一株兼具组胺降解活性和L-苹果酸转化活性的昆氏乳杆菌及其在桑葚果酒中的应用

摘要

本发明属于发酵领域，公开了一株兼具组胺降解活性和L‑苹果酸转化活性的昆氏乳杆菌及其在桑葚果酒中的应用。该菌种分离于自然发酵的桑葚果酒，命名为

说明书

技术领域

本发明属于发酵领域，具体涉及一株兼具组胺降解活性和L-苹果酸转化活性的昆氏乳杆菌及其在桑葚果酒中的应用。

背景技术

桑葚是桑科桑葚属的落叶乔木植物的果实，广泛生长在亚热带和热带地区，由于其高营养、药用和经济价值，它已被广泛应用于食品、保健、制药和农业行业。桑葚具有极好的药理价值，在中医中用于治疗咽喉痛、预防肝肾损伤、降低血压、改善视力。近年来，由于人们对桑葚良好风味，营养价值和生物活性的认识不断提高，桑葚的消费量显着增加，但其在常温下极难贮藏，易腐烂、变质，采后需及时处理，或经加工以延长其货架期。桑葚果酒是桑葚的主要加工产品之一，富含多糖、花青素和黄酮等生物活性物质，长期饮用可起到促进消化、增强免疫力等作用，具有巨大的市场价值。然而，饮用桑葚果酒易出现“上头”问题，并伴有头痛、心悸等不适症状，制约其规模化推广销售。有研究表明，果酒中生物胺、杂醇油等物质含量偏高是造成其“上头”问题的重要因素。

生物胺是一类低分子量的含氮化合物，广泛存在于发酵食品中。根据生物胺的化学成分，食品中常见的生物胺可分为单胺(β-苯乙胺和酪胺)、二胺(色胺、腐胺、尸胺和组胺)和多胺(精胺和亚精胺)。研究发现，摄入过量的生物胺，则会导致食物中毒并产生不良影响。其中，组胺作为毒性作用最大的生物胺，含量过高会引起常头痛头晕、恶心、舌刺痛、呕吐、腹泻、血压下降、血管舒张、颅内出血、心悸或呼吸困难等症状。欧盟对组胺在食品中的限量规定为100-200mg/kg，美国法规规定组胺在水产品中的最高限量为50mg/kg。此外，一些国家对于葡萄酒中组胺的限量规定更为严格，如国际葡萄和葡萄酒组织(International Organisation of Vine and Wine，OIV)建议组胺不超过12mg/L。这是因为果酒中的乙醇和乙醛可抑制人单胺氧化酶和二胺氧化酶的活性，导致机体代谢生物胺的能力减弱。因此，果酒中组胺的安全限值应远低于非酒精发酵食品。

目前，有多种可用于发酵食品中组胺控制的策略，其中使用无生物胺合成能力且组胺降解能力强的发酵剂已成为控制食品中组胺最具前景的方法。根据现有研究显示，苹果酸乳酸发酵(MLF)是果酒中组胺形成的主要阶段之一，而在MLF阶段接种选定的发酵剂可以降低果酒的组胺水平。同时，在MLF阶段使用适合的发酵剂还可降低果酒的酸涩度，改善果酒品质。目前，已有研究人员筛选出可用于果酒MLF阶段的发酵剂，如酒酒球菌GS-1(CN111205996 A)、克鲁维毕赤酵母LI-27-1(CN 111849792 A)以及可用于控制果酒生物胺的MLF发酵剂植物乳杆菌L9(CN 104388329 A)。同时也有一些植物乳杆菌通过发酵降低食品中组胺的报道(CN108587983B)。但乳酸菌对组胺的降解，并非乳酸菌的常规性质，如徐佳敏分离出的19株菌中仅有6株具有生物胺降解能力(DOI:10.27257/d.cnki.gnxhc.2022.000261.)。同时，即便具备降解能力，不同的乳酸菌对组胺的降解能力也有差异，如CN115612642B中分离的20株乳酸菌均具有不同程度的生物胺降解能力。另外，浩楠在研究中发现小片球菌OMEGA虽然降低了葡萄酒中L-苹果酸含量，但各生物胺含量均高于未MLF的葡萄酒(DOI:10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000194.)。

