山蒟总黄酮提取物在制备保肝药物中的应用

摘要

本发明公开了山蒟总黄酮提取物在制备保肝药物中的应用，其中，所述山蒟总黄酮提取物的制备方法为：以山蒟为原料，加入溶媒进行提取，提取液浓缩成浸膏，所得浸膏进一步纯化，得到总黄酮含量≥50％的山蒟总黄酮提取物；所述的溶媒为含1～3个碳原子的低碳醇和丙酮中的一种或两种以上的组合。申请人通过实验发现，山蒟总黄酮提取物可以减轻四氯化碳致肝损伤、非酒精性脂肪性肝病和药物性肝损伤模型小鼠的肝损伤或肝病严重程度，并抑制炎症反应和氧化应激，可用于制备保肝/护肝的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及植物提取物的应用，具体涉及山蒟总黄酮提取物在制备保肝药物中的应用。

背景技术

山蒟(Piper hancei Maxim.)为胡椒科胡椒属中药，主要分布在我国广西、广东、福建、浙江、江西、湖南、云南和贵州等省区，具有祛风散寒、舒筋活络、消肿止痛和镇痉等功效，常用于风湿性关节炎、腰膝无力、咳嗽气喘等病症的治疗。研究表明，山蒟有显著的镇痛和抗炎作用，还可以抑制血小板聚集，改善血流动力学，增加冠脉流量，改善心肌缺血和提高心肌耐缺氧的能力(蔡少青,王璇主编.常用中药材品种整理与质量研究北方编,第六册.北京医科大学出版社，2003.)。

山蒟化学成分复杂，含有黄酮类、生物碱类、新木脂烷类、木脂素类、苯丙素类和萜类等化合物。现有技术中对山蒟的提取物及应用也有一定的研究，如：

公布号为CN101401850A的发明专利，公开了一种山蒟总生物碱提取物，其中指出提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取或高压提取等，优选的提取工艺为：山蒟药材加30～90％乙醇，回流提取2～3次，每次提取1～2小时，溶剂用量为15～30倍量(L/kg)。但该发明中并未涉及山蒟总生物碱提取物的具体应用。

硕士学位论文“山蒟提取物对实验性动脉粥样硬化的影响及机理初探”(枉前，第三军医大学，2005.)指出，山蒟提取物(由山蒟切碎后以95％乙醇浸置24小时后回流提取三次，每次一小时，减压干燥而得)对高脂饲养家兔具有较为显著的调脂作用，还能显著降低高脂饲养家兔主动脉粥样硬化病变的发生率，显著降低家兔冠状动脉粥样硬化病变的等级，并认为发挥调脂作用的物质基础可能是一些天然的黄酮类化合物。

但至今尚未见有以山蒟总黄酮提取物应用于保肝药物中的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供山蒟总黄酮提取物在制备保肝药物中的应用。

本发明的技术方案为：山蒟总黄酮提取物在制备保肝药物中的应用，其中，所述山蒟总黄酮提取物的制备方法为：以山蒟为原料，加入溶媒进行提取，提取液浓缩成浸膏，所得浸膏进一步纯化，得到总黄酮含量≥50％(HPLC法，以芦丁计，下同)的山蒟总黄酮提取物；所述的溶媒为含1～3个碳原子的低碳醇和丙酮中的一种或两种以上的组合。

本申请中，山蒟总黄酮提取物对四氯化碳致肝损伤、非酒精性脂肪性肝病和药物性肝损伤均具有显著的保肝护肝作用。

本申请中涉及的山蒟总黄酮提取物的制备方法中，作为溶媒的低碳醇优选为甲醇、乙醇或正丙醇，最优选为乙醇；所述低碳醇的浓度优选为≥50v/v％，进一步优选为60～80v/v％，更优选为65～70v/v％。所述的提取的方式可以是现有常规的浸提、渗漉提取、超声提取或加热提取，从工业产业化而言，优选采用加热提取，此时，提取优选在50℃至溶媒的沸点温度范围内进行，更优选是在75～80℃条件下进行回流提取。提取的次数可根据需要进行，通常为1～3次；每次提取时所用溶剂的量与现有常规提取操作相同，具体可以是原料重量的6～20倍；每次提取的时间可以是0.5～3h，也可以是更长的时间；为了更有利于提取，优选是将山蒟切碎或粉碎后再进行提取操作。

