检测形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测样品中形成β‑片层聚集体的蛋白质的β‑片层聚集体形式(PAPβ)的体外方法，其包括以下步骤：将可能含有PAPβ的样品的pH调节至pH 9.7至13.2的范围内，以分离出全部或一部分的PAPβ，以获得形成β‑片层聚集体的蛋白质的β‑片层非聚集体形式(PNAPβ)，以及用合适的免疫学方法在pH 6至9的范围中测量PNAPβ的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于在样品中检测形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式(PAFβ)的体外方法，包括解聚PAFβ以获得形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层非聚集体形式(PNAFβ)的步骤和测量PNAFβ含量的步骤。

背景技术

经常错误折叠的蛋白质的积累导致它们在细胞中聚集，造成细胞失调，表征为某些神经退行性病变；特别是β淀粉样肽，以及更特别是β1-42淀粉样肽，其被广泛研究在阿尔茨海默病中用于形成含有β片层的原纤维、之后形成板。β淀粉样肽的聚集过程已被充分表征，该过程取决于许多因素，特别是其浓度、pH和温度。许多其他蛋白质(如含有朊病毒样结构域的RNA和DNA结合蛋白)也可以形成朊病毒样聚集体[1]。含有朊病毒样结构域的蛋白质是形成β-片层聚集体的蛋白质(PFβ)。

朊病毒样结构域含疏水性氨基酸，这促进形成富含β片层的原纤维。形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式(PAFβ)在中性pH值时不溶于水。

目前对PAFβ诱发的这些神经退行性疾病的诊断最常基于影像学，并完成临床和神经心理学检查。这是需要若干诊断步骤的繁琐且昂贵的过程。

文献中也描述了允许证实或量化生物样品中PFβ聚集或寡聚的各种诊断技术。

某些PFβ，特别是β淀粉样肽和TAU或TDP-43蛋白的不同聚集水平可以通过结构分析技术突出：电子显微镜、原子力显微镜、Cryo EM、圆二色性、核磁共振、X射线衍射。然而，这些技术使得难以测量在样品中存在的聚集体的含量，甚至是相对含量。因此，这些技术无法真正研究化合物对PFβ聚集水平的可能作用(特别是对聚集的抑制)。

能够根据蛋白质分子量将蛋白质分离的技术允许区分出高分子量的PAFβ和低分子量的PNAFβ。其中的一些还允许区分出不同尺寸的聚集体。例如，可以提及与蛋白印迹检测相关或不相关的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE和SDS-PAGE)。然而，目前在这些技术中描述的实验条件可以扭曲对聚集水平的测量。对于SDS-PAGE而言尤其如此，其中对洗涤剂和还原剂(DTT、β-巯基乙醇或TCEP)的组合使用可以将聚集体全部解聚或部分解聚。由于其实验限制(实施时间、大量样品、缺乏灵敏度)，这些技术并不真正适合用于表征能够调节PFβ聚集水平的化合物。

还描述了基于免疫检测的技术：

-过滤与免疫检测相结合：在这种方法中，生物样品在能够保留高分子量物质，特别是PAFβ的膜上过滤。然后，将比色或荧光或甚至发光示踪剂直接或间接标记的特异于PAFβ的抗体施加至膜上。测量的信号与PAFβ的量成正比。这种方法可以适用于微孔板形式，以研究淀粉样蛋白的聚集参数或化合物对淀粉样蛋白聚集水平的作用。然而，由于该技术所需的过滤和洗涤步骤，该方法的自动化和通量受到限制[2]。

-ELISA：已经描述了不同的ELISA测试策略，以便允许表征PFβ的聚集。第一策略包括使用相同的抗体在固相上捕获PAFβ，以及使用允许其检测的示踪剂。这种方法只允许检测具有若干个用于捕获和检测的抗体表位的PAFβ。相反地，因为PNAFβ只有一个能被所用抗体识别的表位，所以捕获抗体和检测抗体不能同时固定在PNAFβ上。因此，在PNAFβ存在的情况下不会产生任何信号[3]。第二策略包括在ELISA测试中将特异性识别PAFβ的抗体与识别样品中存在的全部PFβ形式(PAFβ和PNAFβ)的抗体相结合[4]。在这种形式中，PAFβ的特异性抗体通常是捕获抗体，但也描述了使用其作为检测抗体的形式[5]。第三个策略是使用两种不同的都识别感兴趣的PAFβ的抗体。最后一个策略似乎可以提高对聚集体检测的特异性[6]。所有这些ELISA测试都可以确定感兴趣的PFβ的聚集水平，并确定化合物对其聚集水平的作用。然而，仅检测PAFβ是不够的，因为在给定的信号中，不可能实现与初始状态相比的聚集水平，除非将测量与标准范围进行比较，这必然会使受测的生物样品的测量产生偏差。

-TR-FRET(时间分辨的能量转移)：已经开发并上市销售基于此方法的试剂盒，以检测在有机样品中TAU和α-突触核蛋白的聚集(参见Cisbio网站，商业参考号6FTAUPEG和6FASYPEG)。这些测试分别使用荧光供体和接受体标记相同的抗体。在PAFβ存在的情况下，由于聚集，两种标记的抗体将同时与PAFβ键合，从而在彼此靠近的供体和荧光接受体之间诱导能量转移。然后，接受体抗体将发出特定的FRET信号，其将在分辨时间内得到测量。另一方面，两个抗体中只有一个可以结合到PNAFβ上，从而阻止了供体和接受体之间的任何靠近。然后，就不可能在PNAFβ上获得FRET信号。这些试剂盒允许确定感兴趣的PFβ的聚集水平，以及确定在小型化和高速模式下化合物对感兴趣的PFβ聚集水平的作用。然而，这些试剂盒需要使用能够识别PFβ表位(即使所述表位聚集)的抗体，这有时会限制甚至阻碍检测测试的开发，因为免疫通常是用PNAFβ进行的，这会使得难以获得抗PAFβ抗体。

因此，现有技术中描述的方法旨在直接检测样品中的PAFβ，特别是通过使用PAFβ的一种或更多种配体。然而，直接检测PAFβ可能使这些技术难以实施、不精确和/或不适合大规模使用。此外，仅检测PAFβ是不够的，因为在给定的信号中，不可能实现与初始状态相比较的聚集水平，除非将测量与标准范围进行比较，这必然会使测试的生物样品的测量产生偏差。

因此，有必要对与PFβ聚集相关的疾病进行更简单、更快速和更可靠的诊断。

申请人已经开发了一种简单且易于实施的操作方案，其允许解聚样品中存在的全部或一部分PAFβ，以获得PNAFβ。该操作方案允许申请人开发通过测量PNAFβ的含量进行的PAFβ检测方法，这允许克服与PAFβ检测相关的所有约束。

发明内容

根据第一方面，本发明涉及一种用于检测样品中形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式(PAFβ)的体外方法，包括以下步骤：

a)在第一容器中：

a1)引入可能含有PAFβ的样品，

a2)将pH调节至pH 9.7至13.2的范围内，以解聚全部或一部分的PAFβ，以获得形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层非聚集体形式(PNAFβ)，

a3)将pH调节至pH 6至9的范围，

b)用合适的免疫学方法测量第一容器中的PNAFβ的含量；

c)在第二容器中：

c1)引入与步骤a1)中相同的样品，

c2)将pH调节至pH 6至9的范围；

d)使用与步骤b)中相同的方法测量在第二容器中PNAFβ的含量；

e)比较在步骤b)和d)中测量的含量，在步骤d)中测量的含量低于在步骤b)中测量的含量则指示样品含有PAFβ。

根据第二方面，本发明涉及用于监测治疗与PAFβ相关疾病的治疗疗效的体外方法，包括以下步骤：

A)对第一样品实施根据本发明的方法，其中步骤e)包括确定在步骤b)中测量的含量与在步骤d)中测量的含量之间的比率(“样品1的b)/d)比率”)；

B)对第二样品实施与步骤A)中相同的方法，以确定“样品2的b)/d)比率”；

C)比较在步骤A)和B)中确定的比率，其中当在步骤B)中确定的比率低于在步骤A)中确定的比率时，观察到治疗疗效。

根据第三个方面，本发明涉及用于在PAFβ相关的疾病中测量分子的药理疗效的体外方法，包括以下步骤：

A)对第一样品实施根据本发明的方法，其中步骤e)包括确定在步骤b)中测量的含量与在步骤d)中测量的含量之间的比率(“样品1的b)/d)比率”)；

B)对第二样品实施与步骤A)中相同的方法，以确定“样品2的b)/d)比率”；

C)比较在步骤A)和B)中确定的比率，其中当在步骤B)中确定的比率低于在步骤A)中确定的比率时，观察到药理疗效。

具体实施方式

定义

表述“形成β-片层型聚集体的蛋白质”或“PFβ”是指能够形成富含β片层的聚集体的蛋白质，也就是说能够形成富含β片层的多聚体形式(或寡聚体形式)的蛋白质。通常，非聚集体形式的PFβ是正常的，但其聚集体形式的特征在于特别是神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、克雅氏病、帕金森病或肌萎缩侧索硬化症(ALS)。其可以是人或动物、天然或重组蛋白。在本发明的上下文中，PFβ的非聚集体形式指表述“形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层非聚集体形式”或“PNAFβ”。PFβ的聚集体形式称为“形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式”或“PAFβ”。

PFβ可以是聚集体形式(PAFβ)或非聚集体形式(PNAFβ)，可以选自FUS(在肉瘤中的融合蛋白)、TAF15、EWSR1、DAZAP1、TIA-1、TTR(转甲状腺素蛋白)、胱抑素C、β2-微球蛋白、β淀粉样肽(如β1-40淀粉样肽或β1-42淀粉样肽)、TAU(微管蛋白相关单元)、α-突触核蛋白、β-突触核蛋白、γ-突触核蛋白、亨廷顿蛋白(HTT)、SOD1(超氧化物歧化酶1)、朊病毒和TDP-43(TAR DNA结合蛋白43)。例如，当PFβ是TDP-43时，“TDP-43NAFβ”将视为TDP-43的非聚集体形式，“TDP-43AFβ”将视为TDP-43的聚集体形式。

