一种human TfR2高表达的稳转细胞株及其构建方法和应用

摘要

本发明适用于分子生物学技术领域，具体提供一种humanTfR2表达的CHO‑K1稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：S1.构建含humanTfR2编码基因的载体；S2.获得含humanTfR2编码基因的重组慢病毒；S3.CHO‑K1细胞的复苏、培养和感染；S4.阳性细胞筛选；S5.制备、筛选高表达TfR2稳转单细胞克隆；S6.多次验证。并使用本发明提供的构建方法，得到了humanTfR2高表达稳转CHO‑K1细胞株，可在筛选/制备靶向TfR2的药物或Tf/TfR2介导的药物的筛选中起到重要作用，可为上述筛选过程提供高效的细胞筛选模型和体外药效评价的方法，从而能够促进和帮助上述药物的研究开发，从而帮助患有相关疾病的患者的治疗。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种human TfR2稳转细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

转铁蛋白又名运铁蛋白(Transferrin，Tf)，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。以三价铁复合物(Tf-Fe

转铁蛋白(Tf)结合铁是通过与其受体，转铁蛋白受体2(TfR2)为其中的一种受体，它是一种蛋白质，由TfR2基因编码。这种蛋白质参与通过内吞作用将转铁蛋白结合的铁吸收到细胞中的过程。TfR2基因是转铁蛋白受体类家族的成员，编码一个单通的II型膜蛋白，具有一个蛋白酶相关(PA)结构域、一个M28肽酶结构域和一个转铁蛋白受体类二聚体结构域。TfR2介导细胞对转铁蛋白结合的铁的吸收，TfR2基因的突变与遗传性血色沉着病III型有关。

在与转铁蛋白(Tf)结合或者靶向TfR2的药物(包括小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体等)能否有效结合Tf2的高通量筛选、评估中，需要使用一种快捷的Tf-TfR2或药物-TfR2结合的体外细胞模型，这需要能够高水平、持续稳定表达TfR2的细胞株，而现有技术中则未建立符合要求的细胞株，这限制了上述过程的进行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，并提供使用该构建方法构建得到的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：

S1.构建含human TfR2编码基因的载体：合成human TfR2基因序列，将合成的所述human TfR2基因序列转入慢病毒载体得到所述含human TfR2编码基因的载体，转化、提取所述含human TfR2编码基因的载体；

S2.获得含human TfR2编码基因的重组慢病毒：将S1提取的所述含human TfR2编码基因的载体和辅助质粒共转染HEK293T细胞，培养转染后的HEK293T细胞，收集并合并上清液，过滤、离心获得所述含human TfR2编码基因的重组慢病毒；

S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染；

S4.阳性细胞筛选：使用嘌呤霉素筛选S3感染得到的CHO-K1细胞，筛选出嘌呤霉素阳性细胞，采用流式细胞术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出human TfR2表达的CHO-K1细胞，建立细胞池；

S5.制备、筛选高表达TfR2稳转单细胞克隆；

S8.多次验证：将S5筛选的高表达TfR2稳转单细胞克隆回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证；将二次验证中确认优选的高表达TfR2单细胞克隆回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆。

进一步的，所述S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染包括以下步骤：

1)将CHO-K1细胞于37℃水浴中迅速解冻后，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，对其计数后根据计数结果来调节细胞密度并培养；

2)对1)培养至合适的生长密度的CHO-K1细胞消化后中和，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，之后将其接种至培养皿中培养；

3)将培养皿中的CHO-K1细胞接种至6孔板培养，并加入S2中获得的含human TfR2编码基因的重组慢病毒感染。

进一步的，所述S5.制备、筛选高表达TfR2稳转单细胞克隆包括以下步骤：

a.单细胞克隆的制备：将细胞池中human TfR2表达的CHO-K1细胞稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔；

b.单细胞克隆筛选：从a中标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR2表达水平，根据表达水平的高低筛选出高表达TfR2稳转单细胞克隆。

进一步的，所述human TfR2基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种使用如上述的构建方法得到的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株。

