技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于诊断川崎病冠状动脉瘤的生物标志物及其应用。
背景技术
川崎病(Kawasaki disease,KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征，多发于5岁以下儿童，是一种病因不明，以全身非特异性血管炎为特征的儿童获得性心血管疾病。该病主要累及中小动脉，尤其是冠状动脉。据统计，约25％未经治疗的KD患儿可进展为冠状动脉瘤(Coronary artery aneurysm,CAA)，冠状动脉狭窄，缺血性心脏病，甚至心肌梗塞而危及生命。早期治疗联合应用静脉用丙种球蛋白(Intravenous immunoglobulin,IVIG)和阿司匹林(Aspirin，ASA)后，冠状动脉瘤的比率可降至5％-6％。据研究显示，童年时患过KD的患儿，在成年后早期极易出现动脉粥样硬化，血栓，或者心肌梗死等缺血性心脏病，严重影响人类健康，给社会带来巨大的经济负担。目前临床上尚缺乏特异性的实验室诊断指标，尤其是早期预测冠脉瘤的指标，临床上主要依据超声心动图，对已发生的冠脉瘤进行诊断。
尽管近年来，越来越多的学者们致力于找寻川崎病早期诊断的生物学标志物，分别发现炎症标志物(CRP，降钙素原)，免疫标志物(Treg和Th17细胞比例失衡，促炎细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α)，蛋白标志物(氨基末端脑钠肽前体(N-terminal probrainnatriuretic peptide，NT-proBNP)，凝血酶致敏蛋白(thrombospondin，TSP)，骨膜蛋白)，血清外泌体miRNA(miR-1246，miR-4436b-5p，miR-197-3p，miR-671-5p)等可能作为川崎病诊断的分子标志物。虽然炎症标志物、免疫标志物可以辅助用于KD的临床诊断，但这些标志物对KD的诊断特异性较低。NT-proBNP虽可作为KD床旁检测的理想指标，但可能与其他伴有心功能障碍的发热疾病相混淆。另外几种蛋白质生物标志物仍处于早期发现阶段，且大多数研究结果是建立在单个中心的小样本研究对象之上，需要在更大的人群进行验证，才可能将其应用于临床。到目前为止，仍未发现一个生物学标志物可提早预测川崎病有瘤患者，能在疾病早期给予有效治疗，从而降低川崎病血管病变的风险，提高KD患儿的生活质量。
血小板激活是川崎病炎症的主要病理学特征。研究表明，在冠状动脉疾病(CAD)，血小板激活如白细胞血小板聚集和p-选择素表达升高，与心血管事件的发生密切相关。在败血症小鼠模型中，血小板和单核细胞聚集数早在造模4h时明显升高，并与致死率成正相关；在所有白细胞中，单核细胞对血小板的亲和力最高，极易与血小板形成聚集。然而，在川崎病急性期，是否存在血小板与单核细胞相互作用，血小板和单核细胞聚集数能否成为川崎病冠脉瘤的特异性诊断指标，尚不清楚。
本发明提供了一种川崎病冠脉瘤的诊断标志物，通过血小板和单核细胞聚集数来诊断川崎病冠脉瘤；该检测方法的优势在于，仅需少量外周血，收集白细胞成分，通过检测CD41
发明内容
本发明的目的在于提供一种诊断川崎病冠脉瘤的生物标志物。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供血小板单核细胞聚集体(monocyte-plateletaggregates,MPA)作为标志物在制备诊断川崎病冠状动脉瘤和/或川崎病冠状动脉瘤严重程度判断的产品中的应用。
本发明的第二方面，提供检测血小板单核细胞聚集体的物质在制备诊断川崎病冠状动脉瘤和/或川崎病冠状动脉瘤严重程度判断的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述诊断为早期诊断；也即川崎病急性期的诊断；可以通过检测血小板单核细胞聚集体来对川崎病急性期是否有瘤进行诊断。
在本发明的一些实施方式中，所述检测血小板单核细胞聚集体的物质为检测所述血小板单核细胞聚集体所需的试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述检测血小板单核细胞聚集体的物质包括通过流式细胞术、单细胞测序、免疫荧光中的至少一种方法检测血小板单核细胞聚集体的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述血小板单核细胞聚集体为CD14
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
本发明的第三方面，提供一种诊断川崎病冠状动脉瘤和/或川崎病冠状动脉瘤严重程度判断的产品，所述产品包括本发明第二方面所述检测血小板单核细胞聚集体的物质。