以上列出的PFβ特别涉及神经退行性疾病。例如，与肌萎缩性侧索硬化有关的FUS，与肌萎缩性侧索硬化有关的TAF15，与阿尔茨海默病和遗传性脑淀粉样血管病有关的β淀粉样肽，与克雅氏病和海绵状脑病有关的朊病毒，与帕金森病有关的α-突触核蛋白，与阿尔茨海默病、额颞叶痴呆有关的TAU蛋白质，与老年系统性淀粉样变性或家族性淀粉样多发性神经病有关的转甲状腺素蛋白，与遗传性脑淀粉样血管病有关的胱抑素C，与血液透析相关淀粉样变性有关的β2-微球蛋白，与亨廷顿病有关的亨廷顿蛋白，与肌萎缩侧索硬化有关的SOD1，与肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆有关的TDP-43。优选地，PFβ选自β1-42淀粉样肽、β1-40淀粉样肽、α-突触核蛋白或TDP-43。

实施本发明方法的样品可以是任何可能含有至少一种PAFβ的样品。其可以是人或动物来源的生物样品，或者是体外培养的细胞或组织样品。

术语“体外方法”是指在人或动物体外实施的方法，例如在微生物、器官、组织、细胞、细胞亚组分(例如，细胞核、线粒体)或(天然的或重组的)蛋白质上体外实施的方法。术语“体外”包括离体。

样品可以，例如来自患有或疑似患有与PAFβ相关的疾病(例如上述神经退行性疾病)的个体、人或动物。例如，样品可以选自血液样品、血浆样品、血清样品或脑脊液样品。样品也可以从个体的组织或细胞制备，例如从脑、中枢神经系统组织、器官(如脾脏和肠)制备。因此，样品可以是细胞裂解物、细胞匀浆、组织裂解物或组织匀浆，如脑匀浆。样品还可以包含细胞(例如，细胞系)、细胞亚组分(例如，细胞核、线粒体)或(天然的或重组的)蛋白质。

样品还可以来自体外或离体培养的细胞或组织，优选来自与PAFβ相关的疾病的细胞或组织模型。例如，样品可选自细胞裂解物、细胞匀浆、组织裂解物、组织匀浆、细胞培养物上清液或组织培养物上清液。

优选地，样品是细胞裂解物或细胞匀浆。

术语“容器”指的是板的孔、试管或适合于将样品与实施根据本发明的方法所必需的试剂混合的任何其他容器。

在本发明的含义内，术语“配体”意指能够结合目标分子的分子。在本发明的上下文中，目标分子是PNAFβ。然后将其称为“PNAFβ的配体”。配体可以是蛋白质性质的(例如，蛋白质或肽)或核苷酸性质的(例如，DNA或RNA)。在本发明的上下文中，配体有利地选自抗体、抗体片段、肽或适体，优选抗体或抗体片段。

在本发明的含义内，术语“能够特异性结合PNAFβ的配体”或“能够特异性结合PNAFβ的配体对”指相较于PAFβ，优先结合PNAFβ的配体或配体对，也就是说，相较于针对相应的PAFβ产生的信号，配体或配体能够针对至少一种PNAFβ产生两倍，例如至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少六倍的更高信号(例如，ELISA信号或RET信号)。本申请的实施例1至4和25描述了ELISA和FRET方法，其允许容易确定配体或配体对是否能够特异性结合PNAFβ。

有利地，“能够特异性结合PNAFβ的配体”或“能够特异性结合PNAFβ的配体对”能够以相对于针对PAFβ的亲和力为至少2倍的亲和力与PNAFβ结合，例如，以相对于针对PAFβ的亲和力为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍，至少10倍的亲和力与PNAFβ结合。在能够特异性结合PNAFβ的配体对的情况下，为了使配体对PNAFβ是特异的，没有必要使配体中的两个配体都特异于PNAFβ。事实上，配体对的两个配体中的至少一个是特异于PNAFβ的配体，就足以使配体对特异于PNAFβ。然而，配体对中的两个配体可以都是特异于PNAFβ的配体。

术语“亲和力”是指配体和抗原之间所有非共价相互作用的强度。亲和力通常由解离常数(Kd)表示。Kd值越低，配体与其目标之间的结合亲和力越高。解离常数(Kd)可以通过公知的方法测量，例如，通过FRET，通过ELISA或SPR。因此，文献中描述的技术使得易于知晓配体或配体对是否特异于PNAFβ。

术语“抗体”也称为“免疫球蛋白”，意指由两条各约50-70kDa的重链(重链称为H链)和两条各约25kDa的轻链(轻链称为L链)通过链内和链间二硫键桥结合在一起组成的异四聚体。每条链由在N末端位置的可变区或结构域(轻链称为VL，重链称为VH)和在C末端位置的恒定区(由对于轻链称为CL的单个结构域以及对于重链称为CH1、CH2、CH3、CH4的三个或四个结构域组成)组成。每个可变结构域通常包含4个“铰链区”(称为FR1、FR2、FR3、FR4)和3个直接负责与抗原结合的区域，称为“CDR”(称为CDR1、CDR2、CDR3)。“抗体”可以是哺乳动物(例如，人或小鼠或大鼠或骆驼科)、人源化的、嵌合的、重组来源的。其优选是根据本领域技术人员公知的技术通过基因修饰的细胞由重组产生的单克隆抗体。抗体可以是任何同种型，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，优选IgG。

术语“抗体片段”是指通过酶促消化获得或通过生物产生获得的免疫球蛋白的任何部分，其包含至少一个二硫键桥并且能够结合被整个抗体识别的抗原，例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体(也称为“单结构域抗体”或sdAb、或纳米抗体)、具有单链的抗体(例如，scFvs)。胃蛋白酶对免疫球蛋白的酶切消化产生F(ab')2片段和分为若干肽的Fc片段。F(ab')2由通过链间二硫键桥结合的两个Fab'片段组成。Fab部分由可变区以及CH1和CL结构域组成。Fab'片段由Fab区和铰链区组成。Fab'-SH是指其中铰链区的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'片段。

术语“示踪剂”是指能够直接或间接发射可以被合适的检测装置检测到的信号的化学或生物试剂。其可以是荧光、发光、放射性或酶促示踪剂。在具体实施方案中，示踪剂是RET配偶体对的成员。

术语“RET”(来自“共振能量转移”)指能量转移技术。RET可以是FRET或BRET。

术语“FRET”(来自“荧光共振能量转移”)指两个荧光分子之间的能量转移。FRET被定义为由能量供体和能量接受体之间的偶极-偶极相互作用产生的非辐射能量转移。这种物理现象要求这些分子之间具有能量相容性。这意味着供体的发射谱必须至少部分地与接受体的吸收谱重叠。根据

术语“BRET”(来自“生物发光共振能量转移”)指在生物发光分子和荧光分子之间的能量转移。

术语“RET配偶体对”意指由能量供体化合物(以下称为“供体化合物”)和能量接受体化合物(以下称为“接受体化合物”)组成的对；当能量供体化合物和能量接受体化合物彼此靠近，并在供体化合物的激发波长下被激发时，这些化合物就发射RET信号。众所周知，要成为RET配偶体的两种化合物，供体化合物的发射光谱必须与接受体化合物的激发光谱部分重叠。例如，当使用荧光供体化合物和接受体化合物时是“FRET配偶体对”的情况，或者当使用生物发光供体化合物和接受体化合物时是“BRET配偶体对”的情况。

术语“RET信号”指供体化合物和接受体化合物之间的RET的任何可测量的信号表示。例如，因此FRET信号可以是供体荧光化合物或接受体化合物(当接受体化合物也是荧光时)的强度或发光寿命的变化。

“2个容器”检测方法

根据第一方面，本发明涉及一种用于检测样品中形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式(PAFβ)的体外方法，包括以下步骤：

在第一容器中：

a1)引入可能含有PAFβ的样品，

a2)将pH调节至pH 9.7至13.2的范围内，以解聚全部或一部分的PAFβ，以获得形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层非聚集体形式(PNAFβ)，

a3)将pH调节至pH 6至9的范围内，

b)用合适的免疫学方法测量第一容器中的PNAFβ的含量；

c)在第二容器中：

c1)引入与在步骤a1)中相同的样品，

c2)将pH调节至pH 6至9的范围内；

d)使用与步骤b)中相同的方法测量第二容器中PNAFβ的含量；

e)比较在步骤b)和d)中测量的含量，在步骤d)中测量的含量低于在步骤b)中测量的含量指示样品含有PAFβ。

根据本发明的方法的一般原理如图1所示。

下面，逐步详细描述该方法。

步骤a)

步骤a1)包括在第一容器中引入可能含有PAFβ的样品。可以预先制备样品以便能够正确地执行该方法的步骤，特别是测量PNAFβ含量的步骤。例如，当样品是组织或细胞时，可以通过裂解、研磨、过滤和/或将其溶解在合适的溶剂(如水)中进行预先制备。本领域技术人员将不难制备样品。

步骤a2)包括将pH调节至pH 9.7至13.2的范围内中，以解聚全部或一部分的PAFβ，以获得形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层非聚集体形式(PNAFβ)。申请人确实注意到pH9.7至13.2的范围允许解聚PAFβ。这种解聚现象允许从PAFβ中获得PNAFβ。