本申请中涉及的山蒟总黄酮提取物需要是总黄酮含量≥50％，更优选总黄酮含量≥60％。因此需要对山蒟粗提物(浸膏)进行纯化，具体可采用现有技术中能够获得更高总黄酮含量的常规操作实现对浸膏进行纯化，如将浸膏上大孔树脂柱或硅胶柱层析，用乙醇洗脱，收集65～75v/v％乙醇洗脱部位，回收乙醇后干燥以得到总黄酮含量≥50％的山蒟总黄酮提取物。其中涉及的大孔树脂的型号可以是现有技术中的常规选择，优选为HPD600、D101、HP-20或AB-8等。在洗脱时，更优选是收集70v/v％乙醇洗脱部位。

为了获得更高的总黄酮提取率，申请人对山蒟总黄酮提取物的提取工艺进行了优化，具体实验方法及结果如下：

1山蒟总黄酮提取物的提取工艺研究

1.1材料与仪器

山蒟药材购于桂林市七星区六合路药材市场，经桂林医学院张可锋教授鉴定为山蒟(Piper hancei Maxim.)的全草。芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所，无水乙醇、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。Epoch酶标仪购自美国Bio-Tek公司，FRESCO 21高速冷冻离心机购自美国赛默飞公司，DF-25粉碎机购自温岭市林大机械有限公司，101-1电热鼓风干燥箱购自北京中兴伟业仪器有限公司，UW-2200H电子天平购自日本岛津公司。

1.2绘制标准曲线

1.2.1对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品，配制质量浓度为0.40g/L的70v/v％乙醇溶液，混匀，备用。

1.2.2供试品溶液的制备将山蒟粉碎，过80目筛，置60℃恒温烘箱中烘干，放于干燥器中备用。精密称取山蒟粉末约1.0g，加入20mL的70v/v％乙醇，在80℃下回流提取1次，过滤后4 000r/min离心，取上清液备用。

1.2.3标准曲线的绘制精密吸取0.5mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL芦丁对照品溶液，分别置于25mL容量瓶中，先加5w/w％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；再加10w/w％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；然后加4w/w％氢氧化钠溶液5mL，用70v/v％乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。在510nm处测定吸光度A，以吸光度值A为纵坐标，芦丁对照品溶液质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A＝0.0139C-0.0321(R

1.3方法学验证

1.3.1精密度试验取供试品溶液1.0mL，按照1.2.3项进行检测，在510nm处测定吸光度，重复5次，计算RSD值为0.41％，表明仪器性能稳定。

1.3.2稳定性试验取同一供试品溶液，按照1.2.3项进行检测，分别于0h，0.5h，1h，1.5h和2h时测定吸光度，RSD值为0.54％，表明供试品溶液在2h内稳定性良好。

1.3.3重复性试验精密称取山蒟粉末5份，每份约1.0g，制备供试品溶液5份，按照1.2.3项进行检测，计算RSD为1.45％，表明该方法重复性较好。1.3.4回收率试验精密称取山蒟粉末约1.0g，按1.2.2和1.2.3项处理后，计算总黄酮含量；然后精密称取同一批山蒟粉末3份，分别加入约相当于总黄酮含量的0.8倍，1.0倍和1.2倍的芦丁对照品，再按1.2.2和1.2.3项处理后，计算平均回收率为96.42％，表明该方法测定总黄酮含量较为准确。

