靶向M1ap基因的核酸组合物、少弱精子症动物模型的制备方法及应用

摘要

本申请涉及一种靶向M1ap基因的核酸组合物、少弱精子症动物模型的制备方法及应用。该核酸组合物包括第一sgRNA和第二sgRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该靶向M1ap基因的核酸组合物通过验证能够对M1ap基因的高效且快速敲除，测序结果证实了小鼠体内M1ap基因的敲除，且第一sgRNA和第二sgRNA序列在待改变的M1ap基因上的靶序列上是唯一的。

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，特别涉及一种靶向M1ap基因的核酸组合物、少弱精子症动物模型的制备方法及应用。

背景技术

精原干细胞是动物中最具自我更新能力的细胞之一，在生精小管的生发上皮内以有序的方式从基底部到腺腔内增殖。基底室和腺腔间隔由支持细胞之间的紧密连接所分隔，这形成了血-睾丸屏障。精原细胞和前细线条细胞位于基底室，减数分裂细胞位于腺腔段。初级精母细胞(减数分裂I)在I期前期依次分化为四个形态定义的阶段：细线期、合线期、粗线期和双线期。随后，双线细胞经历G2/M转变，将它们的染色体排列在中期I板上，以期待细胞分裂和次级精母细胞(减数分裂II)的形成，然后在没有DNA复制的情况下再次分裂，形成圆形精子细胞，然后再分化为细长的精子细胞，然后分化为精子。

然而目前不孕不育困扰着全球约10-15％的育龄期夫妇，导致不孕症的原因主要有睾丸因素、卵巢因素和输卵管缺陷，三者概率接近。减数分裂缺陷被认为约占男性非梗阻性无精子症和严重少精子症的48％。研究发现，特异性高表达于睾丸组织的基因有2300多种，这其中超过800个基因通过模式动物证实其缺失可导致精子发生障碍而引起男性不育，随着以全外显子测序为代表的新一代测序技术在男性不育患者致病基因筛查中的广泛应用，一些导致少弱精子症的致病基因突变陆续被发现，这为少弱精子症患者的诊断、预防和生育治疗提供了重要的分子依据。然而，这些已报道的少弱精子症的致病基因只能解释不到5％的患者，大部分特发性少弱精子症患者的遗传病因并不清楚，为这类患者的精准防治带了巨大的挑战，研究并建立少弱精子症的动物模型为探明疾病病因、发病机制和治疗药物开发具有重要意义。

由此，目前亟需有效的构建少弱精子症动物模型的方法。

发明内容

基于此，本申请设计了简单有效的方式，利用Crispr-Cas系统快速敲除M1ap基因，构建该疾病的动物模型Crispr-Cas系统能够在第一sgRNA和第二sgRNA的指引下在精准切割DNA造成双链断裂，基因组中的M1ap基因的第三外显子～第六外显子之间的39066bp的DNA片段能够被切除，使M1ap基因失去功能，从而实现基因敲除。

本申请的具体方案如下：

本申请的一方面提供一种靶向M1ap基因的核酸组合物，所述核酸组合物包括第一sgRNA和第二sgRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本申请另一方面提供一种靶向M1ap基因的基因功能失活试剂盒，所述试剂盒包括如上述的核酸组合物。

