一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法

摘要

本发明公开了一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法，具体为一种提高DNA修复效率的蛋白、表达质粒、基因编辑质粒在修复基因编辑相关损伤的应用，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的结果显示RAD52过表达载体能够显著增加宿主细胞内的RAD52基因在mRNA和蛋白质水平的表达量，本发明提供的蛋白和载体能够修复基因编辑所致损伤，相比于现有的通过抑制Cas9蛋白活性而降低基因编辑的方法，能够修复已经造成DNA损伤；本发明为修复基因编辑相关损伤的提供了一种新方法。

说明书

技术领域

本发明属于基因编辑与基因治疗技术领域，具体涉及一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤。

背景技术

成簇规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)系统原本是细菌中的一种适应性免疫系统，已经被开发成为了一种高效、方便的基因编辑工具，目前广泛应用于模型构建、基因治疗等领域。随着该技术的应用，其潜在的安全性风险也逐渐显现。已有研究表明，基因编辑技术在应用中存在脱靶、致癌、基因损伤等潜在的不良后果。因此，通过精准调控基因编辑技术以减少其应用中的潜在风险成为了近年来的研究热点。前期研究人员已经开发出了多种调控CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法，包括使用抗CRISPR蛋白、小分子化合物、光控元件融合表达的Cas9蛋白等。然而，这些方法通常是利用外源物质通过抑制或调控Cas9蛋白酶进而发挥抑制基因编辑效率的作用，利用宿主细胞自身内源基因进行调节的研究较少，考虑到宿主细胞基因组自身具有一套强大的基因损伤修复系统，因此建立一种通过增强宿主细胞内源基因修复能力降低CRISPR/Cas9基因编辑带来潜在基因损伤的方法，对于提高CRISPR/Cas9今后应用的安全性十分必要。

众所周知，CRISPR/Cas9基因编辑引发的DNA双链断裂(Double Strand Break，DSB)通常是通过宿主的DNA损伤修复系统进行修复，主要包括以下类型：非同源末端连接是通过连接酶直接将断裂末端进行连接，若断裂位点两端存在微同源序列也可通过微同源介导的末端连接途径进行修复，上述末端连接修复方式均是易错的，经常伴随着小插入或缺失(indels)。精准的同源重组修复途径利用位于姐妹染色单体上的同源序列或同源染色体作为模板进行修复，此外若断裂位点的两端存在长同源序列，还可以通过单链退火途径进行修复。近年来发现了一类新的同源重组修复机制-转录相关的同源重组修复，其可以通过转录本RNA介导或直接以转录本RNA作为模板进行修复。在同源重组修复中，辐射敏感52(Radiation Sensitive 52，RAD52)蛋白发挥重要作用，其帮助辐射敏感51(RadiationSensitive 51，RAD51)蛋白加载到单链DNA上进行后续同源模板寻找，同时也被首先募集到损伤部位招募下游的修复因子进而启动修复。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明提供了一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法，具体为一种提高DNA修复效率的蛋白、表达质粒、基因编辑质粒在修复基因编辑相关损伤的应用。

依据本发明的技术方案，一种DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，进一步为提高DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，其为a)增强DNA修复；或b)提高DNA修复效率的产品；或c)制备增加或提高基因编辑安全性的产品。

优选的，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选的，所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述DNA修复为同源重组方式的DNA修复。

优选的，所述DNA修复为修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤。

优选的，所述提高DNA修复效率的产品包括提高DNA修复效率的质粒。

本发明还提供了一种修复基因编辑相关损伤的方法，所述方法包含过表达DNA修复蛋白RAD52的步骤。

与现有技术相比较，本发明所提供蛋白和质粒及其应用具有以下有益效果：

(1)RAD52过表达载体能够显著增加宿主细胞内的RAD52基因在mRNA和蛋白质水平的表达量。

(2)本发明提供的蛋白和载体能够修复基因编辑所致损伤，相比于现有的通过抑制Cas9蛋白活性而降低基因编辑的方法，能够修复已经造成DNA损伤。

附图说明

图1为pX459-Alu的表达图谱。

图2为pCMV-RAD52的表达图谱。

图3为RAD52过表达系统验证结果。

图4为RAD52过表达后HEK293细胞基因编辑损伤模型中细胞活性的检测结果。

图5为RAD52过表达后HEK293细胞基因编辑损伤模型中细胞汇合度检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明提供了一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法，具体为一种提高DNA修复效率的蛋白、表达质粒、基因编辑质粒在修复基因编辑相关损伤的应用。