这种在pH 9.7至13.2的范围内解聚的现象是非常出人意料地，因为现有技术中描述的解聚方法实际上包括在酸性pH下、用强力去污剂和/或通过超声对PNAFβ进行处理。例如，[7]中描述的工作显示了从淀粉样纤维中获得相对单体的淀粉样蛋白的不同方法。在第一种方法中，通过将酸(88％的甲酸)与强表面活性剂型洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)组合以处理淀粉样纤维的制剂。一种可替选的方案是将离液剂，硫氰酸胍(6.8M)的饱和溶液与SDS组合。在这两种情况下，作者都能够注意到淀粉样纤维的消失，有利于相对单体的淀粉样蛋白(单体和二聚体的混合物)。另一个研究[8]描述了处理生物样品的不同方法：在通过ELISA测试测定生物样品之前，将其含有的淀粉样蛋白(β1-42淀粉样肽)解聚。用氟化乙醇(HFIP)或酸(TFA)溶液处理小鼠大脑或患者脑脊液的提取物，结合超声处理15分钟，以解聚淀粉样蛋白。然后，通过在恒定氮气流下干燥去除HFIP或TFA。然后，将含有解聚的淀粉样蛋白的干燥样品溶解在1％ NH

然而，申请人已表明，现有技术中描述的解聚方法不允许使用免疫学方法测量PNAFβ含量，免疫学方法需要在生理pH下实施(参见实施例5至实施例17)。

本发明的方法不需要在酸性pH下进行处理以解聚PAFβ。相反，申请人不仅表明通过将PAFβ在pH 9.7至13.2的范围中处理，能够解聚PAFβ，还表明这种处理与随后实施的旨在测量PNAFβ含量的免疫学方法完全相容。

有利地，步骤a2)包括将pH调节至pH 10至13.2的范围中，例如pH 11至13.2的范围、pH 11.5至13.2的范围、pH 12至13.2的范围、pH 12.5至13.2的范围、pH 12.8至13.2的范围、pH 10至13的范围、pH 11至13的范围、pH 12至13的范围，例如约12.8。

用碱调节pH，例如，强碱，如KOH或NaOH，优选NaOH。

步骤a2)的持续时间可以取决于各种参数，如使用的碱或测试的PFβ。特别地，步骤a2)可以持续至少30秒，例如至少1分钟、至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟，例如在30秒至60分钟之间或在5分钟至30分钟之间。本领域技术人员将不难调整步骤a2)的持续时间以设法解聚全部或一部分的PAFβ以获得PNAFβ。

步骤a3)包括将pH调节至pH 6至9的范围。该步骤很重要，因为其允许实施步骤b)的免疫学方法。

有利地，步骤a3)包括将pH调节至pH 6.4至9的范围，例如pH 6.4至8.4的范围、pH6至8.5的范围、pH 7至8.5的范围。

pH用酸调节，例如强酸，如HCl。

步骤b)

步骤b)包括用合适的免疫学方法(或合适的“免疫测定法”)测量第一容器中的PNAFβ含量。

步骤b)的免疫学方法必须允许获得彼此可比的含量。但是，尽管步骤b)中的免疫学方法可以是定量的，但其不必须是定量的。步骤b)的免疫学方法必须至少允许测量相对含量，其可与通过相同免疫学方法测量的另一相对含量比较。

在一个具体实施方案中，步骤b)中实施的免疫学方法使用：

(i)能够特异性结合PNAFβ的配体，所述配体用示踪剂标记，或者

(ii)能够特异性结合PNAFβ的配体对，所述配体对的至少一个配体用示踪剂标记。

配体(i)可以选自抗体、抗体片段、肽或适体，优选抗体。配体对(ii)可以选自抗体对、抗体片段对、肽对或适体对，优选抗体对。

本领域技术人员将不难获得和/或选择具有所需特性的抗体或抗体片段，例如通过用PFβ免疫小鼠，通过对来自免疫小鼠的脾脏的淋巴细胞进行淋巴细胞杂交，以产生杂交瘤，以及对每个杂交瘤的抗体测试其特异性结合PNAFβ的能力。然后，在实施例1至4和25中详述了用于生成抗PNAFβ抗体，然后选择特异性抗体的完整操作方案的实施例。因此，非常容易获得针对任何PNAFβ的抗体或抗体对以实施根据本发明的方法，例如通过实施在实施例1至4和25中描述的方法。

获得PNAFβ和PAFβ是本领域技术人员力所能及的。例如，对于称为“朊病毒样”蛋白的蛋白质，如TDP-43、FUS、TAF15和EWSR1，将产生与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的这些蛋白质(N-或C-末端融合取决于蛋白质)允许获得GST融合蛋白，其浊度分析表明其处于非聚集体形式[9][10][13]。当在感兴趣的PFβ和GST之间插入烟草蚀斑病毒蛋白酶(TEV)的切割位点时，用TEV处理GST蛋白，然后进行纯化步骤，允许获得没有标记的GST蛋白。当所述蛋白质在室温下搅拌1小时30分时，浊度分析表明其呈聚集体形式[10][13]。与GST融合的PFβ也可商购，例如来自Abnova：GST-TDP-43(参考号H00023435-P02)、GST-FUS1(参考号H00002521-P01)、GST-TAF15(参考号H00008148-P02)、GST-EWSR1(参考号H00002130-Q01)。

淀粉样肽，特别是β1-40和β1-42形式，也可以从许多供应商处以粉末形式获得。这些粉末在HFIP或NH

含有PNAFβ和PAFβ的样品也可以从StressMarq公司(www.stressmarq.com)获得。对于α、β和γ突触核蛋白、TAU蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)蛋白或转甲状腺素蛋白尤其如此。

有利地，步骤b)中实施的免疫学方法是ELISA方法或RET方法，如FRET或BRET。

取决于所使用的方法，步骤b)的测量可以通过在第一容器中添加合适的试剂直接进行，或者在含有第一容器的全部或一部分内容物的另一个容器中进行。例如，可以将用于RET方法的试剂直接添加至第一容器中。相反，ELISA方法将优选在适于实施ELISA方法的另一个容器中进行，特别是在容器底部预先固定有PNAFβ配体的容器中进行。

在一个具体实施方案中，步骤b)通过RET方法进行并且包括：

(b1)向容器中引入使用RET配偶体对的第一成员标记的第一PNAFβ配体，和使用RET配偶体对的第二成员标记的第二PNAFβ配体，所述配体对能够特异性结合PNAFβ，以及

(b2)测量在容器中发射的RET信号。

显然，对于RET方法的实施，第一配体和第二配体必须不是竞争结合PNAFβ，例如，第一配体和第二配体必须不是结合在PNAFβ上的相同表位上。通过执行实施例1至4和25中描述的方法，很容易选择合适的配体对。

可以直接或间接地标记配体。可以通过本领域技术人员已知的常规方法，基于配体上存在的反应性基团，使用RET配偶体对的成员对配体进行直接标记。例如，当配体是抗体或抗体片段时，可以使用以下反应性基团：末端氨基基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧酸基团、赖氨酸的胺基团、精氨酸的胍基团、半胱氨酸的硫醇基团、酪氨酸的酚基基团、色氨酸的吲哚环、甲硫氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。

反应性基团可以与RET配偶体对的成员所携带的反应性基团形成共价键。RET配偶体对的成员所携带的合适的反应性基团是本领域技术人员公知的，例如用马来酰亚胺基团官能化的供体化合物或接受体化合物将，例如，能够共价结合至由蛋白质或肽(例如，抗体或抗体片段)携带的半胱氨酸所携带的硫醇基团。类似地，携带N-羟基琥珀酰亚胺酯的供体/接受体化合物将能够共价结合至蛋白质或肽中存在的胺。

配体也可以用荧光或生物发光化合物间接标记，例如通过将自身与接受体/供体化合物共价结合的抗体或抗体片段引入测量介质中，该第二抗体或抗体片段特异性识别配体。

另一种很常规的间接标记方法包括：将生物素连接至待标记的配体，然后在用接受体/供体化合物标记的链霉亲和素存在下孵育该生物素化的配体。合适的生物素化配体可以通过本领域技术人员公知的技术制备；例如，Cisbio Bioassays销售用荧光团标记的链霉亲和素，其商品名为“d2”(参考号610SADLA)。

有利地，RET配偶对中的一个成员是荧光供体或发光供体化合物，而RET配偶对中的另一个成员是荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(猝灭剂)。

当RET是FRET时，供体荧光化合物可以是选自以下的FRET配偶体：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物、量子点、别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。当RET是FRET时，接受体荧光化合物可以是选自以下的FRET配偶体：别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼-二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑，量子点，GFP，选自GFP10、GFP2和eGFP的GFP变体，YFP，选自eYFP、YFP topaz、YFP citrine、YFPvenus和YPet的YFP变体，mOrange，DsRed。

当RET是BRET时，供体发光化合物可以是选自以下的BRET的配偶体：萤光素酶(luc)、海肾萤光素酶(Rluc)、海肾萤光素酶的变体(Rluc8)和萤火虫萤光素酶。当RET是BRET时，接受体荧光化合物是选自以下的BRET配偶体：别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼-二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑，量子点，GFP，选自GFP10、GFP2和eGFP的GFP变体，YFP，选自eYFP、YFP topaz、YFP citrine、YFP venus和YPet的YFP变体，mOrange，DsRed。

在一个具体实施方案中，步骤b)通过ELISA方法进行，并且包括：

(b1)将全部或一部分样品引入底部已固定有第一PNAFβ配体的容器中，然后引入用示踪剂标记的第二PNAFβ配体，该配体对能够特异性结合PNAFβ，

(b2)测量在容器中发射的ELISA信号。

ELISA方法在现有技术中广泛描述，对于本领域技术人员来说实施起来没有任何困难。

步骤c)

步骤c)包括，在第一容器中，c1)引入与步骤a1)中相同的样品。

与步骤a)相反，在步骤c)中没有将pH调节至pH 9.7至13.2的范围。将pH直接调节至pH 6至9的范围(步骤c2))，优选与步骤a3)的pH相同。

步骤c2)中的pH可以用酸/碱混合物，例如强酸/强碱混合物进行调节。例如，其可以是NaOH/HCl混合物。优选地，步骤c2)中使用的酸与步骤a3)中使用的酸相同，步骤c2)中使用的碱与步骤a2)中使用的碱相同。