本申请还提供一种少弱精子症动物模型的制备方法，包括以下步骤：使用Crispr-Cas系统编辑目标动物的M1ap基因使其功能失活，制备少弱精子症动物模型；

其中所述Crispr-Cas系统包括如上述的核酸组合物和Cas9核酸酶。

在其中一个实施例中，所述Crispr-Cas系统处理的对象为所述目标动物的受精卵。

在其中一个实施例中，所述Crispr-Cas系统以所述核酸组合物和Cas9mRNA的形式转入所述受精卵。

在其中一个实施例中，所述Crispr-Cas系统转入所述受精卵的方法为显微注射。

在其中一个实施例中，所述制备方法还包括以下步骤：将转入所述Crispr-Cas系统的受精卵移植到假孕雌性动物体内并产出F0代；

将所述F0代与野生型进行交配，获得F1代杂合子，将F1代杂合子进行自交，获得纯合的F2代。

在其中一个实施例中，所述目标动物为小鼠或大鼠。

在其中一个实施例中，所述目标动物为小鼠，所述制备方法还包括对小鼠进行基因型鉴定的步骤：以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，分别采用正向引物序列如SEQ IDNo.3、反向引物序列如SEQ ID No.4所示的第一扩增引物对及正向引物序列如SEQ IDNo.3、反向引物序列如SEQ ID No.5所示的第二扩增引物对进行PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的M1ap基因型。

基于上述技术方案，本申请具有以下有益效果：

本申请设计的靶向M1ap基因的核酸组合物通过验证能够对M1ap基因的高效且快速敲除，测序结果证实了小鼠体内M1ap基因的敲除。其中，第一sgRNA和第二sgRNA序列在待改变的M1ap基因上的靶序列上是唯一的。

由该方法获得的M1ap基因敲除小鼠作为研究精子发生障碍且阻滞发生在减数分裂阶段的少弱精子症动物模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。

本申请还提供一种筛选或鉴定用于治疗少弱精子症的药物的方法，使用如上述的核酸组合物、上述的试剂盒或上述的少弱精子症动物模型的制备方法制得的少弱精子症动物模型，筛选或鉴定用于治疗少弱精子症的药物。

附图说明

图1为实施例1中利用Crispr-Cas系统构建了M1ap基因敲除小鼠结果图；

图2为实施例1中野生型小鼠M1ap基因扩增产物电泳图；

图3为实施例1中纯合型小鼠M1ap基因扩增产物电泳图；

图4为实施例1中杂合型小鼠M1ap基因扩增产物电泳图。

具体实施方式

为了便于理解本申请，下面将参照实施例对本申请进行更全面的描述，以下给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

基因敲除(knockout)是指通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的一种技术。它可以针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因敲除分为完全基因敲除和条件性基因敲除(Conditional Knockout，CKD，又称不完全基因敲除)两种，完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件性基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。Crispr-Cas系统是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

Crispr-Cas系统应用于基因敲除的原理是，tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA(即sgRNA)时用来指导Cas9作用。针对目的基因，通过人工设计的sgRNA(small guideRNA，sgRNA)来识别目的基因序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成DNA的双链断裂，从而实现基因敲除。

第一次减数分裂阻滞蛋白基因(Meiosis 1Arrest Protein，M1ap)，这是一种生殖细胞基因，是男性减数分裂I进展所必需的。在探索存在于小鼠6号染色体上mnd2非重组区域的基因时，该区域已被认为与进行性神经肌肉变性有关。基于逆转录病毒插入突变研究，还发现M1ap与Cbfb(核心结合因子)-MYH11(肌球蛋白重链11)易位在急性髓系白血病发病过程中具有协同作用。尽管有这些观察，但无论是神经肌肉疾病还是急性髓系白血病，M1ap的功能仍未明确。虽然M1ap在雄性和雌性生殖系中都有表达，但我们发现它对雄性生殖细胞的发育至关重要，因为大多数M1ap缺陷的精母细胞在中期I的粗线期检查点或后来的纺锤体检查点通过凋亡而被消除。

小鼠M1ap基因为第一次减数分裂阻滞蛋白基因，位于六号染色体正链上，全长83407bp，编码一种可能在减数分裂过程中起作用的蛋白质。可变剪接可产生三个转录本编码不同的同种异构体。仅在胚胎卵巢和成体睾丸的生殖细胞中表达。在雄性小鼠中，从精原细胞到次级精母细胞的M1ap表达在进化上是保守的，并具有特定的空间和时间模式，提示在生殖细胞发育过程中发挥了作用。因此，M1ap基因功能失活可以应用于阻滞发生在减数分裂阶段的少弱精子症动物模型的制备。

基于此，本申请一实施方式提供一种靶向M1ap基因的核酸组合物，所述核酸组合物包括第一sgRNA和第二sgRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