依据本发明的技术方案，一种DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，进一步为提高DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，其为a)增强DNA修复；或b)提高DNA修复效率的产品；或c)制备增加或提高基因编辑安全性的产品。

优选的，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选的，所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述DNA修复为同源重组方式的DNA修复。

优选的，所述DNA修复为修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤。

优选的，所述提高DNA修复效率的产品包括提高DNA修复效率的质粒。

下面结合实施例说明本发明DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用。

实施例1构建靶向Alu重复序列的基因编辑载体

CRISPR/Cas9系统的构建

引物合成

根据文献报道选择靶向Alu重复序列的sgRNA，序列如下表：

表1 Alu sgRNAs序列表

根据sgRNA序列，两端添加BbsI酶切后的粘性末端，合成两条引物，引物序列如下表：

表2 Alu sgRNAs的引物序列表

磷酸化和退火

将上述引物对进行磷酸化后退火，形成sgRNA插入片段，反应体系和反应条件如下：

表3磷酸化及退火反应体系表

表4磷酸化及退火反应条件表

目标片段与载体的连接

取10μL磷酸化退火后的sgRNA插入片段，加入1mL DNA/RNAse free H2O，即稀释了100倍。以pX459为载体，利用一步酶切连接构建质粒。

表5酶切连接反应体系表

表6酶切连接反应条件表

连接产物转化至感受态细胞中

①将DH5α感受态细胞置于冰上解冻；

②取5μL连接产物转移至50μL感受态细胞中，冰上放置30分钟；

③42℃金属浴或水浴热激30-60秒，置于冰上放置2-3分钟，加入900μL无抗生素的LB液体培养基；

④37℃150r/min复苏1-2小时；

⑤取200μL菌液涂布于100μg/μL amp的LB固体培养基，37℃倒置过夜培养。

菌落PCR筛选阳性克隆

第二天挑取单菌落溶于10μL无菌水中进行PCR，引物为hU6F(上游通用引物：5’-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3’)与相应的sgRNA-R(下游特异性引物)。每种质粒除菌落克隆外再加入1个pX459对照以及无模板阴性对照。

表7 PCR体系表

表8 PCR反应条件表

将PCR后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆，阳性条带大小为200bp左右。将PCR阳性的菌落的剩余菌液接种于5mL的100μg/μL amp的LB液体培养基。37℃，150r/min过夜培养。

实施例2质粒快速小提和测序

使用天根快速质粒小提试剂盒(天根，DP105)按照说明书进行质粒提取，具体过程如下：

①取5mL过夜培养的菌液转移至离心管中，12000r/min室温离心1分钟，尽量吸除上清后收集沉淀。

②向菌体沉淀的离心管中加入150μL P1溶液，使用移液器吸头反复吹打使细菌沉淀彻底悬浮并混匀体系，混匀后体系溶液应该为浑浊的红色。

③向离心管中加入150μL P2溶液，然后通过温和地上下翻转离心管使菌体充分的裂解，此时混匀后的体系溶液逐渐从红色变为澄清的紫色，不变色说明裂解不充分，应继续混匀。

④向离心管中加入350μL P5溶液，然后立即快速地上下颠倒翻转离心管进行充分混匀，此时体系溶液将变成黄色并出现絮状沉淀。在12000r/min室温离心5分钟，将絮状物沉淀到底部，收集上清。

⑤将收集的上清液转移到吸附柱CP3中，然后12000r/min室温离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

⑥向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT，12000r/min室温离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