步骤d)

步骤d)包括使用与步骤b)中相同的方法测量第二容器中的PNAFβ含量。使用与步骤b)中相同的方式实施步骤d)，以便能够比较测量值并实施步骤e)。

因此，当步骤b)通过RET方法进行时，步骤d)包括：

(d1)向容器中引入使用RET配偶体对的第一成员标记的第一PNAFβ配体，和使用RET配偶体对的第二成员标记的第二PNAFβ配体，所述配体对能够特异性结合PNAFβ，以及

(d2)测量在容器中发射的RET信号。

以同样的方式，当步骤b)通过ELISA方法进行时，步骤d)包括：

(d1)将全部或一部分样品引入底部已固定有第一PNAFβ配体的容器中，然后引入用示踪剂标记的第二PNAFβ配体，该配体对能够特异性结合PNAFβ，

(d2)测量在容器中发射的ELISA信号。

步骤e)

步骤e)包括比较在步骤b)和在步骤d)中测量的含量，步骤d)中测量的含量低于步骤b)中测量的含量则指示样品含有PAFβ。

显而易见地，如果将第一容器和第二容器调换，则步骤e)将包括对在步骤b)和在步骤d)中测量的含量进行比较，步骤d)中测量的含量相对高于步骤b)中测量的含量，指示样品含有PAFβ。

本领域技术人员可以容易地比较在步骤b)和步骤d)中测量的含量并且限定阈值，使其能够定量增加或减少。例如，测量的含量的差异大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％。阈值的确定可以取决于所选择的免疫学方法中的固有的可变性。

本领域技术人员可以，例如计算在步骤b)和d)中测量的含量之间的比率。一般而言，测量的含量之间的差异越大，测量的含量之间的比率越大，样品中PAFβ的量也越大。

当免疫学方法为ELISA方法或RET方法时，在步骤b)和d)中测量的RET信号或ELISA信号将是可比的。因此，RET信号的减少或ELISA信号的减少将指示样品含有PAFβ。有利地，将计算在第一容器中测量的信号(步骤b))和在第二容器中测量的信号(步骤d))之间的比率。可以手动或自动计算比率。

优选地，将调整在步骤a3)和步骤b)之间的持续时间和/或在步骤c2)和步骤d)之间的持续时间，以防止PNAFβ重新聚集成PAFβ。持续时间将优选少于24小时，例如少于5小时。有利地，步骤b)和d)分别在步骤a3)和c2)之后进行，也就是说在步骤a3)和c2)之后少于30分钟内进行。本领域技术人员将不难调整步骤a3)和/或步骤c2)的持续时间，以防止在步骤c)和/或步骤d)之前，全部的或一部分PNAFβ重新聚集成PAFβ。

在步骤e)中比较在两个样品中的含量允许非常精确地测量聚集水平，特别是与现有技术的大多数方法相比。

用于监测治疗疗效的方法

本发明还涉及一种用于在患者中监测治疗与PAFβ相关疾病的治疗疗效的体外方法，包括以下步骤：

A)对所述患者的第一样品实施根据本发明的方法，其中步骤e)包括确定在步骤b)中测量的含量与在步骤d)中测量的含量之间的比率(“样品1的b)/d)比率”)；

B)对所述患者的第二样品实施与步骤A)中相同的方法，以确定“样品2的b)/d)比率”；

C)比较在步骤A)和B)中确定的比率，其中当在步骤B)中确定的比率低于在步骤A)中确定的比率时，观察到治疗疗效。

治疗可以是已知的与PAFβ相关疾病的治疗或实验性治疗。样品优选来自患有PAFβ相关疾病的个体。

为了能够监测治疗的有效性，第一样品和第二样品在不同时间从患者采集，例如第一样品在时间T1采集，第二样品在时间T2采集。有利地，第一样品在第二样品之前采集，例如在患者治疗之前或所述治疗期间的时间T1采集第一样品，而在所述治疗之后或所述治疗期间的时间T2采集第二样品。将选择在收集第一样品至收集第二样品之间经过的时间，以便能够检测治疗的治疗效果。

药理疗效测量的监测方法

本发明还涉及一种用于在测试样品中测量药物分子或候选药物对PAFβ相关疾病的药理疗效的体外方法，包括以下步骤：

A)对所述测试样品的第一样品实施根据本发明的方法，其中步骤e)包括确定在步骤b)中测量的含量与在步骤d)中测量的含量之间的比率(“样品1的b)/d)比率”)；

B)对所述测试样品的第二样品实施与步骤A)中相同的方法，以确定“样品2的b)/d)比率”；

C)比较在步骤A)和B)中确定的比率，其中当在步骤B)中确定的比率低于在步骤A)中确定的比率时，观察到药理疗效。

分子可以是药物或候选药物。样品优选来自体外培养的细胞或组织。因此，药物分子或候选药物优选在与PAFβ相关疾病的体外模型上进行测试。这样的模型在文献中广泛描述。

测试样品对应于允许在体外测试药物或候选药物的样品，其可以是，例如体外培养的细胞样品或体外培养的组织样品。测试样品对应于通常称为“与PAFβ相关的疾病的体外模型”。因此，为了能够测量药物分子或候选药物的药理疗效，第一样品和第二样品在不同时间从测试样品采集，例如第一样品在时间T1采集，第二样品在时间T2采集。有利地，第一样品在第二样品之前采集，例如，在使用药物分子或候选药物治疗测试样品之前的时间T1采集第一样品，而在所述治疗之后的时间T1采集第二样品。将选择在采集第一样品至采集第二样品之间经过的时间，以便能够检测药物分子或候选药物的药理疗效。

现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。

实施例

实施例1：识别特异于PNAFβ的抗体的方法

产生抗PNAFβ的抗体

小鼠免疫

通过注射在生理条件下制备的在磷酸盐缓冲液中预先稀释的PNAFβ蛋白，以免疫BALB/c小鼠。验证在用于注射的缓冲液中没有PNAFβ多聚体或聚集体的存在，以引导小鼠的免疫反应针对非聚集体形式。第一次注射后，以月为间隔进行三次加强注射。

每次注射后十五天，对小鼠进行血液穿刺以通过滴定抗体验证免疫反应的存在。

通过ELISA测试滴定在免疫血清中的抗PNAFβ抗体

为此，根据PFβ的性质实施ELISA型免疫检测测试。对于淀粉样型PFβ或肽而言，使用由生物素、碳接头和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应性基团组成的试剂，预先使用生物素在PNAFβ的一级赖氨酸上对在PNAFβ进行标记。对于非淀粉样或淀粉样PFβ，通过使用谷胱甘肽基团功能化的ELISA微孔板经由GST标签将GST融合体中的PNAFβ直接固定在96孔板上。使用链霉亲和素功能化的微孔板，通过生物素将生物素标记的蛋白质固定在96孔ELISA板上。为此，将100μl的GST融合体和/或生物素化的PNAFβ溶液添加至每个孔中，然后在室温下孵育2小时。然后，将孔在补充有0.05％ Tween-20的PBS缓冲液中洗涤3次。去除洗涤液后，然后将每孔用200μL的由PBS、5％ BSA组成的封闭液在4℃中孵育过夜。

然后将血液样品(免疫血清)的以10至1亿倍的连续稀释液以每孔100μL的水平(一式两份)，加入至PBS+0.1％ BSA缓冲液中，在搅拌下孵育2小时。通过使用200μl的含有0.05％ Tween20的PBS 1×缓冲液，通过三个洗涤步骤除掉未与固定的PNAFβ结合的非特异性抗体。使用每孔100μL的与HRP(辣根过氧化物酶)偶联的小鼠抗Fc二抗(Sigma#A0168，在PBS、BSA 0.1％中稀释至1/10000)检测可能存在的特异性抗体。在室温中伴随搅拌孵育1小时之后，然后使用200μL的含有0.05％ Tween20的PBS 1×缓冲液洗涤3次，将其底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，Sigma#T0440)在室温下伴随搅拌孵育20分钟之后，在450nm处通过比色测定进行HRP显色。然后，通过抽吸去除该封闭液，将板储存在4℃中以备将来使用。

为了确保ELISA测试检测到的抗体确实是针对PNAFβ蛋白而不是针对GST标签或生物素，将相同的穿刺物与过量的另一种具有GST或生物素标签的正交蛋白进行预孵育，之后在ELISA测试中进行测试。因此，抗TAG的抗体结合具有标签的正交蛋白，因此不结合固定在孔底部的PNAFβ蛋白；在这种情况下，没有检测到HRP信号或HRP信号减弱。

融合与克隆

选择具有最佳抗PNAFβ抗体滴度(信号，也就是说在450nm具有最高光密度)和在抗TAG对照的情况中最少信号减弱的小鼠，以用于下一步的淋巴细胞杂交(也称为融合)。提取小鼠脾脏，用于分离淋巴细胞和浆细胞的混合物。在存在聚乙二醇(PEG)型的细胞融合催化剂的情况下，将该多细胞样品与骨髓瘤细胞系进行体外融合。使用缺乏酶HGPRT(次黄嘌呤鸟苷磷酸核糖基转移酶)的突变的骨髓瘤细胞系，以允许选择杂交细胞，称为杂交瘤。将这些细胞培养在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤(甲氨蝶呤)和胸腺嘧啶的介质(HAT介质)中，以允许去除未融合的骨髓瘤细胞，从而选择出感兴趣的杂交瘤。另一方面，未融合的脾细胞因为其无法在体外增殖，所以会死亡。因此，在体外只有杂交瘤能够在这种选择压力下存活下来。