具体地，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为：5'-ACTTTAGGTGATCTTCAAACTGG-3'；如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：5'-AGCTCAACCGTCTTCACATGGGG-3'。

本申请一实施方式，提供了一种靶向M1ap基因的基因功能失活试剂盒，该试剂盒包括上述的核酸组合物。

上述设计的靶向M1ap基因的核酸组合物和试剂盒通过验证能够对M1ap基因的高效且快速敲除，测序结果证实了小鼠体内M1ap基因的敲除。其中，第一sgRNA和第二sgRNA序列在待改变的M1ap基因上的靶序列上是唯一的。

本申请一实施方式，提供一种少弱精子症动物模型的制备方法，包括以下步骤：使用Crispr-Cas系统编辑目标动物的M1ap基因使其功能失活，制备少弱精子症动物模型。

可选地，制备方法包括步骤S10～步骤S40。

步骤S10：使用Crispr-Cas系统编辑目标动物的M1ap基因使其功能失活，将Crispr-Cas系统转入受精卵，得到转入Crispr-Cas系统的受精卵。

在其中一些实施例中，上述Crispr-Cas系统包括上述的核酸组合物和Cas9核酸酶。

在其中一些实施例中，Crispr-Cas系统处理的对象为目标动物的受精卵。

在其中一些实施例中，Crispr-Cas系统以核酸组合物和Cas9 mRNA的形式转入受精卵。

在其中一些实施例中，Crispr-Cas系统转入受精卵的方法为显微注射。

步骤S20：将步骤S10中转入Crispr-Cas系统的受精卵移植到假孕雌性动物体内并产出F0代。

步骤S30：将步骤S20中F0代与野生型进行交配，获得F1代杂合子。

步骤S40：将步骤S30中F1代杂合子进行自交，获得纯合的F2代。

在其中一些实施例中，上述目标动物为小鼠或大鼠。

在其中一些实施例中，上述目标动物为C57BL/6J小鼠。

在其中一些实施例中，上述目标动物为小鼠，在步骤S20、步骤S30及步骤S40中分别得到F0代、F1代及F2代的步骤均包括对小鼠进行基因型鉴定的步骤，对小鼠进行基因型鉴定的步骤包括步骤a、步骤b、步骤c、步骤d及步骤e。

步骤a：提取小鼠脚趾的基因组DNA。

步骤b：以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，分别采用正向引物序列如SEQ IDNo.3、反向引物序列如SEQ ID No.4所示的第一扩增引物对及正向引物序列如SEQ IDNo.3、反向引物序列如SEQ ID No.5所示的第二扩增引物对进行PCR扩增后，得到扩增产物。

具体地，第一扩增引物对，其序列分别为：正向引物M1ap-F(SEQ ID NO.3):5'-GGATGGTGAGGAGAACCATGAGGTC-3'；反向引物M1ap-WT-R(SEQ ID NO.4):5'-CACTCAGGCTTTGACTAATTGGCAG-3'；第一扩增引物对的Tm值为58℃；第二扩增引物对，其序列分别为：正向引物M1ap-F(SEQ ID NO.3):5'-GGATGGTGAGGAGAACCATGAGGTC-3'；反向引物M1ap-KO-R(SEQ ID NO.5):5'-GTAGAACACTCACCAGCAAGCAGTGAC-3'；第二扩增引物对的Tm值为59℃。

可理解，设计的第一扩增引物对主要针对正常的M1ap基因片段，由于第一扩增引物对位于第一sgRNA剪切位点的两侧，突变部分的DNA序列没有与反向引物匹配的区域，无法发生扩增；而设计的第二扩增引物对主要针对缺失变异的片段，由于第二扩增引物对位于突变部分的两侧，正常的M1ap基因片段没有与第二扩增引物对匹配的缺失区域，并且突变部分本身也没有引物序列，因此无法发生扩增，而在存在缺失变异的M1ap基因片段中，由于特定区段的缺失，使得引物间的距离缩短，从而提高了PCR扩增的效率，可以扩增出特定长度的片段。如此，可以通过观察扩增产物的长度来判断样本中是否存在缺失变异。