由于桑葚果酒中的成分复杂，组胺含量高，因此，亟需一株即能降解组胺、L-苹果酸含量，同时不影响桑葚果酒品质的发酵菌株。

针对上述问题，申请人提供了一株昆氏乳杆菌，该菌株具备良好的组胺降解和L-苹果酸的转化能力，同时通过检测桑葚果酒中的总酚、总黄酮、花色苷等活性物质以及甲醇和杂醇油等有害物质，发现其并不影响果酒风味，解决了桑葚果酒“上头”问题。

发明内容

本发明针对现有存在的不足，提供一株兼具组胺降解活性和L-苹果酸转化活性的昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)W96，该菌株的保藏编号为：GDMCC No.63353。

本发明的另一个目的在于提供了昆氏乳杆菌W96在制备果酒中的应用，本发明的昆氏乳杆菌能能高效降解果酒中组胺含量，同时转化果酒中L-苹果酸含量，提高果酒安全性，改善果酒品质。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人自桑葚果酒中，通过对组胺降解能力，L-苹果酸转化能力，不具备生物胺合成能力的筛选，最终获得了一株乳酸菌，该菌株于2023年5月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类命名：Lactobacilluskunkeei W96，保藏编号为：GDMCC No：63353。

W96菌落形态为乳白色，光滑凸起，边缘整齐，取-80℃冰箱保藏的昆氏乳杆菌W96于MRS固体培养基中划线，然后于37℃培养48h，挑取各乳酸菌的单菌落分别接种于MRS液体培养基，于37℃培养12h，再按0.5％(v/v)的接种量加到MRS液体培养基于37℃培养进行二次活化，经每2个小时测定一次OD

本发明的保护范围包括：

上述菌株在发酵降解组胺中的应用；和/或在转化L-苹果酸中的应用；

上述菌株在制备果酒中的应用；

以上所述的应用中，优选的，所述的果酒为桑葚果酒。

以上所述的应用，当制备果酒时，是在果酒的苹果酸乳酸发酵接种本发明的菌株进行发酵，当L-苹果酸含量无显著变化时，即可停止发酵，即得目的果酒产物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的昆氏乳杆菌W96能高效降解果酒中组胺，转化L-苹果酸，对实际桑葚果酒环境适应良好，且桑葚果酒中白藜芦醇、主要单体花色苷、总酚、总黄酮含量均有提高，抗氧化能力增强，甲醇和总高级醇含量也有所降低。本发明为我国桑葚果酒高安全性和健康性的生产提供了技术支持，具备良好的商业应用前景。

附图说明

图1筛选得到的部分菌落形态。

图2W96菌落形态。

图3昆氏乳杆菌W96的16S rDNA基因扩增电泳图。

图4菌株W96基于16S rDNA序列构建的系统发育树。

图5不同桑葚果酒MLF过程中L-苹果酸的变化趋势。

图6不同桑葚果酒中组胺含量对比。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。所举实例只用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明是以桑葚果酒为例进行说明，其余发酵产物中具有组胺或者L-苹果酸，需要通过发酵进行降低的，利用本发明的昆氏乳杆菌发酵降解也能产生相应的效果。

本发明实施例所述的MRS液体培养基组成为：20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏粉，4g/L酵母粉，2g/L柠檬酸三铵，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.2g/L MgSO

本发明实施例中所述的组胺降解能力按下是计算：

本发明实施例中所述的乳酸菌生物胺合成能力按实验组与对照组生物胺含量差值计算。

本发明实施例中所述的合成生物胺的液体培养基成分为：20g/L葡萄糖，2g/L柠檬酸三铵，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.2g/LMgSO

本发明实施例中所述的乳酸菌L-苹果酸转化能力按下式计算:

本发明实施例中所述的降L-苹果酸培养基成分为：5g/L酒石酸，2g/L LD-苹果酸，2g/L酵母提取物，2g/L葡萄糖，2g/L果糖，0.2g/L NaCl，1g/L(NH

实施例1：

乳酸菌的分离及筛选

(1)分离纯化：取10mL自然发酵的桑葚果酒于250mL锥形瓶中，加入90mL无菌生理盐水后放入摇床上37℃150r/min培养30min。取悬浮液梯度稀释至10

(2)组胺降解能力的筛选：根据分离纯化的各菌OD

(3)不具备生物胺合成能力的筛选：由(2)的降解结果，将组胺降解率在50％以上的各菌根据OD

(4)L-苹果酸转化能力的筛选：将(3)筛选得到的各菌根据OD

通过乳酸菌的分离，根据《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸菌分类鉴定及实验方法》，获得的部分菌落如图1所示，乳酸菌菌落形态为微白色，呈圆形，边缘整齐，平滑，中间隆起且有透明圈。