本发明还提供一种如上述的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR2的药物或Tf/TfR2介导的药物筛选中的应用。

进一步的，所述靶向TfR2的药物为小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体。

进一步的，所述靶向TfR2的药物为治疗TfR2高表达的肿瘤或肌肉相关疾病或为通过TfR2递送所述靶向TfR2的药物来治疗的神经系统相关的肿瘤的药物。

进一步的，所述Tf/TfR2介导的药物为治疗由Tf或TfR2引起铁离子缺失而导致的细胞和代谢相关疾病的药物。

本发明还提供一种如上述的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR1的药物筛选过程中脱靶效应评价的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、使用本发明提供的构建方法，成功地将human TfR2蛋白在CHO-K1细胞上表达，建立了human TfR2高表达稳转CHO-K1细胞株，该细胞株可以弥补瞬时转染所具有的外源基因表达时间短的缺陷，故便于长期观察药物对于细胞功能的影响，可在筛选/制备靶向TfR2的药物或Tf/TfR2介导的药物的筛选中起到重要作用，可为上述筛选过程提供高效的细胞筛选模型和体外药效评价的方法，从而能够促进和帮助上述药物的研究开发，从而帮助患有上述疾病的患者的治疗；

2、本发明提供的构建方法使用慢病毒载体，相较于重组质粒载体、腺病毒等载体，慢病毒载体具有以下优势：1)可将外源基因或外源的RNA有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久表达目的基因的效果，且不会随着细胞传代而丢失；2)对于难以转染的原代细胞，慢病毒载体可提高原代细胞的转染效率；3)慢病毒载体具有较高的安全性，不会造成免疫原性；

3、本发明提供的构建方法使用CHO-K1细胞系，相较于传统细菌表达系统，具有表达量高、容易处理和操作以及法规接受程度高等特性；

4、使用本发明提供的构建方法构建出的细胞株其TfR2表达水平较高，能达到空白的763倍，且构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定的表达human TfR2。并且可以利用构建出的细胞株产生大量的TfR2，其量足以对TfR2产生的副作用进行评价，并也足以用于上市前/后药物警戒相关分析，为患者安全用药提供指导。

5、使用本发明提供的稳转细胞株可用于靶向TfR1的药物筛选过程中脱靶效应的评价。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为用活化酶细胞解离试剂消化细胞后，流式细胞术分析，用抗TfR2抗体染色的CHO-K1/TfR2细胞结果。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，下述实施例中的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获取。

本发明实施例一种human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：

S1.构建含human TfR2编码基因的载体：合成human TfR2基因序列，将合成的所述human TfR2基因序列转入慢病毒载体得到所述含human TfR2编码基因的载体，转化、提取所述含human TfR2编码基因的载体；

S2.获得含human TfR2编码基因的重组慢病毒：将S1提取的所述含human TfR2编码基因的载体和辅助质粒共转染HEK293T细胞，培养转染后的HEK293T细胞，收集并合并上清液，过滤、离心获得所述含human TfR2编码基因的重组慢病毒；

S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染；

S4.阳性细胞筛选：使用嘌呤霉素筛选S3感染得到的CHO-K1细胞，筛选出嘌呤霉素阳性细胞，采用流式细胞术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出human TfR2表达的CHO-K1细胞，建立细胞池；

S5.制备、筛选高表达TfR2稳转单细胞克隆；

S8.多次验证：将S5筛选的高表达TfR2稳转单细胞克隆回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证；将二次验证中确认优选的高表达TfR2单细胞克隆回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆。

其中，S1使用的慢病毒载体可将外源基因或外援的RNA有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久表达目的基因的效果。

其中，HEK293细胞又称人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点，是常见的表达研究外源基因的细胞株。S2中使用的HEK293T细胞是由HEK293细胞通过基因技术派生出的细胞系，具有较高外源基因的表达水平，同时HEK293T细胞是较HEK293细胞转染效率更高的衍生株，因此HEK293T细胞广泛应用于病毒包装。