在培养平板中培养这些杂交瘤。对这些杂交瘤的上清液进行测试，以评估杂交瘤产生抗PNAFβ的抗体的能力。为此，进行了如上所述的ELISA测试。用于选择克隆的最小阈值是非特异性的四倍。用有限的稀释步骤克隆出最佳的杂交瘤，用以获得稳定的杂交瘤克隆。

为了形成杂交瘤的库，培养选择的克隆、测试细胞活力，并储存在液氮中。在该步骤中，可以通过现有技术中充分描述的方法容易地测序由克隆产生的抗体，以便能够，例如在生产细胞中产生抗体。可替选地，如下所述产生抗体。

产生抗PNAFβ的抗体

将感兴趣的杂交瘤克隆重新培养，然后将细胞接种物注射到BALB/c小鼠(腹膜内注射，IP)中，以便在腹水液中大量产生抗体。

通过旨在定量和定性抗体含量的各种技术表征腹水液的含量，然后任选地用盐沉淀所述抗体，之后通过亲和色谱法在包含接枝有蛋白A的树脂的柱上纯化所述抗体。对柱进行洗涤以除去抗体之外的组分，通过在酸性pH的甘氨酸缓冲液中震荡以洗脱抗体成分。进行pH中之后，对中性pH的缓冲液进行透析，将抗PNAFβ的抗体在4℃中储存或冷冻储存，以用于后续用途/表征(同种型分型、测定、功能测试)。

选择能够特异性结合PNAFβ的抗体对(ELISA方法)

为选择优先识别PNAFβ而不是PAFβ的抗体对，实施ELISA型测试。为此目的，使用Lightning-Link Rapid生物素A型试剂盒(Expedeon，参考号SKU 370-0005)根据供应商的建议将测试抗体对中的一个进行生物素化。将测试抗体对中的第二抗体预先用PBS缓冲液稀释在1至20μg/mL之间的浓度，然后吸附至“高结合”的ELISA型的96孔板上。为此，将100μL抗体添加到每个孔中，然后在4℃中孵育20小时，然后在含有0.05％ Tween20的PBS 1×缓冲液中洗涤3次。去除洗涤液后，然后将每孔用200μL的由PBS、5％ BSA组成的封闭液在4℃中孵育过夜。然后，通过抽吸去除该封闭液，将板储存在4℃中以备将来使用。

将含有相同初始浓度PNAFβ或PAFβ的样品的1至1/100倍的系列稀释液以100μL/孔的水平加入，在室温下伴随搅拌孵育2小时。通过使用含有0.05％Tween20的PBS 1×缓冲液，通过三个洗涤步骤除掉未与吸附在板上的抗体结合的PNAFβ或PAFβ。将生物素化的抗体预先在PBS缓冲液中稀释至浓度在10至200ng/mL之间，以100μL/孔的水平添加，在室温下搅拌孵育2小时。通过使用含有0.05％ Tween20的PBS 1×缓冲液通过三个洗涤步骤除掉未与PNAFβ或PAFβ结合的生物素化的抗体。使用在含有0.1％ BSA的PBS中稀释至1/10的链霉亲和素-HRP(R&D Systems，参考号DY998)对结合抗体进行检测。在室温下伴随搅拌进行孵育30分钟后，然后用含有0.05％ Tween20的PBS 1×缓冲液洗涤三次，将其底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，Sigma#T0440)在室温下伴随搅拌孵育20分钟之后，在450nm(D.O.450nm)处测量光密度进行HRP显色。

第一步，通过分析使用PNAFβ的不同稀释液测量的D.O.450nm，确定PNAFβ或PAFβ样品的参考稀释度。如图2所示，参考稀释液是获得最大D.O.450nm的80％所对应的稀释度。

在第二步中，将使用PNAFβ样品的参考稀释度获得的D.O.450nm与使用PAFβ样品的相同稀释度测量的D.O.450nm进行比较。如图3所示，能够特异性结合PNAFβ的抗体对在PAFβ样品上测量的D.O.450nm将比在PNAFβ样品上测量的D.O.450nm低50％。

选择能够特异性结合PNAFβ的抗体对(FRET方法)

为选择优先识别PNAFβ而不是PAFβ的抗体对，设置FRET测试。该测试基于CisbioBioassays

第一步，通过分析使用PNAFβ的不同稀释液测量出的HTRF信号，以确定PNAFβ或PAFβ样品的参考稀释度。如图5所示，参考稀释度是获得最大HTRF信号的80％(在免疫测定法的饱和平台之前)所对应的稀释液。

在第二步中，比较PNAFβ样品的参考稀释度获得的HTRF信号和使用PAFβ样品的相同稀释度测量的HTRF信号。如图6所示，能够特异性结合PNAFβ的抗体对在PAFβ样品上测量的HTRF信号比在PNAFβ样品上测量的HTRF信号低50％。

实施例2：允许识别能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法(FRET方法)

获得含有TDP-43AFβ或TDP-43NAFβ的样品的可替选的方法包括培养HeLa细胞，将其用星形孢菌素处理至少6小时或不作处理。通过SDS-PAGE和蛋白印迹法对细胞裂解物进行的分析表明，未经处理的HeLa细胞裂解物含有TDP-43NAFβ，而用星形孢菌素处理的HeLa裂解物基本上含有TDP-43AFβ[12]。

该方法基于实施例1中描述的FRET技术(来自Cisbio Bioassays的

待测抗体的制备

五种针对TDP-43的抗体分别用供体和接受体标记。这些标记是使用CisbioBioassays销售的标记试剂盒(商业参考号62EUSUEA和62D2DPEA)进行的。获得的标记率(每个抗体的荧光分子数)符合预期。供体标记率在5.9至7.9之间。接受体标记率在2.3至3.3之间。

下表给出受测抗体的表征。

[表1]

为了进行测试，所有抗体都在缓冲液中稀释，以分别获得浓度为3nM的供体标记的抗体，浓度为30nM的接受体标记的抗体。

TDP-43NAFβ(单体)样品的制备

将HeLa细胞以500万个细胞接种在烧瓶(175cm

TDP-43 AFβ(聚集体)样品的制备

将HeLa细胞以500万个细胞接种在烧瓶(175cm

在单体或聚集体上筛选抗体对

在测试当天，先将单体和聚集体样品解冻，然后再分配至384孔微孔板(Greiner，参考号784075)。

按照以下顺序将以下试剂添加至微孔板中：

-16μL单体样品或聚集体样品，

-2μL供体抗体

-2μL接受体抗体

然后，将板在室温下孵育过夜。

在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测各种板中的FRET信号。对于所有测试抗体对，通过计算FRET信号(单体/聚集体)的比率，比较在FRET中获得的在单体样品和聚集体样品上的信号，如图7所示，使用Ac1-供体/Ac4-接受体对。

计算所有测试抗体对的FRET信号比率(单体/聚集体)。下表2总结了所获得的结果。比率(单体/聚集体)大于2的所有抗体对都视为相对于TDP-43AFβ，对TDP-43NAFβ具有选择性。

[表2]

因为7对抗体对的单体/聚集体比率大于2，所以其允许在TDP-43NAFβ和TDP-43AFβ之间作出区分。在表3中列出7对抗体对。

[表3]

实施例3：用于识别能够特异性结合β1-40淀粉样肽NAFβ的抗体对的方法(FRET方法)

该方法基于实施例1中详细描述的FRET技术(来自Cisbio Bioassays的

测试抗体对

分别用供体和接受体标记的针对β1-40淀粉样肽的抗体是在Cisbio Bioassays销售的Amyloid Beta 1-40HTRF试剂盒中包含的抗体(参考号62B40PEG)。将其稀释在参考稀释液62RB3FDG中，如Amyloid Beta 1-40HTRF试剂盒手册所建议。

β1-40淀粉样肽NAFβ(单体)的制备

根据供应商的建议，将冻干的人β1-40淀粉样肽(ERI275BAS，The ERI AmyloidLaboratory，LLC，Oxford)重悬，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至30μM的浓度。然后，将含有β1-40淀粉样肽NAFβ的溶液(下文称为“单体样品”)在-80℃中冷冻。对该溶液进行硫黄素T测试。表明其含有超过90％的β1-40淀粉样肽单体。

β1-40淀粉样肽AFβ(聚集体)的制备

根据供应商的建议，将冻干的人β1-40淀粉样肽(ERI275BAS，The ERI AmyloidLaboratory，LLC，Oxford)重悬，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至30μM的浓度。然后，将该溶液在25℃中孵育495小时，这允许使得β1-40淀粉样肽聚集以获得β1-40淀粉样肽AFβ。然后，将含有β1-40淀粉样肽AFβ的溶液(下文称为“聚集体样品”)在-80℃中冷冻。对该溶液进行硫黄素T测试。表明其含有超过90％的β1-40淀粉样肽聚集体。

在单体或聚集体上测试抗体对

在测试当天，将单体和聚集体样品解冻，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至20.3ng/mL的浓度，然后分配至384孔微孔板中(Greiner，参考号784075)。

按照以下顺序将以下试剂添加至微孔板中：

-5μL单体样品或聚集体样品

-5μL稀释液(参考号62DL1DDD，Cisbio Bioassays)

-5μL供体抗体

-5μL接受体抗体

然后，将板在2℃至8℃之间的温度中孵育过夜。

在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测各种板中的FRET信号。通过计算FRET信号(单体/聚集体)的比率，比较在单体样品和聚集体样品在FRET中获得的信号，如图8所示。

该抗体对的FRET信号比率(单体/聚集体)大于2(值为3.1)。这表示该抗体对能够区分β1-40淀粉样肽NAFβ和β淀粉样肽1-40AFβ，也就是说该抗体对特异于β淀粉样肽1-40NAFβ。

实施例4：用于识别能够特异性结合β淀粉样肽1-42NAFβ的抗体对的方法(FRET方法)