1.4单因素试验

1.4.1提取次数精密称取山蒟粉末3份，每份约1.0g，固定料液比1g：20mL，乙醇浓度70v/v％，提取温度80℃，提取时间1h，提取次数分别为1次，2次和3次，合并滤液。按1.2.2项制备供试品溶液，并按1.2.3项在510nm测定吸光度，总黄酮提取率分别为1.65％，1.87％，1.88％。提取2次后，提取率增加并不明显，而且提取次数为非连续变量，故把提取次数固定为2次。

1.4.2料液比精密称取山蒟粉末5份，每份约1.0g，固定乙醇浓度70％，提取温度80℃，提取时间1h，提取2次，分别加入10倍、15倍、20倍、25倍、30倍量70v/v％乙醇，合并滤液。按照1.2.2和1.2.3项在510nm测定吸光度，计算总黄酮提取率为1.62％，1.96％，1.97％，1.97％，1.96％。料液比在1g：20mL时得率最大，考虑到工艺成本等因素，故将料液比固定为1g：20mL。

1.4.3提取温度精密称取山蒟粉末5份，每份约1.0g，固定料液比1g：20mL，乙醇浓度70v/v％，提取时间1h，提取2次，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下回流提取，合并滤液。参照1.2.2和1.2.3项测定吸光度，计算总黄酮提取率分别为1.45％，1.56％，1.6％，1.79％，1.99％，1.80％。在70℃时提取率最高，再增加温度提取率略有下降。

1.4.4提取时间精密称取山蒟粉末5份，每份约1.0g，固定料液比1g：20mL，乙醇浓度70v/v％，提取温度80℃，提取2次，提取时间分别为30min、60min、90min、120min、150min，合并滤液。按照1.2.2项制备供试品溶液，并按1.2.3项在510nm测定吸光度，得总黄酮提取率分别为1.34％，1.56％，1.78％，1.98％，1.70％。随着温度的增加，提取率呈先升高后下降的趋势，在120min时出现峰值，故将120min作为中间水平值。

1.4.5乙醇浓度精密称取山蒟粉末5份，每份约1.0g，固定料液比1g：20mL，提取温度80℃，提取2次，提取时间1h，乙醇浓度分别为30v/v％，50v/v％，60v/v％，80v/v％，90v/v％，合并滤液。按1.2.2和1.2.3项在510nm测定吸光度，总黄酮得率分别为1.54％，1.75％，2.03％，2.00％，1.90％。随着乙醇浓度的增加，提取率呈先升高后下降的趋势，当乙醇浓度在60％时得率最高。

1.5优化总黄酮提取工艺在单因素试验的基础上，确定提取次数为2次，料液比1:20，选择提取温度(A)、提取时间(B)和乙醇浓度(C)为自变量，总黄酮提取率(Y)为因变量，使用Design-Expert软件进行试验设计，对结果进行多元线性回归和二项式拟合，并进行方差分析，试验设计与结果见表1，方差分析结果见表2。

表1山蒟总黄酮提取工艺星点试验设计与结果

表2二项式方程方差分析

对试验结果进行多元线性回归得二项式拟合方程：Y＝1.82+0.1788A++0.0275B+0.0288C-0.0150AB-0.0250BC-0.175AC-0.1883A2-0.0858B2-0.2732C2(R

根据二项式拟合方程，应用Design-Expert软件进行模型分析，使响应值Y取最大值时，提取工艺条件为乙醇浓度68.68v/v％，提取温度78.35℃，提取时间123.28min，料液比为1g：20mL，提取2次，模型预测Y值为1.83％。称取山蒟粉末约1.0g，共三份，提取率分别为1.80％，1.85％，1.86％，总黄酮平均提取率1.84％，RSD为1.75％，说明该二项式方程能较好预测山蒟总黄酮提取率，重复性好，方法可行。