⑦重复上一步，完成后将吸附柱在室温放置5分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。

⑧将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL DNA/RNase free H2O，然后12000r/min室温离心2分钟，质粒溶液收集到离心管中。

⑨将质粒送公司测序，测序引物为生工生物公司的通用引物U6-renyuan(5’-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3’)。

实施例3去内毒素质粒大提

使用无内毒素质粒大提试剂盒(天根，DP117)按照说明书进行去内毒素质粒提取，用于细胞转染。具体过程如下：

①取100mL-250mL过夜培养的菌液加入离心管，8000r/min室温离心3min收集细菌，弃去上清。

②向菌体沉淀中加入8mL已加入RNase A的溶液P1，使用移液器彻底悬浮沉淀，并使用涡旋振荡器混匀。

③向离心管中加入8mL溶液P2，立即温和地上下翻转并在室温下放置5min使菌体充分裂解。

④向离心管中加入8mL溶液P4，立即温和地上下翻转充分混匀，此时溶液会出现白色絮状沉淀，室温下放置10min后，8000r/min离心10min使白色沉淀离心至管底，将全部溶液倒入过滤器CS1中，将滤液收集在干净的50mL的离心管中。

⑤柱平衡步骤：向吸附柱CP6中加入2.5mL的平衡液BL，8000r/min离心2min，弃去废液。向上述滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。

⑥将吸附柱CP6在室温8000r/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。

⑦向吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，8000r/min离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，重复操作一次。

⑧向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8000r/min离心2min，倒掉废液。

⑨将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000r/min离心5min，去除吸附柱中残余的漂洗液。

⑩将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加700μL DNA/RNase free H2O，室温放置5min，然后室温8000r/min离心2min。将洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃冰箱保存。

实施例4验证RAD52表达载体

将pCMV-ORF和pCMV-RAD52两种载体转染入HEK293细胞中，在转染后的48小时提取细胞的RNA和蛋白质，分别通过荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹检测RAD52的mRNA和蛋白质水平的表达。将转染pCMV-ORF定义为CTL组，将转染pCMV-RAD52定义为RAD52组。检测结果参见图3。

荧光定量PCR验证

①质粒活化：将本实验室保存的pCMV-ORF和pCMV-RAD52两种载体转化至DH5α感受态细胞中，扩大培养后进行去内毒素质粒提取。

②细胞转染：将HEK293细胞铺至24孔板中，第二天待细胞密度达到60％-70％时进行转染。转染共分为两组，分别为pCMV-ORF和pCMV-RAD52，我们将两组分别命名为CTL和RAD52。转染量为每孔0.5μg，质粒与转染试剂比例1:2，转染后48小时进行细胞内RNA的提取。

③RNA提取：使用RNA提取试剂盒(天根，DP430)按照说明书进行细胞RNA提取。具体过程如下：

a.通过离心收集细胞沉淀，加入350μL裂解液RL，

b.将上述溶液加入过滤柱CS中，12000r/min离心2分钟，将滤液转移至新的离心管中。

c.向离心管中加入350μL 70％乙醇，混匀后一起加入吸附柱CR3中，在12000r/min离心30秒，弃去滤液。

d.向吸附柱中加入350μL RW1去除蛋白，在12000r/min离心30s，弃去滤液。

e.配制DNase I工作液：将10μL DNase I储存液与70μL RDD缓冲液充分混匀。

f.向吸附柱中央膜上滴加80μL的DNase I工作液，并在室温下放置15分钟充分去除基因组DNA。

g.向吸附柱中加入350μL RW1，在12000r/min离心30秒，弃去滤液。

h.向吸附柱中加入500μL漂洗液RW，室温静置2分钟后在12000r/min离心30秒，弃去滤液，再重复1次上述操作。

i.10000r/min离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱打开盖置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱膜上的漂洗液。

j.将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管中，并悬空滴加30μLRNase-FreeddH