在其中一些实施例中，步骤b中，PCR的扩增程序设置为：95℃预变性5min；94℃变性30s～45s、56℃～72℃退火30s～60s、72℃延伸30s～60s，共循环30～35次；最后72℃延伸5min～10min，PCR扩增产物放置于4℃保存。可以理解的是，在其他一些具体示例中，PCR程序可以合理调整。

在一个具体示例中，PCR的扩增程序设置为：95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR扩增产物放置于4℃保存。

步骤c：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

在其中一个实施例中，步骤c中，分别取3μL～5μL PCR扩增产物和DL2000DNAMarker点入胶孔中，220V电泳10min～20min，成像拍照。

在其中一个实施例中，步骤c中，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物的条带大小无误。

步骤d：对扩增产物进行测序。

在其中一个实施例中，步骤d中，测序方法为Sanger测序。

在其中一个实施例中，步骤d中，使用与PCR扩增引物对相同的引物对进行测序分析。

步骤e：鉴定小鼠的M1ap基因型。

在其中一个实施例中，步骤e中，将步骤d测序得到的序列与野生型M1ap基因的相应的DNA序列如SEQ ID NO：6所示进行比对，分析是否为M1ap基因敲除小鼠。

具体地，如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为：5'-CATTCTGCTCGGGGTATTGTTGGCTCCTTAATTAAGTGAGATTCTCTTCTT CACTGAAATGCCCCTGAGGAATGGATTCAATAGATCCTTATCAATTATAAAATGAGAGACCACATCACAATTCTTGTTTCAGGAGAAACATTTTTTGTTGTTGTTTGAAAGATTGTCAATATATAGCTCCAAATACCTTGAACTCTAATAATAGCCTGAACTCTCAGTCCTCCAGCCTCAGCTTCTTGAATGCTGTAATACCAAGCTAGGGAAACATCATTCTTAAACAGAGAATCTCTTAGTGACAGACTAAGAAACCCAGATAGTATCTAAAGTTAGCCCTCTTAGACTTCCAGTTTGAAGATCACCTAAAGTAAAACTATAGTCATGGCCTGGACACATGGCTCAGCAGTTAAGAGCACTTGTTGCTCTTTCAGAGGACCCAGACTTGGCTCTCAGCTCCCACACAGTGACTCACAACTTCAGATCCAGGAAATCTGGTGCTCTCTTACAGCCTCTGAAGGCACCAGGCACACACATGGTGCACATTTTAGGTGCAGAGCACTCATACACCTAAAGTAGTTGCAAAGACCTTTCACTGAACGTGTAACTGAATTATCACGTTTCCTTCCCTGTTTCTGATAAATCCACAGCATCTAGGATTTTTAGCTGCATTCTTCCTTCTGATTTAGAGAAATTTTAGTGCAATACTTAGAACATGATTGACATTCTGTATGTGTCAGTCAGACATACATGGTTTTAGGAAGGAGAGGAACTCCTAAGGAGTTACTGATGAAATAAAACTGCCATACAAAAGCCCGCGGCGGGGAGGGGAACAACCAA-3'。

在其中一个实施例中，步骤e中，敲除小鼠M1ap基因的第三外显子～第六外显子之间的39066bp的DNA片段被切除。

上述少弱精子症动物模型的制备方法至少具备如下优点：

(1)通过靶向M1ap基因的第一sgRNA和第二sgRNA序列使M1ap基因功能失活而制备精子发生障碍且阻滞发生在减数分裂阶段的少弱精子症动物模型。

(2)该制备方法可以通过条件性基因敲除实现特定时间和空间的M1ap基因敲除。

此外，本申请一实施方式还提供了一种筛选或鉴定用于治疗少弱精子症的药物的方法，使用如上述的核酸组合物、上述的试剂盒或上述的少弱精子症动物模型的制备方法制得的少弱精子症动物模型，筛选或鉴定用于治疗少弱精子症的药物。