该方法基于实施例1中详细描述的FRET技术(来自Cisbio Bioassays的

测试抗体对

两种分别用供体和接受体标记的针对β淀粉样肽1-42的抗体分别稀释至3nM(供体)和30nM(接受体)的浓度。

β1-42淀粉样肽NAFβ(单体)的制备

根据供应商的建议，将冻干的人β淀粉样肽1-42(The ERI Amyloid Laboratory，LLC，Oxford)重悬，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至30μM的浓度。然后，将含有β淀粉样肽1-42NAFβ的溶液(下文称为“单体样品”)在-80℃中冷冻。对该溶液进行硫黄素T测试。表明其含有超过90％的β淀粉样肽1-42单体。

β淀粉样肽1-42 AFβ(聚集体)的制备

根据供应商的建议，将冻干的人β淀粉样肽1-42(ERI275BAS，The ERI AmyloidLaboratory，LLC，Oxford)重悬，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至30μM的浓度。然后，将该溶液在25℃中孵育188小时。然后，将含有β1-42淀粉样肽AFβ的溶液(下文称为“聚集体样品”)在-80℃中冷冻。对该溶液进行硫黄素T测试。表明其含有超过90％的β淀粉样肽1-42聚集体。

在单体或聚集体上测试抗体对

在测试当天，将单体和聚集体样品解冻，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至2.4ng/mL的浓度，然后分配至384孔微孔板中(Greiner，参考号784075)。

按照以下顺序将以下试剂添加至微孔板中：

-16μL单体样品或聚集体样品

-2μL供体抗体

-2μL接受体抗体

将板在2℃至8℃之间的温度中孵育过夜。

在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测各种板中的FRET信号。通过计算FRET信号(单体/聚集体)的比率，比较在单体样品和聚集体样品在FRET中获得的信号，如图9所示。

研究的抗体对的FRET信号比率(单体/聚集体)大于2(值为4.5)。这表示该抗体对能够区分β1-42淀粉样NAFβ和β淀粉样1-42AFβ，也就是说该抗体对特异于β淀粉样肽1-42NAFβ。

实施例5：测试六氟异丙醇(HFIP)对使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

使用纯(100％)的HFIP，或者将HFIP在裂解缓冲液中稀释以获得20％、10％和2％的溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)8μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的100％、20％、10％和2％的不同HFIP溶液，或8μL的补充裂解缓冲液。

3)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图10给出了使用不同测试浓度的HFIP获得的信号。对于超过2％的浓度，HFIP将TDP-43NAFβ的检测信号降低超过75％。因此，将以这种形式以2％的浓度评价HFIP对聚集体的可能作用。

实施例6：HFIP作为TDP-43AFβ解聚剂的测试

将HFIP在裂解缓冲液中稀释以获得2％的溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)8μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的2％ HFIP溶液或裂解缓冲液。

3)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL接受体抗体Ac2，如实施例2所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号如下计算所获得的信号的比率：

信号比率＝(用2％的HFIP处理的样品信号)/(用裂解缓冲液处理的样品信号)。

图11给出获得的结果。信号比率小于或等于1(0.89)，这表示2％的HFIP处理没有在含有TDP-43AFβ的样品中增加PNAFβ的检测。可以得出结论，使用2％的HFIP的处理没有使TDP-43AFβ解聚，甚至部分解聚。

实施例7：测试尿素对使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

将尿素在裂解缓冲液中稀释以获得7M、3.5M、1.75M和0.88M的溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)8μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的不同尿素溶液(7M、3.5M、1.75M和0.88M)或裂解缓冲液。

3)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图12给出了使用不同测试浓度的尿素获得的信号。对于高于3.5M的浓度，尿素将TDP-43NAFβ的检测信号降低超过75％。因此，将以这种形式以小于或等于3.5M的浓度评价尿素对聚集体的可能作用。

实施例8：尿素作为TDP-43AFβ解聚剂的测试

将尿素在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得3.5M、1.75M和0.88M溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)8μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的不同浓度的尿素溶液(3.5M、1.75M和0.88M)或裂解缓冲液。

3)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用3.5M尿素处理的样品信号)/(用补充裂解缓冲液处理的样品信号)。

图13给出获得的结果。对于所有测试浓度的尿素，信号比率小于或等于1，这表示这些处理不会增加在聚集体样品中TDP-43PNAFβ的检测。可以得出结论，使用浓度小于或等于3.5M的尿素处理没有使TDP-43AFβ解聚，甚至部分解聚。

实施例9：测试氯化胍对使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

将氯化胍在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得6M、3M和1.5M溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)8μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的各种氯化胍溶液(6M、3M和1.5M)或补充的裂解缓冲液。

3)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图14给出了使用不同测试浓度的氯化胍获得的信号。无论氯化胍浓度如何，都会将TDP-43NAFβ的检测信号降低超过75％。因此，不能以这种形式评价氯化胍对聚集体的可能作用，因为这种化合物会阻止TDP-43NAFβ的检测。

实施例10：测试甲酸(AF)和三氟乙酸(TFA)对使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

将AF和TFA在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％、10％和2％的溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)8μL的根据实施例2中描述的操作方案制备的TDP-43NAFβ。

2)8μL的不同AF或TFA溶液(20％、10％和2％)、或补充的裂解缓冲液。

3)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图15给出了使用不同测试浓度的AF或TFA获得的信号。无论这些试剂浓度如何，其都会将TDP-43NAFβ的检测信号降低超过75％。因此，不能以这种形式评价AF或TFA对聚集体的可能作用，因为AF或TFA阻止TDP-43NAFβ的检测。

实施例11：测试甲酸(AF)之后用NaOH中和对使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

将AF在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NaOH在450mM HEPES缓冲液中稀释，以获得5N溶液

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的20％ AF溶液或补充的裂解缓冲液。将混合物在室温中孵育15分钟。在该步骤测量的pH等于2.5。

3)9μL的5N NaOH溶液或补充的裂解缓冲液。在这些添加后测量的pH等于7.6。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图16比较了用AF然后用NaOH处理获得的PNAFβ检测信号与未处理时获得的检测信号。该处理导致TDP-43NAFβ检测信号几乎完全消失。因此无法评价其对TDP-43AFβ解聚的可能作用。

实施例12：测试三氟乙酸(TFA)然后用NaOH中和对使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

将TFA在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NaOH在450mM HEPES缓冲液中稀释，以获得5N溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的20％ TFA溶液或补充的裂解缓冲液。将混合物在室温中孵育15分钟。在该步骤测量的pH等于0.6。

3)4.5μL的5N NaOH溶液或补充的裂解缓冲液。在此添加后测量的pH等于7.5。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图17将用TFA然后用NaOH处理获得的PNAFβ检测信号与未处理时获得的检测信号进行比较。即使这种处理显著影响TDP-43NAFβ的检测信号(-62％)，剩余的信号也允许测试其对TDP-43AFβ的解聚。

实施例13：测试三氟乙酸(TFA)然后用NaOH中和作为TDP-43AFβ解聚剂的作用

将TFA在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NaOH在450mM HEPES缓冲液中稀释，以获得5N溶液。

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的20％ TFA溶液或TFA/NaOH混合物(通过将8倍体积的20％ TFA溶液与4.5倍体积的5N NaOH溶液混合获得)。将混合物在室温中孵育15分钟。

3)4.5μL的5N NaOH溶液或TFA/NaOH混合物。在这种添加后测量的pH等于7.5。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号，如下计算所获得的信号的比率：

信号比率＝(用20％ TFA然后用5N NaOH处理的样品信号)/(用TFA/NaOH混合物处理的样品信号)。

图18给出获得的结果。信号比率小于或等于1(0.56)，表示该处理不会增加在聚集体样品中TDP-43NAFβ的检测。可以得出结论，使用20％ TFA处理之后用NaOH中和没有使TDP-43AFβ解聚，甚至是部分解聚。

实施例14：测试甲酸(AF)之后用NH

将AF在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NH

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的20％ AF溶液或补充的裂解缓冲液。将混合物在室温中孵育15分钟。在该步骤测量的pH等于2.5。

3)12μL的5N NH

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图19将用AF然后用NH

实施例15：测试甲酸(AF)之后用NH

将AF在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NH

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备

2)8μL的20％ AF溶液或AF/NH

3)12μL的5N NH

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号，如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用20％ AF然后用5N NH

图20给出获得的结果。信号比率小于或等于1(0.78)表示该处理不会增加在聚集体样品中TDP-43NAFβ的检测。可以得出结论，使用20％ AF处理之后用NH

实施例16：测试三氟乙酸(TFA)然后用NH

将TFA在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NH

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

2)8μL的20％ TFA溶液或补充的裂解缓冲液。将混合物在室温中孵育15分钟。在该步骤测量的pH等于0.6。

3)7μL的5N NH

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图21将用TFA然后用NH

实施例17：测试三氟乙酸(TFA)之后用NH

将TFA在补充的裂解缓冲液中稀释，以获得20％的溶液。

将NH

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备

2)8μL的20％ TFA溶液或TFA/NH

3)7μL的5N NH

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号，如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用20％ TFA然后用5N NH

图22给出获得的结果。信号比率小于或等于1(0.42)表示该处理不会增加在聚集体样品中TDP-43NAFβ的检测。可以得出结论，使用20％ TFA处理之后用NH

实施例18：使用NaOH溶液得到pH值介于8.2至13.3之间，之后用HCl中和，对使用TDP-43NAFβ检测试剂的方法的作用

测试的NaOH溶液

[表4]

测试的HCl溶液

[表5]

测试的NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的NaOH溶液和HCl溶液获得)

[表6]

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将以下试剂分配在96孔板中：

-60μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

-10μL的不同NaOH溶液(A、B、C、D、E或F)或缓冲液。将混合物在室温中孵育15分钟。

-10μL的不同HCl溶液(A、B、C、D、E或F)或缓冲液。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图23显示了用不同的处理模式获得的结果。用NaOH溶液处理得到pH为13.3，之后用HCl进行中和，没有检测到TDP-43NAFβ。可以测试所有其他溶液对TDP-43AFβ的解聚能力。