其中，S3中使用的CHO细胞在生物药生产中应用早、表达量高、容易处理和操作以及法规接受程度高，CHO细胞还具有较高的基因和表型不稳定性，有着较多的细胞谱系(如CHO-K1)，致病性的病毒在CHO细胞中无法复制，因此CHO细胞被认为是非常安全的表达体系。本发明使用CHO-K1作为靶细胞。

其中，慢病毒载体携带可表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶的基因，被慢病毒感染的靶细胞能够稳定表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶，而未感染和整合慢病毒基因的靶细胞不能产生嘌呤霉素N-乙酰转移酶，嘌呤霉素的存在能够快速的杀死此类细胞，因此S4中通过培养基中添加一定量的嘌呤霉素可快速筛选出被慢病毒感染的靶细胞。

具体的，所述S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染包括以下步骤：

1)将CHO-K1细胞于37℃水浴中迅速解冻后，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，对其计数后根据计数结果来调节细胞密度并培养；

2)对1)培养至合适的生长密度的CHO-K1细胞消化后中和，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，之后将其接种至培养皿中培养；

3)将培养皿中的CHO-K1细胞接种至6孔板培养，并加入S2中获得的含human TfR2编码基因的重组慢病毒感染。

具体的，所述S5.制备、筛选高表达TfR2稳转单细胞克隆包括以下步骤：

a.单细胞克隆的制备：将细胞池中human TfR2表达的CHO-K1细胞稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔；

b.单细胞克隆筛选：从a中标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR2表达水平，根据表达水平的高低筛选出高表达TfR2稳转单细胞克隆。

具体的，所述human TfR2基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ IDNO.1的序列信息如下：