通过筛选，发现接菌前的PBS缓冲溶液中组胺含量为102.64mg/L，接入菌株W96的48h时，组胺剩余含量为47.26mg/L，其组胺降解能力高达53.95％，且不合成生物胺，同时该菌还具有高效的L-苹果酸转化能力，其降解率为46.09％。

以27F和1492R为上下游引物，对菌株W96进行PCR扩增，扩增产物送至广州擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在NCBI数据库的BLAST中进行同源性搜索比对。引物序列为：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′。

如图2所示，W96菌落形态为乳白色，光滑凸起，边缘整齐。如图3所示，泳道1在1500bp处有清晰且明显的条带，表示PCR扩增成功。根据测序结果的序列比对，菌株W96与昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)JCM 16173具有99.59％的序列相似性。同时，经序列多重比对和系统发育树的构建(图4)，发现菌株菌株W96与L.kunkeei的亲缘关系最近。因此，综合将其鉴定为昆氏乳杆菌，命名为昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)W96。该菌株于2023年5月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类命名：Lactobacillus kunkeei W96，保藏编号为：GDMCC No：63353。

实施例2：

昆氏乳杆菌W96的发酵：

取-80℃冰箱保藏的昆氏乳杆菌W96于MRS固体培养基中划线，然后于37℃培养48h，挑取各乳酸菌的单菌落分别接种于MRS液体培养基，于37℃培养12h，再按0.5％(v/v)的接种量加到MRS液体培养基于37℃培养进行二次活化，经每2个小时测定一次OD

实施例3：

昆氏乳杆菌W96在桑葚果酒中的应用

对照组1：将桑葚去除杂质后破壁，再将0.05％(v/v)的果胶酶加入到破壁的桑葚中，并在40℃下水浴2h，然后将桑葚通过滤布(200目)过滤，得到桑葚果汁。用蔗糖和柠檬酸来调整桑葚果汁的可溶性固体含量、pH值，使桑葚果汁的可溶性固体含量和pH值分别为22°Brix和4。然后加入80mg/L焦亚硫酸钠和0.25g/L的活性干酵母(Saccharomycescerevisiae)RV002，在25℃下进行酒精发酵。

当发酵的桑葚果酒酒精度含量达到11％vol时，在5100r/min下离心10min，终止酒精发酵，获得的上清即为桑椹果酒。

对照组2：对照组1中获得的桑椹果酒，以10

实验组：对照组1中获得的桑椹果酒，以10

发酵结束后，对上述3种方法制备的桑葚果酒的L-苹果酸、组胺、pH值、可滴定酸、还原糖、酒精度、白藜芦醇、主要单体花色苷、总酚、总黄酮、甲醇和高级醇含量以及抗氧化能力进行检测。检测方法如下：

(1)检测方法

L-苹果酸：采用GB 5009.157-2016《食品中有机酸的测定》；

组胺：采用GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》；

pH值和可滴定酸：采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；

还原糖：采用GB/T 5009.7-2008《食品中还原糖的测定》的3，5-二硝基水杨酸法；

乙醇：采用GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》；

白藜芦醇测定方法：精确称取5mg白藜芦醇标准品，用60％乙醇溶液溶解并定容至50mL，再将该标准液为母液稀释成不同浓度，取不同浓度的标准液0.5mL，加入60％乙醇定容至10mL，测定OD305，横坐标为浓度，纵坐标为吸光度绘制标曲。60％乙醇为空白组。样品的测定：准确吸取桑葚果酒0.2mL，加入无水乙醇稀释一定倍数，60℃水浴1h后7000r/min离心10min，取0.2mL上清液用60％定容至10mL，于305nm处测定吸光值；

单体花色苷：(1)桑葚花色苷提取：80％酸性乙醇(0.1％乙酸)，料液比1:3，400W超声10min。(2)高效液相色谱测定条件：色谱柱：

表1HPLC测定单体花色苷梯度洗脱程序

总酚测定方法：采用福林酚法测定，以焦性没食子酸为标准物质绘制标曲。用蒸馏水将样品稀释一定倍数，取1mL稀释液于10mL刻度试管中，加入1mL福林酚显色剂，再加入3mL质量分数为7.5％的NaCO3溶液，用蒸馏水定容至10mL，摇匀后室温避光反应1h，于波长760nm处测定吸光值，以不加福林酚的酒样作为空白对照，代入标曲；