上述筛选或鉴定用于治疗少弱精子症的药物方法利用上述的核酸组合物、上述的试剂盒或上述的少弱精子症动物模型的制备方法制得的少弱精子症动物模型筛选或鉴定用于治疗少弱精子症的药物，由于上述少弱精子症动物模型针对精子发生障碍且阻滞发生在减数分裂阶段的少弱精子症动物模型，对于筛选或鉴定涉及作用于减数分裂阶段的少弱精子症的药物更准确。

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

所有小鼠均在中南大学湘雅医学院实验动物学部的无特定病原体(SPF级)的条件下，按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南以及中南大学实验动物福利伦理委员会的标准进行饲养。

1.靶向M1ap基因的核酸组合物的序列设计

针对小鼠M1ap基因设计并合成了第一sgRNA和第二sgRNA：

第一sgRNA(SEQ ID NO.1)：5'-ACTTTAGGTGATCTTCAAACTGG-3'；

第二sgRNA(SEQ ID NO.2)：5'-AGCTCAACCGTCTTCACATGGGG-3'。

2.M1ap基因敲除鼠的构建

2.1构建含有上述第一sgRNA和第二sgRNA的质粒。

2.2线性化及纯化质粒DNA并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA。

1)线性化载体

①选择合适的位点对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量40％-60％之间的位点进行克隆。

②酶切制备线性化载体时，尽量使用双酶切方法使载体线性化完全，降低转化背景。

③将载体线性化，在插入目标片段的5’端引入线性化载体的末端序列，使得目标片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列。

2)纯化质粒DNA

①取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，13000rpm离心30秒收集细菌，尽量吸弃全部上清。

②向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer P1(事先检查是否加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

③向离心管中加入250μL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变的清凉粘稠。

④向离心管中加入250μL Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色徐庄沉淀，室温放置5分钟。13000rpm离心5分钟，吸取上清液，将上清液加入过滤柱(Endo-Remover FM)中，13000rpm离心1分钟过滤，滤液收集在离心管中。

⑤向滤液中加入225μL异丙醇，上下颠倒混匀。

⑥柱平衡：向已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中加入200μLBuffer PS，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑦将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。

⑧13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑨向吸附柱中加入750μL Buffer PW(事先检查是否加入无水乙醇)，13000rpm离心1等，倒掉收集管中的废液。

⑩将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1分钟。

2.3受精卵的准备

1)受精卵的准备：筛选3周～4周C57BL/6J雌鼠，分别注射孕马血清(PMSG)与绒毛膜促性腺激素(hcg)，两者时间间隔46-48h；

2)注射HCG后将雌鼠与成年的可育雄鼠交配，使雌鼠受精；

3)次日将雌鼠安乐死后，从输卵管内收集受精卵，放置37℃恒温5％的CO

2.4电转受精卵：打开电穿孔仪，连接正负极，设置好电转参数，待用；将准备好的受精卵放入酸式液中进行透明带弱化，10S～20S；同时将制备好的mRNA溶液加样到电极皿中；

1)将弱化后的受精卵，清洗3遍，并转移至电极皿中进行电转；

2)电转完毕后的受精卵转移到M16培养基中，并放入37℃恒温5％的CO

2.5代孕鼠制备及胚胎移植

1)准备假孕母鼠：选取适龄的可育母鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激母鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的代孕鼠；

2)将已经注射了外源基因的受精卵移植到见栓当天的代孕母鼠的输卵管内；

3)移植后将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养；

4)输卵管移植成功后，母鼠一般会在手术后19d～20d产仔；

5)小鼠出生1周后，可对小鼠进行剪爪编号，同时进行PCR-Sanger测序鉴定；小鼠出生3周后，可分笼独立饲养。

2.6出生后代F0、F1、F2基因型鉴定

采集1-2周龄的幼鼠组织(脚趾)；对组织进行裂解和提取基因组DNA；用针对目的基因的特异性引物进行PCR扩增及Sanger测序，筛选出外源基因整合的后代；有整合的鼠称为首建鼠(founder)，可进行传代和建系。