因此，本申请中涉及的山蒟总黄酮提取物的最优制备方法为：以山蒟为原料、68.68v/v％乙醇为溶媒，按1g：20mL的料液比，升温至78.35℃提取2次，每次提取123.28min，提取液浓缩成浸膏；所得浸膏上HP-20大孔树脂柱，先用水洗柱，然后用70v/v％乙醇洗脱，收集70v/v％乙醇洗脱部位，回收乙醇，干燥，得到山蒟总黄酮提取物。经检测，其中总黄酮含量为65.42％。

申请人通过实验发现，山蒟总黄酮提取物作为唯一活性成分可明显改善四氯化碳致肝损伤小鼠、非酒精性脂肪性肝病小鼠和药物性肝损伤小鼠的肝组织病变，并降低ALT和AST活性。而且，山蒟总黄酮提取物四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量，并提高抗氧化酶T-SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。因此，山蒟总黄酮提取物可以减轻四氯化碳致肝损伤、非酒精性脂肪性肝病和药物性肝损伤模型小鼠的肝损伤或肝病严重程度，并抑制炎症反应和氧化应激，可用于制备保肝/护肝的药物。

附图说明

图1为提取温度、提取时间和乙醇浓度相互作用对总黄酮提取率工艺影响的效应面图，其中(a)为提取温度和提取时间相互作用对总黄酮提取率工艺影响的效应面图，(b)为提取温度和乙醇浓度相互作用对总黄酮提取率工艺影响的效应面图，(c)为提取时间和乙醇浓度相互作用对总黄酮提取率工艺影响的效应面图。

图2为实验例1中各组对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织病变的影响。

图3为实验例1中各组对四氯化碳致肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响；其中，(a)为对ALT的影响，(b)为对AST的影响；各图中，A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：山蒟总黄酮低剂量组；E：山蒟总黄酮高剂量组；

图4为实验例1中各组对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织T-SOD、GSH-Px和MDA的影响；其中，(a)为对T-SOD的影响，(b)为对GSH-Px的影响，(c)为对MDA的影响；各图中，A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：山蒟总黄酮低剂量组；E：山蒟总黄酮高剂量组；

图5为实验例1中各组对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-6和IL-1β的影响；其中，(a)为对TNF-α的影响，(b)为对IL-6的影响，(c)为对IL-1β的影响；各图中，A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：山蒟总黄酮低剂量组；E：山蒟总黄酮高剂量组；

图6为实验例1中各组对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织病变(HE染色)的影响。

图7为实验例1中各组对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织病变(油红O染色)的影响。

图8为实验例1中各组对非酒精性脂肪性肝病小鼠血清ALT和AST的影响；其中，(a)为对ALT的影响，(b)为对AST的影响；各图中，A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：山蒟总黄酮低剂量组；E：山蒟总黄酮高剂量组；

图9为实验例1中各组对药物性肝损伤小鼠肝组织病变的影响。

图10为实验例1中各组对药物性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响；其中，(a)为对ALT的影响，(b)为对AST的影响；各图中，A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：山蒟总黄酮低剂量组；E：山蒟总黄酮高剂量组；

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下各实施例中的山蒟购于桂林市七星区六合路药材市场，经桂林医学院张可锋教授鉴定为山蒟Piper hancei Maxim.的全草。

实施例1

将山蒟粉碎成粗粉(20目)，取1kg置于提取罐中，按1g：20mL的料液比加入68.68v/v％乙醇，加热至78.35℃回流提取2次，每次提取123.28min；合并提取液，过滤，将滤液浓缩至浸膏(无醇味)，得到浸膏；所得浸膏加水成混悬液，用2mol/L盐酸调pH＝4，上HP-20大孔树脂柱(树脂用量为浸膏重量的10倍，上样流速为1mL/min)，静置12h；然后用6倍柱体积的水洗柱，再用8倍柱体积的70v/v％乙醇洗脱(洗脱流速为3mL/min)，收集70v/v％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味后冷冻干燥，得到山蒟总黄酮提取物0.27g。经检测，所得提取物中总黄酮含量为65.42％。

