抑制减弱了BSCB分解、瘢痕形成、小胶质细胞的激活和病变部位巨噬细胞的浸润

血脊髓屏障(BSCB)在功能上等同于血脑屏障(BBB)，并且负责为脊髓的细胞外成分提供专门的微环境(Bartanusz V，Jezova D，Alajajian B，Digicaylioglu M.Theblood-spinal cord barrier：morphology and clinical implications.Ann Neurol2011；70(2)：194-206)。SCI后BSCB受损，引起导致继发性损伤机制和永久性神经功能缺陷的进行性出血(Tran AP，Warren PM，Silver J.The Biology of Regeneration Failureand Success After Spinal Cord Injury.Physiol Rev 2018；98(2)：881-917)。在损伤和治疗后3天(或24h延迟组为4天)，使用脊髓中的白蛋白免疫反应性评估BSCB的完整性，作为BSCB破坏的替代标志物。

在整个病变部位(#)观察到显著的白蛋白免疫反应性(箭头)和损伤后3天切片中的周围脊髓实质；显示在DC+媒介物治疗组中，显著的BSCB分解在损伤后3天在整个脊髓的所有深度急剧发生(图14A和图14B)。然而，在损伤后立即口服AZD1236治疗和延迟24h治疗显著抑制此BSCB分解面积(箭头)，与DC+媒介物治疗组相比＞75％(P＜0.0001，ANOVA)，并且在接受24h延迟AZD1236治疗的组中＞73％(图14A和图14B)，证明防止BSCB分解。

同样，在DC损伤后4周，标定瘢痕组织细胞外基质的层粘连蛋白免疫反应性在病变部位(#)显示出大面积染色(箭头)，表示在DC+媒介物治疗的动物中存在明显的瘢痕形成(图14C和图14D)。在损伤后立即接受AZD1236(减弱＞80％，P＝0.0001，ANOVA)或24小时延迟治疗(减弱＞77％，P＝0.00011，ANOVA)的两组中仅存在低水平的层粘连蛋白免疫反应性(图14C和图14D)。

这些结果表明，在损伤后立即给药或损伤后24小时给药时，AZD1236抑制BSCB分解(急性)和病变部位瘢痕形成。

AZD1236治疗，无论是在损伤后立即治疗还是延迟24h治疗，都显著抑制了损伤和治疗后7天(或24小时延迟组为8天)病变部位Sema-3A((图14E和图14F)(减弱＞84％，P＝0.0001，ANOVA)和CS-56((图14G和图14H)(减弱＞81％，P＜0.0001，ANOVA))的免疫反应性，表明可以防止损伤部位瘢痕相关分子的沉积。此外，AZD1236治疗，无论是立即治疗还是延迟24h治疗，都减弱病变部位CD11b(图14I和图14J；插图i＝高倍盒区域视图显示小胶质细胞激活)、CD68(图14I和图14K；插图ii＝高倍盒区域视图显示巨噬细胞激活/浸润)和GFAP

这些结果表明，AZD1236治疗，无论是立即治疗还是延迟24h治疗，都同样且稳定地抑制了SCI诱导的BSCB分解、病变部位的瘢痕形成、巨噬细胞的浸润以及病变部位的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。

用AZD1236抑制MMP-9和MMP-12消除SCI的常见CSF生物标志物

CSF和血清中的生物标志物越来越多地用于根据SCI损伤的严重程度和损伤后恢复的可能性对损伤进行分层。分析了SCI后一些最常见的报告生物标志物，包括S100β、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、磷酸化神经丝重链(pNF-H)和神经丝轻链(NF-L)并比较了AZD1236治疗后它们的水平。S100β、NSE、GFAP、pNF-H和NF-L的水平在损伤后3天均显著升高(图15A-图15E)。用褪黑激素治疗略微降低了CSF中这些生物标志物的水平，而AZD1236无论是立即或延迟24h使用，在损伤后3天显著减弱所有这些生物标志物至接近假对照水平。这些结果表明AZD1236还有助于抑制SCI的常见生物标志物，这可用于临床监测SCI进展。