2.6.1敲除鼠gDNA提取及纯化

使用天根公司的gDNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit，DP304-03)提取。步骤如下：

1)动物房剪小鼠脚趾装在1.5mL EP管中带回，加入180μL缓冲液GA，使用酒精消毒的剪刀将组织剪碎；

2)加入20μL Proteinase K溶液，上下颠倒混匀；

3)将EP管插入浮漂中并置于56℃水浴箱内水浴1h，期间颠倒混匀1次；

4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min；

5)加人200μL无水乙醇，上下颠倒混匀后再于振荡器上剧烈震荡15sec；

6)将上述中混合液于已放入收集管并做好标记的吸附柱，12000rcf/min离心30sec，弃收集管并将吸附柱放入全新收集管；

7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，上下颠倒混匀后，12000rcf/min离心30sec，弃收集管并将吸附柱放入全新收集管；

8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，上下颠倒混匀后，12000rcf/min离心30sec，弃收集管并将吸附柱放入全新收集管；重复步骤(8)；

9)将吸附柱于12000rcf/min空离2min，弃收集管并将吸附柱放入全新1.5mL EP管，晾干5min；

10)向吸附膜的中间部位悬空滴加250μL TE，室温静置5min后，12000rcf/min离心1分钟，弃吸附柱盖好EP管，并做好标记。

2.6.2PCR及Sanger测序进行基因型鉴定

杂交繁育的后代小鼠通过PCR和Sanger测序基于脚趾基因组DNA进行基因分型，所用引物包括：第一扩增引物对，其序列分别为：正向引物M1ap-F(SEQ ID NO.3):5'-GGATGGTGAGGAGAACCATGAGGTC-3'；反向引物M1ap-WT-R(SEQ ID NO.4):5'-CACTCAGGCTTTGACTAATTGGCAG-3'；第一扩增引物对的Tm值为58℃；

第二扩增引物对，其序列分别为：正向引物M1ap-F(SEQ ID NO.3):5'-GGATGGTGAGGAGAACCATGAGGTC-3'；反向引物M1ap-KO-R(SEQ ID NO.5):5'-GTAGAACACTCACCAGCAAGCAGTGAC-3'；第二扩增引物对的Tm值为59℃。

PCR扩增体系(30μL)如下：

表1

PCR扩增程序如下：

表2

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增的目的条带无误后，将剩余的PCR扩增产物送至擎科生物科技有限公司(北京，中国)进行Sanger法测序验证。

3.结果分析

(1)测序结果分析以及序列对比

本申请利用Crispr-Cas系统在小鼠(C57BL/6)中成功构建了包含M1ap基因的敲除，如图1所示。

通过对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序方法对基因型进行判断。测序结果分析软件为“Chromas”，序列对比软件使用在线网站：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。杂合子小鼠测序结果的“峰形图”为：峰形为双峰；野生型和纯合子小鼠因PCR产物是单一的DNA分子，两种基因型的测序结果“峰形图”，在突变位点处均为正常的单峰，但两种基因型的峰图信号不同。

1)基因型鉴定结果判定标准如下表3所示：

表3

注：两对引物要分别进行PCR。

2)小鼠各基因型结果分析

①野生型：分别用M1ap-F+M1ap-WT-R和M1ap-F+M1ap-KO-R两对引物按表1的体系进行表2的PCR程序，可以得到M1ap-F+M1ap-WT-R引物的PCR产物有0.8kb的条带和M1ap-F+M1ap-WT-R引物的PCR产物无条带，其琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，对PCR产物使用M1ap-F引物进行Sanger测序，所得结果如下SEQ ID NO.6所示。