实施例19:确定使用NaOH解聚TDP-43AFβ的最小和最大pH

测试的NaOH溶液

[表7]

测试的HCl溶液

[表8]

测试的NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的NaOH溶液和HCl溶液获得)

[表9]

将以下试剂分配在96孔板中：

-60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

-10μL的不同NaOH溶液(A、B、C、D或E)或相应的NaOH/HCl混合物(A、B、C、D或E)。将混合物在室温中孵育15分钟。

-10μL的不同HCl溶液(A、B、C、D、E)或相应的NaOH/HCl混合物(A、B、C、D、E)。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号，如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用NaOH然后用HCl处理的样品信号)/(用NaOH/HCl混合物处理的样品信号)。

图24显示获得的结果作为由各种测试的NaOH溶液产生的pH的函数。当在解聚步骤期间的pH范围在8.5至13.2之间时，有可能检测到TDP-43NAFβ。然而，允许检测到TDP-43NAFβ的pH的最佳幅度约为pH 12.8。

实施例20：确定在pH 12.8时，解聚TDP-43AFβ所需的时间

将以下试剂按照如下顺序分配在96孔板中：

1)60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备

2)10μL的1.2N NaOH溶液(样品的pH调至12.8)或NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的1.2N NaOH溶液和1N HCl溶液获得)。根据孔的不同，混合物在室温下孵育30秒至1小时。

3)在使用1.2N NaOH处理的孔中，10μL的1N HCl溶液(样品的pH调至7.5)，或者在用NaOH/HCl混合物处理的孔中，10μL的NaOH/HCl混合物。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号，如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用1.2N NaOH然后用1N HCl处理的样品信号)/(用NaOH/HCl混合物处理的样品信号)。

图25显示获得的结果作为与1.2N NaOH接触时间的函数。结果表明，1.2N NaOH处理允许TDP-43AFβ至少部分解聚，与接触时间无关(信号比率始终大于1)。然而，在5分钟至30分钟的接触时间范围中获得最佳的解聚。

实施例21：确定对TDP-43NAFβ的检测进行测量时的最小和最大pH

测试的NaOH溶液

1.2N NaOH溶液(允许将样品的pH值调至12.8)

测试的HCl溶液

[表10]

测试的NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的NaOH溶液和HCl溶液获得)。

[表11]：

将以下试剂分配在96孔板中：

-60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

-10μL的不同1.2N NaOH溶液或相应的NaOH/HCl混合物(A、B、C、D、E、F、G、H或I)。将混合物在室温中孵育15分钟。

-10μL的不同HCl溶液(A、B、C、D、E、F、G、H或I)或相应的NaOH/HCl混合物(A、B、C、D、E、F、G、H或I)。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用1.2N NaOH然后用HCl处理的样品信号)/(用NaOH/HCl混合物处理的样品信号)。

图26显示，在pH＝12.8处理之后，当pH恢复至pH＝6至pH＝10.5之间时，可以检测到TDP-43NAFβ。当pH介于在6至8.5之间时，检测最佳。

实施例22:使用NaOH作为解聚剂以及HCl作为中和剂测量β淀粉样肽1-42的聚集水平

下述方法基于HTRF技术(原理参见实施例1)。

1.2N NaOH和1N HCl溶液如上文实施例中所述制备。

含有单体的(1-42NAFβ)或聚集的(1-42AFβ)β1-42淀粉样肽的样品的制备：根据供应商的建议，将冻干的人β1-42淀粉样肽(ERI275BAS，The ERI Amyloid Laboratory，LLC，Oxford)重悬，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至30μM的浓度(1-42NAFβ)。将相同的β1-42淀粉样肽溶液在25℃中孵育188小时以获得1-42AFβ。将2个样品冷冻在-80℃，以用于未来使用。使用前，通过硫黄素T方法检查2种样品的聚集水平。

在测试当天，将样品1-42NAFβ和1-42AFβ解冻，然后在pH 7.4的10mM磷酸钠缓冲液中稀释至2.4ng/mL的浓度，然后分配至微孔板中。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)12μL的1-42AFβ样品或1-42NAFβ样品。

2)2μL的1.2N NaOH溶液或NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的1.2N NaOH溶液和1N HCl溶液获得)。将混合物在室温中孵育15分钟。

3)2μL的1N HCl溶液或NaOH/HCl混合物。

4)添加FRET检测试剂：

-2μL的供体抗体，如实施例4中所述制备。

-2μL的接受体抗体，如实施例4中所述制备。

将板在2℃至8℃之间的温度中孵育过夜。

在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的HTRF信号，如下计算聚集比率：

信号比率＝(用1.2N NaOH然后用1N HCl处理的样品信号)/(用NaOH/HCl混合物处理的样品信号)。

图27显示了用样品1-42NAFβ和1-42AFβ获得的信号比率。在1-42AFβ样品上获得的信号比率远高于在1-42NAFβ样品上获得的信号比率。该结果表明该方法能够测量1-42淀粉样肽聚集的水平。

实施例23：用NaOH、氢氧化钾(KOH)或NH

制备用于处理TDP43-AFβ裂解物的NaOH、KOH、NH

[表12]

测试的HCl溶液

[表13]

测试的碱/HCl混合物(通过混合相同体积的NaOH溶液和HCl溶液获得)。

[表14]

将以下试剂分配在96孔板中：

-60μL的TDP-43NAFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

-10μL的不同碱溶液(A、B、C、D或E)或相应的碱/HCl混合物(A、B、C、D或E)。将混合物在室温中孵育15分钟。

-10μL的不同HCl溶液(A、B、C、D、E)或相应的碱/HCl混合物(A、B、C、D、E)。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物：

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图28显示通过不同处理获得的TDP-NAFβ检测信号。无论使用何种碱，只要执行使用HCl的中和步骤使得pH介于在7至8之间时，都可能检测到TDP-43NAFβ。因此，将测试这些碱对TDP-43AFβ的解聚作用。

实施例24：使用NaOH、氢氧化钾(KOH)或NH

制备用于处理TDP43-AFβ裂解物的NaOH、KOH、NH

[表15]

测试的HCl溶液

[表16]

测试的碱/HCl混合物(通过混合相同体积的NaOH溶液和HCl溶液获得)

[表17]

将以下试剂分配在96孔板中：

-60μL的TDP-43AFβ样品，根据实施例2中描述的操作方案制备。

-10μL的不同碱溶液(A、B、C、D或E)或相应的碱/HCl混合物(A、B、C、D或E)。将混合物在室温中孵育15分钟。

-10μL的不同HCl溶液(A、B、C、D、E)或相应的碱/HCl混合物(A、B、C、D、E)。

在添加FRET检测试剂之前，将96孔板的孔中包含的部分体积转移到384孔板中，其中具有：

-16μL的来自96孔板中的混合物

-2μL的供体抗体Ac1，如实施例2中所述制备

-2μL的接受体抗体Ac2，如实施例2中所述制备。

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

根据在样品上获得的FRET信号如下计算所获得的信号比率：

信号比率＝(用碱然后用HCl处理的样品信号)/(用碱/HCl混合物处理的样品信号)。

图29显示通过各种处理获得的信号比率。两种NaOH处理条件(1.2N和0.8N)分别给出12.8和9.6的pH值，允许检测TDP43-NAFβ，证实了其对TDP-43AFβ的解聚作用。用1.2N KOH(pH＝12.5)处理允许弱检测到TDP43-NAFβ，显示对TDP-43AFβ的弱解聚作用。使用NH

实施例25：允许识别能够特异性结合α-突触核蛋白NAFβ(α-Syn NAFβ)的抗体对的方法

该方法基于实施例1中详细描述的FRET技术(来自Cisbio Bioassays的

测试抗体对

在Cisbio Bioassays销售的HTRF总α-突触核蛋白试剂盒中(参考号6FNSYPEG)包含的是分别用供体和接受体标记的针对α-突触核蛋白的抗体对。按照用户手册的建议，每种抗体在试剂盒稀释液中进行稀释。

α-Syn NAFβ和α-Syn NAFβ样品的制备

α-Syn NAFβ和α-Syn AFβ获自StressMarq(StressMarq活性人重组A53T突变体α-突触核蛋白单体，参考号SPR-325以及活性人重组A53T突变体α-突触核蛋白预成型的原纤维1型，参考号SPR-326)。将其在HTRF总A-突触核蛋白试剂盒的裂解缓冲液中稀释至15.6ng/mL。

测试针对α-Syn NAFβ和α-Syn AFβ的抗体对

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)12μL的15.6ng/mL的α-Syn NAFβ或α-Syn AFβ

2)2μL的裂解缓冲液。将混合物在室温中孵育15分钟。

3)2μL的裂解缓冲液。

4)2μL的供体抗体。

5)2μL的接受体抗体。

在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测各种板中的FRET信号。

通过计算FRET信号(单体/聚集体)的比率，比较在α-Syn NAFβ样品(单体)和在α-Syn AFβ样品(聚集体)在FRET中获得的信号，如图30所示。

该抗体对的FRET信号的比率(单体/聚集体)大于2(值为6.64)。这表明相对于α-Syn Afβ，该抗体对能够特异性结合α-Syn NAFβ。

实施例26：1.2N NaOH溶液之后用1N HCl中和对使用能够特异性结合α-Syn NAFβ的抗体对的方法的检测能力的作用

α-Syn NAFβ(StressMarq，活性人重组A53T突变体α-突触核蛋白单体，参考号SPR-326)在HTRF总α-突触核蛋白试剂盒中(Cisbio Bioassays，参考号6FNSYPEG)的裂解缓冲液中稀释为15.6ng/mL。按照供应商在试剂盒手册中的建议，对HTRF总A突触核蛋白试剂盒中的供体和接受体抗体进行稀释。