④荧光定量PCR检测RAD52表达量,具体流程如下：

荧光定量PCR所需的RAD52引物和β-actin引物序列如下：

表9荧光定量PCR引物序列表

按照下列体系在冰上准备荧光定量PCR反应体系：

表10荧光定量PCR体系表

荧光定量PCR反应条件如下：42℃5min,95℃10s,1Cycle；95℃5s,60℃20s,40Cycles。

反应完成后，根据每一组的Ct值，使用2

蛋白质免疫印迹检测RAD52表达量

细胞转染：将HEK293细胞铺至12孔板中，第二天待细胞密度达到60％-70％时进行转染。转染共分为两组，分别为pCMV-ORF和pCMV-RAD52，转染量为每孔1μg，质粒与转染试剂比例1:2，转染后48小时进行细胞内蛋白质的提取。

蛋白质提取：48小时后，取出细胞培养板，弃去细胞培养上清液，使用PBS润洗1次；每孔加入100μL RIPA裂解液和1μL 1％蛋白酶和磷酸酶混合物抑制剂(提前配置并混匀)，将细胞样品转移至1.5mL离心管中，置于冰上30分钟彻底裂解；4℃14000r/min离心10分钟；将上清转移至新离心管中，加入6×上样缓冲液，充分混匀后分装；98℃变性10分钟，保存于-80℃冰箱中。

安装电泳装置：撕去预制胶底部胶条，将胶板低板对内安装至电泳槽。向电泳槽内加满电泳缓冲液，缓慢拔掉梳子。

加样：将样本在室温下融化并完全混匀。吸取20μL样品加入上样孔，吸取5μL蛋白质leader加入上样孔。打开恒压电泳仪开关，80V电泳25分钟，120V电泳50分钟。

转膜：提前准备与凝胶大小相同的2张滤纸和1张PVDF膜，将PVDF膜泡入甲醇中激活10分钟，电泳结束后同时将凝胶和滤纸泡入转膜缓冲液10分钟。打开转膜仪，用加样枪在底板上加转膜缓冲液润湿，依次放上滤纸-PVDF-凝胶-滤纸，精确对齐，并用玻璃板轻轻滚动，赶出气泡。盖上盖子，调节(恒流)电流至200mA转膜50分钟。

封闭：转膜完成后，将PVDF膜置于牛奶封闭液中，室温旋转封闭1小时。封闭完成后将PVDF膜转移至1×TBST洗涤缓冲液，置于翘板摇床上快速洗涤3次，每次10分钟。

孵育一抗：本次实验选用两种一抗，分别为RAD52(稀释比例1:1000)和GAPDH(稀释比例1:5000)。γH2AX蛋白预测大小约为15kDa，GAPDH蛋白预测大小约为40kDa。根据待测蛋白的大小裁剪PVDF膜，置于10mL稀释后的一抗中孵育，37℃旋转孵育1小时。孵育完成后用1×TBST洗涤缓冲液快速洗涤3次，每次10分钟。

孵育二抗：使用牛奶封闭液配置二抗，抗鼠二抗的稀释比例1:8000，抗兔的稀释比例为1:2000。室温下孵育1小时。孵育完成后用1×TBST洗涤缓冲液快速洗涤3次，每次10分钟。

显色：将PVDF膜从TBST洗涤缓冲液中取出，正面朝上放置在平皿上，将底物显色液A和底物显色液B以1：1比例混匀后，迅速用加样枪将混合液从上到下冲洗PVDF膜，5分钟后开始曝光。

使用ImageJ软件分析条带密度，通过分别计算实验组和对照组中的γH2AX/GAPDH条带密度，定量γH2AX的相对表达量。

实施例5RAD52过表达后损伤模型中细胞活性的检测

检测细胞活性

将细胞铺至96孔板中，细胞密度为每孔1×10

检测细胞汇合度

将细胞铺至24孔板中，细胞密度为每孔1×10

结果表明，本发明提供的蛋白和载体能够修复基因编辑所致损伤，相比于现有的通过抑制Cas9蛋白活性而降低基因编辑的方法，能够修复已经造成DNA损伤。在CRISPR/Cas9靶向Alu重复序列后过表达RAD52，HEK293细胞活性增加了37.28％±8.96％，细胞汇合度增加了77.73％±44.70％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。