ATCGCTGGGGGACAGCCTGCAGGCTTCAGGAGGGGACACAAGCATGGAGCGGCTTTGGGGTCTATTCCAGAGAGCGCAACAACTGTCCCCAAGATCCTCTCAGACCGTCTACCAGCGTGTGGAAGGCCCCCGGAAAGGGCACCTGGAGGAGGAAGAGGAAGACGGGGAGGAGGGGGCGGAGACATTGGCCCACTTCTGCCCCATGGAGCTGAGGGGCCCTGAGCCCCTGGGCTCTAGACCCAGGCAGCCAAACCTCATTCCCTGGGCGGCAGCAGGACGGAGGGCTGCCCCCTACCTGGTCCTGACGGCCCTGCTGATCTTCACTGGGGCCTTCCTACTGGGCTACGTCGCCTTCCGAGGGTCCTGCCAGGCGTGCGGAGACTCTGTGTTGGTGGTCAGTGAGGATGTCAACTATGAGCCTGACCTGGATTTCCACCAGGGCAGACTCTACTGGAGCGACCTCCAGGCCATGTTCCTGCAGTTCCTGGGGGAGGGGCGCCTGGAGGACACCATCAGGCAAACCAGCCTTCGGGAACGGGTGGCAGGCTCGGCCGGGATGGCCGCTCTGACTCAGGACATTCGCGCGGCGCTCTCCCGCCAGAAGCTGGACCACGTGTGGACCGACACGCACTACGTGGGGCTGCAATTCCCGGATCCGGCTCACCCCAACACCCTGCACTGGGTCGATGAGGCCGGGAAGGTCGGAGAGCAGCTGCCGCTGGAGGACCCTGACGTCTACTGCCCCTACAGCGCCATCGGCAACGTCACGGGAGAGCTGGTGTACGCCCACTACGGGCGGCCCGAAGACCTGCAGGACCTGCGGGCCAGGGGCGTGGATCCAGTGGGCCGCCTGCTGCTGGTGCGCGTGGGGGTGATCAGCTTCGCCCAGAAGGTGACCAATGCTCAGGACTTCGGGGCTCAAGGAGTGCTCATATACCCAGAGCCAGCGGACTTCTCCCAGGACCCACCCAAGCCAAGCCTGTCCAGCCAGCAGGCAGTGTATGGACATGTGCACCTGGGAACTGGAGACCCCTACACACCTGGCTTCCCTTCCTTCAATCAAACCCAGTTCCCTCCAGTTGCATCATCAGGCCTTCCCAGCATCCCAGCCCAGCCCATCAGTGCAGACATTGCCTCCCGCCTGCTGAGGAAGCTCAAAGGCCCTGTGGCCCCCCAAGAATGGCAGGGGAGCCTCCTAGGCTCCCCTTATCACCTGGGCCCCGGGCCACGACTGCGGCTAGTGGTCAACAATCACAGGACCTCCACCCCCATCAACAACATCTTCGGCTGCATCGAAGGCCGCTCAGAGCCAGATCACTACGTTGTCATCGGGGCCCAGAGGGATGCATGGGGCCCAGGAGCAGCTAAATCCGCTGTGGGGACGGCTATACTCCTGGAGCTGGTGCGGACCTTTTCCTCCATGGTGAGCAACGGCTTCCGGCCCCGCAGAAGTCTCCTCTTCATCAGCTGGGACGGTGGTGACTTTGGAAGCGTGGGCTCCACGGAGTGGCTAGAGGGCTACCTCAGCGTGCTGCACCTCAAAGCCGTAGTGTACGTGAGCCTGGACAACGCAGTGCTGGGGGATGACAAGTTTCATGCCAAGACCAGCCCCCTTCTGACAAGTCTCATTGAGAGTGTCCTGAAGCAGGTGGATTCTCCCAACCACAGTGGGCAGACTCTCTATGAACAGGTGGTGTTCACCAATCCCAGCTGGGATGCTGAGGTGATCCGGCCCCTACCCATGGACAGCAGTGCCTATTCCTTCACGGCCTTTGTGGGAGTCCCTGCCGTCGAGTTCTCCTTTATGGAGGACGACCAGGCCTACCCATTCCTGCACACAAAGGAGGACACTTATGAGAACCTGCATAAGGTGCTGCAAGGCCGCCTGCCCGCCGTGGCCCAGGCCGTGGCCCAGCTCGCAGGGCAGCTCCTCATCCGGCTCAGCCACGATCGCCTGCTGCCCCTCGACTTCGGCCGCTACGGGGACGTCGTCCTCAGGCACATCGGGAACCTCAACGAGTTCTCTGGGGACCTCAAGGCCCGCGGGCTGACCCTGCAGTGGGTGTACTCGGCGCGGGGGGACTACATCCGGGCGGCGGAAAAGCTGCGGCAGGAGATCTACAGCTCGGAGGAGAGAGACGAGCGACTGACACGCATGTACAACGTGCGCATAATGCGGGTGGAGTTCTACTTCCTTTCCCAGTACGTGTCGCCAGCCGACTCCCCGTTCCGCCACATCTTCATGGGCCGTGGAGACCACACGCTGGGCGCCCTGCTGGACCACCTGCGGCTGCTGCGCTCCAACAGCTCCGGGACCCCCGGGGCCACCTCCTCCACTGGCTTCCAGGAGAGCCGTTTCCGGCGTCAGCTAGCCCTGCTCACCTGGACGCTGCAAGGGGCAGCCAATGCGCTTAGCGGGGATGTCTGGAACATTGATAACAACTTCTGAGGCCCTGGGGATCCTCACATCCCCGTCCCCCAGTCAAGAGCTCCTCTGCTCCTCGCTTGAATGATTCAGGGTCAGGGAGGTGGCTCAGAGTCCACCTCTCATTGCTGATCAATTTCTCATTACCCCTACACATCTCTCCACGGAGCCCAGACCCCAGCACAGATATCCACACACCCCAGCCCTGCAGTGTAGCTGACCCTAATGTGACGGTCATACTGTCGGTTAATCAGAGAGTAGCATCCCTTCAATCACAGCCCCTTCCCCTTTCTGGGGTCCTCCATACCTAGAGACCACTCTGGGAGGTTTGCTAGGCCCTGGGACCTGGCCAGCTCTGTTAGTGGGAGAGATCGCTGGCACCATAGCCTTATGGCCAACAGGTGGTCTGTGGTGAAAGGGGCGTGGAGTTTCAATATCAATAAACCACCTGATATCAATAA