实施例2

将山蒟粉碎成粗粉(40目)，取1kg置于提取罐中，按1g：15mL的料液比加入60v/v％乙醇，加热至50℃回流提取3次，每次提取60min；合并提取液，过滤，将滤液浓缩至浸膏(无醇味)，得到浸膏；所得浸膏加水成混悬液，用2mol/L盐酸调pH＝3.5，上D101大孔树脂柱(树脂用量为浸膏重量的10倍，上样流速为1mL/min)，静置12h；然后用6倍柱体积的水洗柱，再用8倍柱体积的65v/v％乙醇洗脱(洗脱流速为3mL/min)，收集65v/v％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味后冷冻干燥，得到山蒟总黄酮提取物0.28g。经检测，所得提取物中总黄酮含量为60.28％。

实施例3

将山蒟粉碎成粗粉(10目)，取1kg置于提取罐中，按1g：10mL的料液比加入80v/v％正丙醇，加热至90℃回流提取3次，每次提取120min；合并提取液，过滤，将滤液浓缩至浸膏(无醇味)，得到浸膏；所得浸膏加水成混悬液，用2mol/L盐酸调pH＝4.5，上AB-8大孔树脂柱(树脂用量为浸膏重量的10倍，上样流速为1mL/min)，静置12h；然后用6倍柱体积的水洗柱，再用8倍柱体积的75v/v％乙醇洗脱(洗脱流速为3mL/min)，收集75v/v％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味后冷冻干燥，得到山蒟总黄酮提取物0.25g。经检测，所得提取物中总黄酮含量为61.42％。

实施例4

重复实施1，不同的是，用丙酮代替68.68v/v％乙醇；用HPD600大孔树脂柱代替HP-20大孔树脂柱。

最后得到山蒟总黄酮提取物0.27g。经检测，所得提取物中总黄酮含量为61.82％。

实验例1：山蒟总黄酮提取物保肝作用研究

1.1山蒟总黄酮提取物(以下也简称为山蒟总黄酮)

取按本发明实施例1所述方法制备的山蒟总黄酮提取物用于后续药效实验。

1.2材料与仪器

水飞蓟素购于美仑生物技术有限公司。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、总甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物技术有限公司。AUW220D型半微量电子天平购自日本岛津公司。Epoch酶标仪购自美国Bio-tek公司。

1.3山蒟总黄酮保护四氯化碳致肝损伤小鼠的作用

1.3.1动物分组与干预

SPF级雄性昆明种小鼠30只，6周～8周龄，体重18g～22g。小鼠随机分为5组，每组6只，即正常组、模型组、水飞蓟素组(150mg/kg)、山蒟总黄酮低剂量组(100mg/kg)和山蒟总黄酮高剂量组(300mg/kg)。给药剂量依据山蒟成人临床用药剂量、总黄酮含量以及成人与小鼠等效剂量折算系数而得。除正常组和模型组外，其余各组按10ml/kg灌胃体积给予相应药物，连续给药10d。末次给药2h后，除正常组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.12％的四氯化碳花生油溶液(10ml/kg)建立急性肝损伤。禁食不禁水，16h后，摘除小鼠眼球采血，收集肝组织。

1.3.2肝组织HE染色

将在4％多聚甲醛溶液中固定了48h的肝组织放入梯度浓度的乙醇中脱水；再依次放入二甲苯Ⅰ，Ⅱ中透明各5min，待二甲苯沥干后，再依次放入石蜡槽中脱水。包埋结束后切片，切片厚度设置为4μm，随后进行HE染色。将切片放入60℃的烘箱中烘片40min。然后放入二甲苯中脱蜡，再依次放入不同浓度的乙醇中水化，再使用苏木素进行2min的染色。使用自来水缓慢冲洗1min后，再使用伊红染色1min。梯度乙醇中进行脱水，结束后放入二甲苯中透明，最后采用树胶封片，并在显微镜下进行观察。

1.3.3生化指标检测

血于4 000rpm、4℃下离心10min，收集血清放入-20℃冰箱保存。按照试剂盒说明书操作，检测血清中ALT和AST活性，以及肝组织中T-SOD、MDA、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.3.4研究结果