本发明的第四方面，提供血小板单核细胞聚集体作为靶点在筛选或制备川崎病冠状动脉瘤靶向药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，将候选药物给药川崎病冠状动脉瘤模型动物，检测给药前后动物样品中血小板单核细胞聚集体的表达量差异；其中，若给药后标志物表达量与给药前表达量有显著差异，则是候选药物为靶向药物的指示。对于目标靶向药物的筛选具有极为重要的意义。
本发明的第五方面，提供筛选治疗川崎病冠状动脉瘤药物的方法，通过检测给药前后川崎病冠状动脉瘤患者的血小板单核细胞聚集体的比例。
本发明的有益效果是：
本发明鉴定出一种新的川崎病冠状动脉瘤的生物标志物-血小板单核细胞聚集体，发现有瘤患者中的血小板单核细胞聚集体水平高于川崎病无瘤患者，说明血小板单核细胞聚集体可用于川崎病冠状动脉瘤的诊断或辅助诊断，其AUC为0.9883，具有非常高的诊断价值。相对传统的川崎病有瘤或无瘤的诊断指标，本发明具有取材更为方便，采血量更少，特异性更强，灵敏度更高，且能绝对定量，结果更为准确的优势，能够快速，准确，客观诊断川崎病冠状动脉瘤病变，这是传统诊断方法所不具备的优势。
附图说明
图1为单细胞测序证实KD急性期患儿外周血存在MPA％，而正常对照组儿童不存在。其中图1A为单细胞分析技术检测对照组(HC、Fever)组、KD急性期，KD恢复期患儿外周血PBMC中细胞分布，单核细胞分布明显不同；图1B显示单核细胞和血小板标志基因在细胞群中的表达；图1C显示MPA细胞在各组人群细胞中的占比改变。
图2为流式细胞术检测MPA在HC、KD急性期(Acute KD)、恢复期(Recovery KD)水平的统计图。
图3为流式细胞术检测MPA在KD急性期检测患者是否进展为有瘤(CAA)和无瘤(NCAA)的统计图。
图4为MPA对于区分有瘤(CAA)和无瘤(NCAA)的ROC曲线。
图5为MPA与冠脉瘤Z score(根据内径大小及体表面积计算出相应Z值)的相关性分析。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实验材料：人外周血淋巴细胞分离液Ficoll，FACS液，FITC-鼠抗人CD14+抗体，APC-鼠抗人CD41+抗体。
实施例1标志物的筛选
人外周血PBMC分离方法：
A.获取病人2-3ml血液样本；
B.在离心管中加入等量的Ficoll，将血液样本自上而下缓慢加入，置于离心机下，按照1800rpm，离心20min，使血液样本不同成分分层分离；
C.用加样枪缓慢吸取中间白细胞层后，PBS洗涤两次，每次5min；
D.取10ul PBMC与FITC-鼠抗人CD14+抗体，APC-鼠抗人CD41+抗体孵育，30min后，采用流式细胞仪检测；
单细胞测序证实川崎病(Kawasaki disease,KD)急性期患儿外周血存在MPA％，而正常对照组儿童不存在：如图1所示，收集对照组(Healthy Control，HC)和KD患儿外周血单个核淋巴细胞(Periphery blood mono-nuclear cell,PBMC)，采用单细胞分析技术检测PBMC中细胞分布，发现单核细胞分布明显不同，其中如图，绿色标记为Fever组单核细胞，蓝色标记为HC单核细胞，红色标记为KD急性期单核细胞，黄色标记为KD恢复期单核细胞(图1A)。在红色标记的单核细胞发现CD14
实施例2标志物的验证
进一步收集新入院患者外周血PBMC，于急性期采用流式细胞术检测MPA。如图2所示，采用流式细胞术分析发现，KD急性期患者外周血PBMC中确实存在CD14
根据后期影像学结果，判断患者是否有瘤或者无瘤，将KD急性期有瘤组为CAA，无瘤组为NCAA，分析NCAA和CAA的MPA水平，结果发现，KD有瘤组，急性期MPA水平显著高于NCAA组(图3)。
进一步，采用线性回归和ROC曲线分析急性期KD-CAA和NCAA组的MPA水平(图4)。分析结果表明，急性期MPA水平能够明显区别有瘤和无瘤组，曲线下面积(Area under curve,AUC)为0.9883；95％可信区间(confidence interval,CI),0.9605-1.000)，具有非常高的特异性，提示，MPA可作为判断川崎病患儿是否可能有瘤的良好指标；具有非常好的特异性和诊断价值。
根据美国心脏病协会的KD诊断标准，采用超声心动图观察KD患儿左前降支和右冠状动脉的内径，根据内径大小及体表面积计算出相应Z值，可对CAA患者进行分类，通常Zscore越大，冠脉瘤越大。进一步分析急性期检测的MPA和Z score的相关性发现，MPA与Z-score呈正相关(图5)。提示，MPA能够很好的预测KD冠脉瘤，与疾病严重程度呈正相关。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
机译： 蛋白质生物标志物和诊断川崎病的方法
机译： 蛋白生物标志物和诊断川崎病的方法
机译： 蛋白生物标志物和诊断川崎病的方法