DPPH自由基清除能力的测定方法：以焦性没食子酸为标准物质绘制标曲。将酒样稀释一定倍数后，吸取2mL样品稀释液，加入0.2mol/L DPPH溶液2mL，摇匀后避光放置40min，以无水乙醇为空白，于517nm处测定吸光值，再在相同条件下测定2mL DPPH和2mL无水乙醇混合液的吸光度，根据焦性没食子酸标准曲线回归方程计算；

ABTS自由基清除能力的测定方法：将7mmol/L ABTS溶液与2.45mmol/L过硫酸钾溶液混合(各取100mL)，置于暗处反应12h，产生ABTS+储备液，用无水乙醇将ABTS+溶液稀释，使其吸光度在734nm波长下吸光度为0.70±0.02，以V

甲醇及高级醇测定方法：(1)标准品：准确称取甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、叔戊醇标品500mg，用40％乙醇溶液定容到10mL，该溶液用于定性分析。(2)混合标准溶液的配制：将上述甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇溶液混合，加入40％乙醇，使各标准品的最终浓度为50，125，250，500，1000mg/L，然后取各不同浓度的混合标准溶液10mL，加入0.1mL叔戊醇溶液(内标)。(3)样品的准备：取样品1mL，加入内标叔戊醇溶液0.01mL，采用0.22μm滤膜过滤后进行气相色谱分析；

气相色谱条件如下：色谱柱：DB-FFAP聚乙二醇强极性柱(30m×0.25mm，0.25μm)；程序升温模式：起始温度40℃，保持5min，以3℃/min升温至50℃，保持3min，以8℃/min升温至120℃，保持1min，再以20℃/min升温至240℃，保持3min；检测器温度为250℃；进样口温度为250℃；载气(N

结果如下：

如图5所示，随着MLF的进行，实验组和对照组2的L-苹果酸浓度均呈下降趋势。对照组1中桑葚果酒L-苹果酸含量为1.34g/L。MLF第35d时，对照组2和实验组的L-苹果酸浓度分别为0.61和0.64g/L，无显著性差异，表明筛选获取的昆氏乳杆菌与可于苹果酸乳酸发酵阶的植物乳杆菌CS-1的苹果酸转化能力相当，转化率高达52％左右。

由图6可知，在MLF的35d时，不同的发酵桑葚果酒中观察到组胺含量有明显的差异；对照组1表现出最高的组胺水平(24.45mg/L)，而经过MLF后，对照组2和实验组的桑葚果酒均有不同程度的降低。其中，对照组2的组胺含量降低了17.34％，实验组的组胺降解效果更好，降低了47.93％。

不同桑葚果酒的基本理化指标如表2所示，对照组1中桑葚果酒的pH、还原糖含量、可滴定酸和酒精度浓度分别为3.74、2.89g/L、12.51g/L和11.17％。MLF后，实验组和对照组2，桑葚果酒的酒精度与对照组1相比无显著性变化，还原糖含量和可滴定酸降低，而pH值随着可滴定酸的降低而升高。

表2不同桑葚果酒理化指标的对比

注：同一指标不同小写字母表示具有显著性差异(p＜0.05)。

不同桑葚果酒的品质如表3所示，MLF后桑葚果酒的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷均有所下降，与对照组2相比，昆氏乳杆菌W96下降较少，更大程度地保留了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(177.08mg/L)和矢车菊素-3-O-芸香糖苷(316.76mg/L)。除这两个主要单体花色苷外，白藜芦醇、总酚、总黄酮、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力在MLF后均为上升的趋势，与对照组2相比，经昆氏乳杆菌W96 MLF后，桑葚果酒的白藜芦醇，总酚，总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均明显提高(p<0.05)。同时，有害物质中甲醇和异丁醇的含量显著降低(p<0.05)，正丁醇和异戊醇在昆氏乳杆菌W96和对照之间无显著差异。总而言之，使用昆氏乳杆菌W96发酵后的桑葚果酒组胺和L-苹果酸含量显著降低；与对照组2比，昆氏乳杆菌W96发酵的桑葚果酒品质更好，适用于桑葚果酒的发酵。

表3不同桑葚果酒的品质对比

注：同一指标不同小写字母表示具有显著性差异(p＜0.05)。

以上实施例仅为了解释本发明，但不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。