具体地，如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为：5'-CATTCTGCTCGGGGTATTGTTGGCTCCTTAATTAAGTGAGATTCTCTTCTTCACTGAAATGCCCCTGAGGAATGGATTCAATAGATCCTTATCAATTATAAAATGAGAGACCACATCACAATTCTTGTTTCAGGAGAAACATTTTTTGTTGTTGTTTGAAAGATTGTCAATATATAGCTCCAAATACCTTGAACTCTAATAATAGCCTGAACTCTCAGTCCTCCAGCCTCAGCTTCTTGAATGCTGTAATACCAAGCTAGGGAAACATCATTCTTAAACAGAGAATCTCTTAGTGACAGACTAAGAAACCCAGATAGTATCTAAAGTTAGCCCTCTTAGACTTCCAGTTTGAAGATCACCTAAAGTAAAACTATAGTCATGGCCTGGACACATGGCTCAGCAGTTAAGAGCACTTGTTGCTCTTTCAGAGGACCCAGACTTGGCTCTCAGCTCCCACACAGTGACTCACAACTTCAGATCCAGGAAATCTGGTGCTCTCTTACAGCCTCTGAAGGCACCAGGCACACACATGGTGCACATTTTAGGTGCAGAGCACTCATACACCTAAAGTAGTTGCAAAGACCTTTCACTGAACGTGTAACTGAATTATCACGTTTCCTTCCCTGTTTCTGATAAATCCACAGCATCTAGGATTTTTAGCTGCATTCTTCCTTCTGATTTAGAGAAATTTTAGTGCAATACTTAGAACATGATTGACATTCTGTATGTGTCAGTCAGACATACATGGTTTTAGGAAGGAGAGGAACTCCTAAGGAGTTACTGATGAAATAAAACTGCCATACAAAAGCCCGCGGCGGGGAGGGGAACAACCAA-3'。

②纯合型：分别用M1ap-F+M1ap-WT-R和M1ap-F+M1ap-KO-R两对引物按表1的体系进行表2的PCR程序，可以得到M1ap-F+M1ap-WT-R引物的PCR产物无条带和M1ap-F+M1ap-WT-R引物的PCR产物有0.6kb条带，其琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，对PCR产物使用M1ap-F引物进行Sanger测序，所得结果如下SEQ ID NO.7所示。

具体地，如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列为：5'-ACGGCTCACGAGTATTGTTGGCTCTTAATTAAGTGAGATTCTCTTCTTCACTGAAATGCCCCTGAGGAATGGATTCAATAGATCCTTATCAATTATAAAATGAGAGACCACATCACAATTCTTGTTTCAGGAGAAACATTTTTTGTTGTTGTTTGAAAGATTGTCAATATATAGCTCCAAATACCTTGAACTCTAATAATAGCCTGAACTCTCAGTCCTCCAGCCTCAGCTTCTTGAATGCTGTAATACCAAGCTAGGGAAACATCATTCTTAAACAGAGAATCTCTTAGTGACAGACTAAGAAACCCAGATAGTATCTAAAGTTAGCCCTCTTAGACTTCCAGTGAAGACGGTTGAGCTCTGAAAACTTTCCGTGTGCAGATCTGACCACACATTATGTAATTTACACAGCCTGATGCACAATAAGGTCCAGAGCCGAATTCAGGAGGATGTGGTTAGAGGTCCGGGATACCACTAAGAAACACTTTCTTTTCCAGGGCTCTGAAATCTAGTGGGATCTGCGAGTCCCTGACCTATGGACTACCCTTCATTCTCAGACCCACAAGCTGTTGGCAGCTGGACTGGGATGAGCTGGAAACAAATCAACAACATTTTCATGCCCTGTGTCACTGCTTGCTGGGAAGGGGTTCCAAAAAAATGTG-3'。

③杂合型：分别用M1ap-F+M1ap-WT-R和M1ap-F+M1ap-KO-R两对引物按表1的体系进行表2的PCR程序，可以得到M1ap-F+M1ap-WT-R引物的PCR产物有0.8kb条带和M1ap-F+M1ap-WT-R引物的PCR产物有0.6kb条带，其琼脂糖凝胶电泳图如图4所示，对PCR产物使用M1ap-F引物进行Sanger测序，两对引物所得结果分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

综上，本发明第一次成功构建了M1ap基因敲除小鼠动物模型，为进一步研究M1ap的功能奠定了良好的基础。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。