本发明实施例还提供一种使用如上述的构建方法得到的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株。

本发明实施例还提供一种如上述的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR2的药物或Tf/TfR2介导的药物筛选中的应用。

具体的，所述靶向TfR2的药物为小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体。

具体的，所述靶向TfR2的药物为治疗TfR2高表达的肿瘤或肌肉相关疾病或为通过TfR2递送所述靶向TfR2的药物来治疗的神经系统相关的肿瘤的药物。

具体的，所述Tf/TfR2介导的药物为治疗由Tf或TfR2引起铁离子缺失而导致的细胞和代谢相关疾病的药物。

本发明实施例还提供一种如上述的human TfR2表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR1的药物筛选过程中脱靶效应评价的应用。

下面结合具体实施例说明：

实施例1构建含human

1.查询并确认human TfR2基因序列(NM_003227.4)，Human TfR2基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示，使用本领域常规的固相合成操作来合成human TfR2基因序列。

2.按本领域常规的技术操作，将合成的human TfR2序列转入慢病毒载体质粒，使用限制内切酶Xbal。

3.慢病毒载体质粒的转化：取一定量新鲜的NBE Stable感受态细胞，加入少量上述构建的质粒，冰浴30分钟；随后42℃水浴锅中保温90秒，再次冰浴1～2分钟；加入新鲜的LB培养基，37℃培养1h，随后取适当体积的复苏细胞，涂布在含抗生素的LB固体培养基上，倒置培养16小时。

4.提取慢病毒载体质粒：挑取LB固体培养基上的单菌落，接种于2mL液体培养基中，过夜培养，取一定量的培养物，离心后弃去培养液，使用市售的质粒提取试剂盒(碧云天#D0018)按说明书提取慢病毒载体质粒。

实施例2含human

1.将约1百万HEK293T细胞(慢病毒产生细胞)接种于10cm

2.用慢病毒载体和辅助质粒(包装质粒和包膜质粒)转染HEK293T细胞，转染6小时后去除培养基，更换为新鲜的DMEM完全培养基，过夜培养。

3.将培养皿上清液收集至无菌50mL离心管中，然后加入10mL新鲜的DMEM完全培养基，过夜培养。

4.将培养皿上清液收集至无菌50mL离心管中。

5.合并上清液，过滤、离心获取重组慢病毒。

实施例3CHO-K1细胞的复苏、培养和感染

1.CHO-K1细胞复苏

(1)准备培养基(F-12K完全培养基)，在15mL离心管中加入5mL新鲜的F-12K完全培养基。

(2)将细胞于37℃水浴中迅速解冻后移入15mL离心管中，吹匀后800rpm离心4分钟。

(2)弃去上清液，用1mL新鲜F-12K完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色后，用全自动细胞计数仪计算细胞数目和细胞活率。

(3)根据计数结果，取1000μL细胞悬液移入6cm

(4)显微镜下观察后放入细胞培养箱中过夜培养(37℃，5％CO

2.CHO-K1细胞培养

(1)向6cm

(2)800rpm离心4分钟，弃去上清液，加入1mL F-12K完全培养基重悬细胞团块。

(3)将细胞接种于6cm

(4)重复上述步骤培养至达到实验条件。

3.CHO-K1细胞感染

(1)将CHO-K1细胞接种于6孔板中，265细胞/孔，加入2mL F-12K完全培养基，过夜培养(37℃、5％CO

(2)每孔更换1mL包含8μg/mL Polybrene(聚凝胺)的新鲜F-12K完全培养基，将6孔板置于37℃、5％CO

(3)向6孔板中加入200μL浓缩的重组慢病毒，轻轻混匀；将6孔板置于离心机内800rpm离心30分钟，然后将6孔板置于37℃、5％CO

(4)去除培养基，加入新鲜的F-12K完全培养基，37℃、5％CO

实施例4加压培养(阳性细胞筛选)