AZD1236抑制LPS诱导的小胶质细胞产生的细胞因子，但不影响巨噬细胞的体外迁移

为确定AZD1236对小胶质细胞激活和巨噬细胞迁移的影响，在使用和不使用AZD1236治疗的情况下，分离原代成年小鼠脑小胶质细胞并对其进行LPS激活，然后对TNF-α、IL-1β和IL-6进行ELISA。10ng/ml LPS分别刺激了196±15、21±4和1964±117pg/ml的TNF-α、IL-1β和IL-6的产生(图16A至图16C)。然而，LPS激活以及AZD1236浓度的增加引起这些细胞因子剂量依赖性减少，100ng/ml的AZD1236恢复其浓度至DMEM/F12培养基对照水平(图16A至图16C)。尽管存在激活小神经胶质细胞的LPS，但增加AZD1236浓度至500ng/ml完全抑制了这些细胞因子的产生(图16A至图16C)。相比之下，其他MMP抑制剂，诸如GM6001、SD2590和MMP 9抑制剂I对这些细胞因子的抑制作用很小(图16A至图16C)。

AZD1236和其他MMP抑制剂对初级巨噬细胞或J744A.1和RAW 264.7巨噬细胞系的趋化性没有影响，因为迁移指数保持在基线对照水平(图16D)。同时，阳性对照MCP-1和PMA均在原代腹膜巨噬细胞和两种巨噬细胞系中刺激显著的趋化性(图16D)。

这些结果证明，AZD1236显著抑制小胶质细胞激活，从而抑制细胞因子(诸如TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌，但不影响巨噬细胞的迁移。

抑制MMP-9和MMP-12在SCI大鼠模型中也有效

研究了在大鼠DC损伤模型中，抑制MMP-9和MMP-12是否也可减弱水肿并改善功能恢复，其更好地说明了人类SCI病理生理学(Surey S，Berry M，Logan A，Bicknell R，AhmedZ.Differential cavitation，angiogenesis and wound-healing responses in injuredmouse and rat spinal cords.Neuroscience 2014；275：62-80)。例如，与人类一样，大鼠也会形成充满液体的囊肿，所述囊肿在DC损伤后随着时间推移而变大；反应进一步损伤脊髓组织并破坏轴突。此外，充满液体的囊肿被瘢痕组织包围，这对再生/萌生轴突造成了额外的障碍。

我们表示，与小鼠相比，在大鼠的DC损伤后，MMP-9(图17A)和MMP-12(图17B)的mRNA表达概况相同。由于AZD1236对大鼠MMP-9/-12没有活性，AZD3342是一种MMP抑制剂，与AZD1236具有类似的选择性，在大鼠中有活性(对大鼠MMP-9和-12分别有IC

停用AZD1236后5天恢复正常损伤部位MMP-9和MMP-12活性水平

研究了在3天后停用口服AZD1236后，MMP-9和MMP-12在损伤部位恢复至正常SCI诱导的活性水平需要的时间。结果证明MMP-9需要4天，而MMP-12需要5天才能恢复至在DC+媒介物损伤组观察到的活性水平(图18A和图18B)。这些结果证明，在最后一次给药AZD1236后4-5天，即CNS的伤口愈合阶段之前，MMP-9和MMP-12活性水平恢复正常。

AZD1236治疗不影响MMP-2活性

研究了有效剂量的AZD1236的口服和鞘内递送是否会在无意中影响MMP-2活性。然而，MMP-12活性测定证明在用AZD1236治疗后DC损伤诱导的MMP-2活性升高没有差异，表明AZD1236在所用剂量下对MMP-2活性没有脱靶效应(图19)。

实施例2

使用与实施例1中所述的技术类似的技术，测定针对AZD1236和AZD3342的脊髓含水量作为损伤诱导的水肿的量度(参见图20)。

实施例3

使用与实施例1中所述的技术类似的技术，测定针对各种剂和水通道蛋白-4抑制剂(即TFP、PKAi、PKCi和TGN-020)的脊髓含水量作为损伤诱导的水肿的量度，参见图21。

TFP＝三氟拉嗪，也称为Stelazine、Eskazinyl、Eskazine或Jatroneural，并且可商购获得。

PKAi是一种蛋白激酶A抑制剂，并且PKCi是一种蛋白激酶C抑制剂。

TGN-020是一种水通道蛋白4(AQP4)通道阻滞剂，并且具有化学名称N-1，3，4-噻二唑-2-基-3-吡啶酰胺。它是可商购获得的，例如来自Tocris。