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)12μL的15.6ng/mL的α-Syn NAFβ

2)2μL的1.2N NaOH溶液(样品的pH调至12.8)或NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的1.2N NaOH溶液和1N HCl溶液获得)。将混合物在室温中孵育15分钟。

3)在使用1.2N NaOH处理的孔中，2μL的1N HCl溶液(样品的pH调至7.5)，或者在用NaOH/HCl混合物处理的孔中，2μL的NaOH/HCl混合物。

4)2μL的供体抗体，如实施例25中所述制备

5)2μL的接受体抗体，如实施例25中所述制备

将板在室温中孵育过夜。在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测不同板中的HTRF信号。

图31给出获得的结果。其表明用1.2N NaOH处理然后用1N HCl中和对通过抗体检测α-Syn NAFβ几乎没有作用。因此，可以评估这种处理在分离出α-Syn AFβ中的作用。

实施例27:使用NaOH作为解聚剂以及HCl作为中和剂测量α-突触核蛋白的聚集水平

该方法基于实施例1中详细描述的FRET技术(来自Cisbio Bioassays的

测试抗体对

在Cisbio Bioassays销售的HTRF总α-突触核蛋白试剂盒中(参考号6FNSYPEG)包含的是分别用供体和接受体标记的针对α-突触核蛋白的抗体。将其按照用户手册的建议在试剂盒稀释液中进行稀释。

α-Syn NAFβ和α-Syn NAFβ样品的制备

α-Syn NAFβ和α-Syn AFβ获自StressMarq公司(StressMarq活性人重组A53T突变体α-突触核蛋白单体，参考号SPR-325以及活性人重组A53T突变体α-突触核蛋白预成型的原纤维1型，参考号SPR-326)。它们在HTRF总α-突触核蛋白试剂盒的裂解缓冲液中稀释至15.6ng/mL。

测试针对α-Syn NAFβ和α-Syn AFβ的抗体对

将以下试剂按照如下顺序分配在384孔板中：

1)12μL的15.6ng/mL的α-Syn NAFβ或α-Syn AFβ

2)2μL的1.2N NaOH溶液(样品的pH调至12.8)或NaOH/HCl混合物(通过混合相同体积的1.2N NaOH溶液和1N HCl溶液获得)。将混合物在室温中孵育15分钟。

3)在使用1.2N NaOH处理的孔中，2μL的1N HCl溶液(样品的pH调至7.5)，或者在用NaOH/HCl混合物处理的孔中，2μL的NaOH/HCl混合物。

4)2μL的供体抗体。

5)2μL的接受体抗体。

在PHERAstar FS Lamp设备(BMG Labtech)使用HTRF检测模块检测各种板中的FRET信号。

图32显示了用α-Syn NAFβ和α-Syn AFβ样品获得的信号比率。在α-Syn AFβ样品上获得的信号比率远高于在α-Syn NAFβ样品上获得的信号比率。该结果告诉我们，根据本发明的方法允许测量α-突触核蛋白的聚集水平。

附图说明

[图1]图1说明根据本发明的方法的一般原理。因此，比较PNAFβ水平(信号的比率)允许了解测试样品是否包含PAFβ。对于不包含PAFβ的样品，信号比率将等于1。对于包含PAFβ的样品，信号比率将大于1。

[图2]图2显示获自PNAFβ的不同稀释度的ELISA信号(D.O..)。最大信号的80％对应的D.O.值用于确定在实验的其余部分中使用的参考稀释度。

[图3]图3显示在ELISA测试中获得的结果，旨在确定抗体对是否选择性识别PNAFβ。A)PNAFβ非选择性抗体对。B)PNAFβ选择性抗体对。

[图4]图4显示HTRF免疫测定的原理。这种类型的免疫测定允许了解，分别用供体和接受体标记的两种抗体是否能够产生一对能够同时识别感兴趣抗原的抗体。A)2个测试的抗体不能产生一对能够识别感兴趣抗原的抗体；供体和接受体之间没有能量转移，因此接受体没有发射出荧光信号。B)两种测试的抗体能够同时识别感兴趣的抗原。然后，在供体和接受体之间发生能量转移。这导致通过接受体在665nm发射出特定荧光发射。

[图5]图5显示对于PNAFβ的不同稀释度获得的HTRF信号。最大信号的80％对应的HTRF信号值用于确定在实验的其余部分中使用的参考稀释度。

[图6]图6显示在HTRF测试中获得的结果，旨在确定抗体对是否选择性识别PNAFβ。A)PNAFβ非选择性抗体对。B)PNAFβ选择性抗体对。

[图7]图7显示用一对针对TDP-43蛋白的抗体获得的在TDP-43AFβ聚集体样品和TDP-43NAFβ单体样品之间的信号比率的计算。信号比率大于2表示测试的对对于TDP-43NAFβ具有选择性。

[图8]图8显示用一对针对β1-40淀粉样肽的抗体获得的在β1-40淀粉样肽的聚集体样品和相同肽的单体样品之间的信号比率的计算。大于2的信号比率值表示测试的对对于1-40淀粉样肽NAFβ(单体形式)具有选择性。

[图9]图9显示用一对针对β1-42淀粉样肽的抗体获得的在β1-42淀粉样肽的聚集体样品和该相同肽的单体样品之间的信号比率的计算。大于2的信号比率值表示测试的对对于1-42淀粉样肽NAFβ(单体形式)具有选择性。

[图10]图10显示六氟异丙醇(HFIP)对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图11]图11显示六氟异丙醇(HFIP)对于TDP-43AFβ的样品没有解聚作用。

[图12]图12显示尿素对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图13]图13显示尿素对于TDP-43AFβ的样品没有解聚作用。

[图14]图14显示氯化胍对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图15]图15显示甲酸(A)或TFA(B)对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图16]图16显示甲酸之后用NaOH中和对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图17]图17显示TFA之后用NaOH中和对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图18]图18显示TFA之后用NaOH中和对于TDP-43AFβ样品没有解聚作用。

[图19]图19显示甲酸之后用NH

[图20]图20显示甲酸之后用NH

[图21]图21显示TFA之后用NH

[图22]图22显示TFA之后用NH

[图23]图23显示使用NaOH溶液得到pH值介于8.2至13.3之间，之后用HCl中和，对于使用能够特异性结合TDP-43NAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图24]图24显示确定使用NaOH溶液解聚TDP-43AFβ样品的最小和最大pH。

[图25]图25显示确定使用pH＝12.8的NaOH溶液解聚TDP-43AFβ样品所需要的时间。

[图26]图26显示确定在测量对TDP-43NAFβ的检测时的最小和最大pH。

[图27]图27显示使用NaOH作为解聚剂之后用HCl中和以测量β1-42淀粉样肽的聚集水平。

[图28]图28显示NaOH、KOH和NH

[图29]图29显示NaOH、KOH和NH

[图30]图30显示用一对针对α-突触核蛋白的抗体获得的在d-突触核蛋白的聚集体样品(α-SynAFβ)和该相同蛋白的单体样品(α-SynNAFβ)之间的信号比率的计算。大于2的信号比率值表示测试的对对于α-SynNAFβ具有选择性。

[图31]图31显示NaOH溶液之后用HCl中和对于使用能够特异性结合α-SynNAFβ的抗体对的HTRF方法的检测能力的作用。

[图32]图32显示使用NaOH作为解聚剂之后用HCl中和以测量α-突触核蛋白的聚集水平。

参考文献

[1]Harrison et al，RNA-bindinq protealth and disease(2017)Biochem J.；474(8)：1417-1438.doi：10.1042/BCJ20160499

[2]Chang et al.，Detection and quantification of tau aggregation usinga membrane filter assay，Analytical Biochemistry 373(2008)330-336

[3]Howlett et al，Inhibition of hbril formation in b-amyloid peptideby a novel series of benzofurans,Biochem.j.(1999)340，283-289.

[4]Linghagen-Persson et al.，Amyloid-b Oligomer Specificity Mediatedby the IgM Isotype-Implications for a Specific Protective Mechanism Exertedby Endogenous Auto-Antibodies,PLoS ONE，November 2010| Volume 5|Issue 11|e13928

[5]Englund et al.，Sensitive ELISA detection of amyloid-b protofibrilsin biological samples，Journal of Neurochemistry，2007，103，334-345

[6]Van Helmond et al，Higher Soluble Amyloid b Concentration inFrontal Cortex of Young Adults than in Normal Elderly or Alzheimer′sDisease，Brain Pathology ISSN 1015-6305，doi：10.1111/j.1750-3639.2010.00374.x

[7]Selkoe eta1.，Isolation of Low-Molecular-Weight Proteins fromAmyloid Plaque Fibers in Alzheimer′s Disease，journal of Neurochemistry，(1986)

[8]Janssen et al.，Signal loss due to oligomerization in ELISAanalysis of amyloid-beta can be recovered by a novel sample pre-treatmentmethod,MethodsX 2(2015)112-123

[9]Sun et al.，Molecular Determinants and Genetic Modifiers ofAggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS，PLoS Biology，April 2011|Volume 9|Issue 4|e1000614

[10]Couthuis et al.，Evaluating the role of the FUS/TLS-related geneEWSR1 in amyotrophic lateral sclerosis,Human Molecular Genetics，2012，Vol.21，No.13 2899-2911

[11]Ryan et al.，Ammonium hydroxide treatment of Aβ produces anaggregate free solution suitable for biophysical and cell culturecharacterization,(2013)，PeerJ 1：e73；DOI 10.7717/peerj.73

[12]Dormann et al.，Proteolytic processing of TAR DNA binding protein-43by caspases produces C-terminal fragments with disease defining propertiesindependent of progranulin,(2009)，Journal of Neurochemistry，110，1082-1094

[13]Couthuis et al.，Ayeast functional screen predicts new candidateALS disease genes,PNAS|December 27，2011|vol.108|no.52|20881-20890