1.向重组慢病毒感染后的细胞孔板内加入0.5mL 0.25％消化液，37℃消化3分钟，加入1mL新鲜F-12K完全培养基进行中和。

2.800rpm离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基重悬细胞团块。

3.将细胞接种于6cm

4.重复上述步骤，将细胞培养达到实验条件和细胞密度。

5.采用FACS技术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出TfR2表达的细胞，建立细胞池。

实施例5TfR2高表达稳转单细胞克隆筛选

1.单细胞克隆制备：将细胞池中human TfR2表达的细胞，稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有单细胞克隆的孔。具体按照下述步骤：

(1)吸弃旧培养基，加入1mL DPBS缓冲液洗一遍，吸弃DPBS缓冲液。

(2)加入1mL 0.25％胰酶37℃，消化3分钟(温度37℃)。

(3)吸弃胰酶，加入2mL新鲜F-12K完全培养基终止消化，并用移液器吹打下细胞。

(4)将细胞收集至15mL离心管中离心800rpm，4分钟，弃掉上清，用1mL新鲜F-12K完全培养基重悬细胞，吹匀并计数约4×l0

(5)稀释细胞至l×l0

(6)取100μL密度为l×l0

(7)用8道排枪将混合均匀的细胞悬液按照100μL/孔加入5个96孔板中。

(8)向96孔板所有孔中再补加100μL含8μg/mL嘌呤霉素F-12K完全培养基，并置于37℃，5％CO

(9)在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔。

2.单细胞克隆筛选：从标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR2表达水平，结果见表1，从表1中均可看出，预选的20个单细胞克隆表现出不同的TfR2表达水平，其中克隆3、克隆7、克隆9、克隆11和克隆12与CHO-K1细胞相比TfR2表达均大于800倍，说明该单细胞克隆具有较高的TfR2表达水平，将作为优选单细胞克隆进行进一步冻存稳定性和表达水平确认。

表1单细胞克隆TfR2表达水平

实施例6TfR2高表达稳转单细胞克隆的验证

二次验证：将高表达的TfR2优选单细胞克隆(克隆3、克隆7、克隆9、克隆11和克隆12)回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证，结果见表2，表2表明克隆3、克隆9、克隆11冻存并复苏后，传代培养均表现为TfR2高表达，TfR2表达水平克隆3＞克隆11＞克隆9；克隆11冻存和加压传代培养后，TfR2表达水平减弱，同源性较弱；因此选择克隆3和克隆9作为优选单细胞克隆进行冻存/传代稳定性和表达水平确认，确认最优克隆。

表2单细胞克隆TfR2表达水平

第三次验证：将二次验证确认优选的高表达TfR2单细胞克隆(克隆3、9)，回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆(克隆9)，结果见图1和表3，图1和表3表明克隆3、克隆9冻存并复苏后，传代培养后均表现为TfR2高表达，且克隆9TfR2表达水平高于克隆3，与CHO-K1宿主细胞相比，TfR2蛋白在克隆3和克隆9中分别过表达408倍和763倍。同时克隆9的TfR2高表达细胞分布优于克隆3，因此选择克隆9为最终单细胞克隆，进行扩大培养和冻存。