1.3.4.1山蒟总黄酮对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织病变的影响

HE染色结果表明(如图2所示)，正常组小鼠的肝小叶结构完整，以中央静脉为中心，细胞索排列呈辐射状排列，且细胞结构清晰，未见炎性细胞浸润，无细胞坏死、变性等病理变化。模型组小鼠的肝小叶结构紊乱，肝细胞索排列不整齐，且伴有大量炎症细胞浸润，肝细胞坏死严重，表明本实验成功建立四氯化碳肝损伤小鼠模型。与模型组比较，水飞蓟素和山蒟总黄酮干预后小鼠肝组织病变均有得到明显改善，肝小叶结构较为完整，少见炎症细胞浸润以及细胞坏死等，表明山蒟总黄酮能够保护四氯化碳肝损伤小鼠。

1.3.4.2山蒟总黄酮对四氯化碳致肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响

图3结果表明，与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性显著增加(P<0.01)，说明成功建立四氯化碳肝损伤小鼠模型；与模型组比较，山蒟总黄酮低剂量组和山蒟总黄酮高剂量组ALT和AST活性明显下降(P<0.05或P<0.01)，表明山蒟总黄酮能够保护四氯化碳肝损伤小鼠。

1.3.4.3山蒟总黄酮对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织T-SOD、GSH-Px和MDA的影响

图4结果表明，与正常组比较，模型组小鼠肝组织中T-SOD和GSH-Px活性显著降低，且MDA含量明显增加(P<0.01)，说明肝损伤小鼠肝组织发生氧化应激；与模型组比较，山蒟总黄酮低剂量组和山蒟总黄酮高剂量组T-SOD和GSH-Px活性明显降低，且MDA含量显著增加(P<0.05或P<0.01)，表明山蒟总黄酮能够抑制四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织的氧化应激。

1.3.4.4山蒟总黄酮对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-6和IL-1β的影响

图5结果表明，与正常组比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著降低(P<0.01)，说明肝损伤小鼠肝组织发生炎症反应；与模型组比较，山蒟总黄酮低剂量组和山蒟总黄酮高剂量组TNF-α、IL-6和IL-1β含量明显降低(P<0.05或P<0.01)，表明山蒟总黄酮能够抑制四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织的炎症反应。

1.4山蒟总黄酮保护非酒精性脂肪性肝病小鼠的作用

1.4.1动物分组与干预

SPF级雄性昆明种小鼠30只，6周～8周龄，体重18g～22g。小鼠随机分为5组，每组6只，即正常组、模型组、水飞蓟素组(150mg/kg)、山蒟总黄酮低剂量组(100mg/kg)和山蒟总黄酮高剂量组(300mg/kg)。给药剂量依据山蒟成人临床用药剂量、总黄酮含量以及成人与小鼠等效剂量折算系数而得。正常组小鼠喂以普通标准，其余各组喂以高脂饲料；同时正常组和模型组组给予蒸馏水灌胃(10ml/kg)，其余各组按10ml/kg灌胃体积给予相应药物。连续干预8周后，禁食不禁水，16h后摘除小鼠眼球采血，收集肝组织。

1.4.2肝组织HE染色和油红O染色

肝组织HE染色方法与“2.3.2”项一致。肝组织冷冻后，立即使用冷冻切片机进行切片。切片入油红染液浸染8～10min(加盖避光)，蒸馏水洗；再用75v/v％酒精稍分化，蒸馏水洗；然后切片入苏木素染液染3～5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，再流水冲洗。最后，甘油明胶封片剂封片，显微镜下观察。

1.4.3生化指标检测

血于4 000rpm、4℃下离心10min，收集血清放入-20℃冰箱保存。按照试剂盒说明书操作，检测血清中ALT和AST活性。

1.4.4研究结果

1.4.4.1山蒟总黄酮对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织病变的影响

肝组织HE染色(图6)和油红O染色(图7)结果表明，与正常组比较，模型组细胞质出现大小不同的脂肪空泡和红染脂滴，脂质蓄积病变明显，表明本实验成功建立非酒精性脂肪性肝病小鼠模型；与模型组比较，水飞蓟素和山蒟总黄酮干预后小鼠肝组织脂质蓄积明显降低，表明山蒟总黄酮能够保护非酒精性脂肪性肝病小鼠。

1.4.4.2山蒟总黄酮对非酒精性脂肪性肝病小鼠血清ALT和AST的影响

图8结果表明，与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性显著增加(P<0.01)，说明成功建立非酒精性脂肪性肝病小鼠模型；与模型组比较，山蒟总黄酮低剂量组和山蒟总黄酮高剂量组ALT和AST活性明显下降(P<0.05或P<0.01)，表明山蒟总黄酮能够保护非酒精性脂肪性肝病小鼠。

1.5山蒟总黄酮保护药物性肝损伤小鼠的作用

1.5.1动物分组与干预

SPF级雄性昆明种小鼠30只，6周～8周龄，体重18g～22g。小鼠随机分为5组，每组6只，即正常组、模型组、水飞蓟素组(150mg/kg)、山蒟总黄酮低剂量组(100mg/kg)和山蒟总黄酮高剂量组(300mg/kg)。给药剂量依据山蒟成人临床用药剂量、总黄酮含量以及成人与小鼠等效剂量折算系数而得。除正常组外，其余各组以10ml/kg的灌胃体积给予小鼠异烟肼(100mg/kg)和利福平(100mg/kg)进行造模；正常组和模型组组给予蒸馏水灌胃(10ml/kg)，其余各组按10ml/kg灌胃体积给予相应药物进行治疗。连续干预4周后，禁食不禁水，16h后摘除小鼠眼球采血，收集肝组织。

1.5.2肝组织HE染色

将在4％多聚甲醛溶液中固定了48h的肝组织放入梯度浓度的乙醇中脱水；再依次放入二甲苯Ⅰ，Ⅱ中透明各5min，待二甲苯沥干后，再依次放入石蜡槽中脱水。包埋结束后切片，切片厚度设置为4μm，随后进行HE染色。将切片放入60℃的烘箱中烘片40min。然后放入二甲苯中脱蜡，再依次放入不同浓度的乙醇中水化，再使用苏木素进行2min的染色。使用自来水缓慢冲洗1min后，再使用伊红染色1min。梯度乙醇中进行脱水，结束后放入二甲苯中透明，最后采用树胶封片，并在显微镜下进行观察。

1.5.3生化指标检测

血于4 000rpm、4℃下离心10min，收集血清放入-20℃冰箱保存。按照试剂盒说明书操作，检测血清中ALT和AST活性。

1.5.4研究结果

1.5.4.1山蒟总黄酮对药物性肝损伤小鼠肝组织病变的影响

HE染色结果表明(图9)，正常组小鼠的肝小叶结构完整，以中央静脉为中心，细胞索排列呈辐射状排列，且细胞结构清晰，未见炎性细胞浸润，无细胞坏死、变性等病理变化。模型组小鼠的肝小叶结构紊乱，肝细胞索排列不整齐，且伴有肝细胞坏死，表明本实验成功建立药物性肝损伤小鼠模型。与模型组比较，水飞蓟素和山蒟总黄酮干预后小鼠肝组织病变均有得到明显改善，表明山蒟总黄酮能够保护药物性肝损伤小鼠。

1.5.4.2山蒟总黄酮对药物性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响

图10结果表明，与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性显著增加(P<0.01)，说明成功建立药物性肝损伤小鼠模型；与模型组比较，山蒟总黄酮低剂量组和山蒟总黄酮高剂量组ALT和AST活性明显下降(P<0.05或P<0.01)，表明山蒟总黄酮能够保护药物性肝损伤小鼠。