表3单细胞克隆TfR2表达水平

对第三次验证确定的最终克隆(克隆9)的细胞冷冻后检测其细胞活力，具体的检测步骤如下：

1.准备培养液(F-12K培养液)，在15mL离心管中加入5mL新鲜的培养液；

2.将细胞于37℃水浴中迅速解冻后移入15mL离心管中，吹匀后800rpm离心4分钟；

3.弃去上清，用1mL新鲜培养液重悬细胞，台盼蓝染色后，用细胞计数仪计算细胞数目；

4.根据被染色的细胞和未被染色的细胞数目计算细胞活率。

检测结果见表4，从表4中可看出，细胞恢复后，克隆9的活力为≥80％。

表4克隆9细胞冷冻后的细胞活力的检测结果

其中，上述的扩大培养和冻存参照下述步骤：

1.扩大培养

(1)向培养皿中按比例加入适量的0.25％消化液，37℃消化3分钟，加入适量新鲜F-12K完全培养基进行中和。

(2)800rpm离心4min，弃去上清，用适量新鲜F-12K完全培养基重悬细胞团块。

(3)将细胞接种于2个15cm

(4)将培养皿置于细胞培养箱中继续培养37℃，5％CO

2.细胞冻存

(1)冻存前记录细胞代次，细胞汇合度和密度。

(2)向培养皿中按比例加入适量的0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加入适量新鲜F-12K完全培养基进行中和。

(3)800rpm离心4min，弃去上清，加入适量冻存液(Optivitro无蛋白、CD细胞冻存液)，轻轻混匀后，分装至冻存管内。

(4)将冻存管放入梯度降温盒中，置于-80℃冰箱24小时，然后转移至液氮罐内保存。

上述涉及FACS技术的实施例中，FACS技术具体操作步骤如下述：

1.将待测细胞收集至离心管中，800rpm离心4分钟，弃去上清，加入1mL PBS缓冲液800rpm离心4分钟，弃去上清获取细胞。

2.用FACS缓冲液(99％杜氏磷酸盐缓冲溶液+1％胎牛血清)进行细胞重悬，调整细胞密度至10×10

3.加入TfR2抗体(货号：MAB31202)到检测板上，4℃孵育1小时。

4.然后加入1000μL FACS缓冲液，800rpm离心4分钟，弃去上清。

5.加入1000μLFACS缓冲液进行细胞重悬，800rpm离心4分钟。

6.加入二次检测抗体工作液或直接标记抗体工作液。

7.加入二抗(PE山羊抗小鼠IgG(最小x反应性)二抗，货号：405307))到检测孔板上，然后在4℃的黑暗中孵育20分钟。

8.取出检测孔板，离心，弃去上清。

9.用FACS缓冲液在检测孔板上重悬浮细胞颗粒。

10.调整细胞密度至10×10

11.使用40μm细胞过滤器对细胞进行过滤。

12.使用流式细胞仪进行样品检测。

13.数据分析：FACS检测的原始数据从BD FACSDiva软件v8.0.1.1中导出，并使用FlowJo v10.8.0进行分析。

实施例7TfR2高表达细胞株的应用

1.将TfR2高表达细胞和TfR1细胞株扩大培养至一定数量，将细胞分别收集至离心管中，800rpm离心4分钟，弃去上清，加入1mLPBS缓冲液800rpm离心4分钟，弃去上清获取细胞。

2.用FACS缓冲液将细胞进行重悬，调整细胞密度至10×10

3.将候选分子(候选TfR1抗体)、阳性对照和阴性对照(Human IgG)调整至相同浓度，取一定量加入检测孔板内，4℃孵育60分钟。然后加入1000μLFACS缓冲液，800rpm离心4分钟，弃去上清。加入1000μLFACS缓冲液进行细胞重悬，800rpm离心4分钟。

4.加入二抗(PE山羊抗小鼠IgG(最小x反应性)二抗，编号：405307)到检测孔板上，然后在4℃的黑暗中孵育20分钟。

5.然后加入1000μLFACS缓冲液，800rpm离心4分钟，弃去上清。

6.加入1000μLFACS缓冲液进行细胞重悬，800rpm离心4分钟。

7.调整细胞密度至10×10

8.使用40μm细胞过滤器对细胞进行过滤。

9.使用流式细胞仪进行样品检测。

10.筛选结果见表5，由表可见对于结合效应：TfR1阳性对照具有较强的信号，空白对照无信号，候选分子信号成多样性分布，部分候选分子信号强度与阳性对照接近。对于脱靶效应：所有的候选分子、空白对照、阳性对照均无信号，表明候选分子与TfR2蛋白无结合，无脱靶风险。

表5 TfR2细胞株作为细胞模型应用于TfR1药物筛选过程中脱靶效应评估

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。