心速宁制剂在制备治疗心律失常合并脂代谢异常药物中的应用

摘要

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及心速宁制剂在制备治疗心律失常合并脂代谢异常药物中的应用。心速宁制剂能推迟心律失常出现的时间，缩短心律失常持续时间。同时还能降低血清中的TG、TC水平，升高HDL‑C水平，具有抗心律失常、减轻脂肪变性、抑制肝脏脂肪沉积、肝保护的作用。心速宁制剂通过调节体内代谢物紊乱水平来改善心律失常合并脂代谢异常。

说明书

技术领域

本发明属于中药技术领域，尤其涉及心速宁制剂在制备治疗心律失常合并脂代谢异常药物中的应用。

背景技术

异常的脂代谢又称脂代谢紊乱，主要包括高水平低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及低水平高密度脂蛋白(HDL-C)。脂代谢异常患者不仅肝脏相关疾病发病率和死亡率增加，而且发生致命性和非致命性心血管事件的风险也增加。有研究表明，在有糖尿病和无糖尿病的普通人群中，即使调整了几个心脏代谢危险因素和其他重要因素后，脂代谢异常的严重程度仍然与QTc间期延长的风险较高相关。尽管确切机制尚不清楚，但有证据表明，脂代谢异常是一种多系统疾病，可能会导致多种全身不良反应，包括胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱、炎症、氧化应激和心外膜脂肪组织扩张。这些改变可能会协同作用，促进心脏的结构、电活动和自主神经重构，从而增加心律失常的易感性。这也解释了在脂代谢异常患者中观察到的心血管疾病死亡风险增加的原因。所以研究一种既能治疗心律失常，又对脂代谢异常起作用的药物具有临床意义。

目前尚无药物获批用于治疗心律失常合并脂代谢异常，两种疾病分而治之。西医治疗心律失常的方法包括抗心律失常药物、电学治疗如射频消融、电复律、电除颤、心脏起搏器植入和外科手术等。现有的抗心律失常药物主要针对心脏单一离子通道，如钠通道阻滞剂普罗帕酮和钾通道阻滞剂索他洛尔等，但这些药物在抑制心律失常的同时又可能产生新的触发活动、新的折返和新的心律失常。对脂代谢异常治疗方面，西医以护肝降酶、调脂为主，如他汀类、贝特类降脂药，但调血脂药在降低血脂的同时，亦可将脂质运送至肝脏，加重肝脏脂质代谢，可能会进一步加重肝脏脂肪变性。临床实践证实，中医药通过多成分、多靶点、多通路和全身调节的作用特点，在分别预防或治疗心律失常、脂代谢异常方面已取得显著疗效。

随着城市化建设的发展，人们的饮食结构及生活方式发生了较大的改变，动物蛋白及高脂肪饮食占比增加，日常体力活动量明显减少，痰瘀互结型脂代谢患者在临床病中占比逐渐增高。同时，快速性心律失常也多由热壅痰结、气滞血瘀等病机引起，故心律失常合并脂代谢异常的治疗应以清热化痰解毒为法。心速宁胶囊(国药准字Z20050131，陕西摩美得气血和制药有限公司)是针对痰热扰心证而立的中药制剂，主要用于清热化痰，宁心定悸，是国内首个治疗心悸实证的中成药。作为独家品种，心速宁制剂的二次开发既要基于中医经典理论又要结合现代患者疾病特点，通过辨证论治抓准核心病机、把握主要证候，开展“异病同治”已成为中医药“辨证论治”的实际应用和诊疗特色。

心速宁制剂自上市以来对快速性心律失常实证安全有效，优势突出。但心速宁制剂对于脂代谢异常的治疗属于空白。是否既可抗心律失常，又可有效干预脂代谢异常的病程有待进一步研究。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明设计完成了心速宁制剂在制备治疗心律失常合并脂代谢异常药物中的应用。不仅为心律失常合并脂代谢异常的治疗奠定了科学研究和应用基础，同时为现代疾病的多学科诊治提供新的思路。

根据本发明实施例，本发明还提出了心速宁制剂通过改善体内代谢物紊乱水平在制备治疗心律失常合并脂代谢异常药物中的应用。心速宁制剂能显著下调心律失常合并脂代谢异常大鼠体内10个差异代谢物，上调6个差异代谢物，将16个差异代谢物调回正常水平。为心速宁制剂治疗心律失常合并脂代谢异常提供了可靠依据。

根据本发明实施例，心速宁制剂通过降低氧化脂肪酸的水平来改善体内代谢物紊乱水平。所述氧化脂肪酸包括：FA 18:1+1O、FA 18:1+2O和FA 18:1+3O。

根据本发明实施例，心速宁制剂通过对肠道紊乱菌属相对丰度进行调节，上调有益菌属丰度来改善体内代谢物紊乱水平，缓解肝脏中甘油三酯的蓄积，从而保护肝脏并延缓脂代谢异常的进展。

根据本发明实施例，心速宁制剂能推迟心律失常出现的时间与缩短心律失常持续时间。具有抗心律失常的作用。

根据本发明实施例，心速宁制剂能降低血清中TG和TC表达水平，升高血清中HDL-C表达水平。血脂是评价脂质变化的重要指标，心速宁制剂降低血清中TG(甘油三酯)、TC(总胆固醇)的表达以及升高HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)的表达，具有减轻脂肪变性、抑制肝脏脂肪沉积的作用。

根据本发明的实施例，心速宁制剂由以下各原料质量份配比制得：黄连、清半夏、茯苓、枳实、常山、莲子心、苦参、青蒿、人参、麦冬、甘草的质量比为1：0.745：0.745：0.496：0.745：0.135：0.745：0.745：0.496：0.745：0.496。心速宁制剂处方以清热化痰、泻火宁心定悸为主要治法。方中黄连、清半夏、茯苓、枳实可清心热，宁心定悸；常山、苦参、莲子心、青蒿清热化痰；人参、麦冬益气养阴；甘草甘平，调和诸药。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为心电图代表性图像(A.C组心电图B.M组心电图C.XSN-M组恢复阶段心电图D.Y组恢复阶段心电图)；

图2为各组大鼠体重变化结果；

图3为各组大鼠血脂水平统计图；

图4为Beta多样性分析结果图；

图5为大鼠肠道菌群门水平物种组成分析柱状图；

图6为大鼠肠道菌群属水平物种结构分析柱状图；

图7为C组与M组大鼠肠道菌群LEfse分析结果；

图8为XSN-M组与M组大鼠肠道菌群LEfse分析结果；

图9为QC样本PCA得分散点图(A:负离子模式B:正离子模式)；

图10为血清样本代谢总离子流图；

图11为各组血清OPLS-DA得分图(A:负离子模式；B:正离子模式)；

图12为血清代谢各组差异变量火山图分析；

图13为M组与C组差异代谢物热图分析结果；

图14为M组与C组差异代谢物相关性分析图；

图15为M组与C组差异代谢物ROC曲线分析结果图；

图16为M组与C组差异代谢物代谢通路分析气泡图；

图17为M组、C组与XSN-M组筛选的差异代谢物韦恩图分析；

图18为M组、C组与XSN-M组药效差异代谢物相关性分析；

图19为M组与C组韦恩分析所得的差异代谢物的ROC曲线分析；

图20为M组与XSN-M组韦恩分析所得的差异代谢物的ROC曲线分析；

图21为M组、C组与XSN-M组韦恩分析所得的差异代谢物相对含量分析结果图；

图22为M组、C组与XSN-M组韦恩分析所得的差异代谢物代谢通路分析；

图23为肠道菌群与血清代谢产物的相关性分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

本发明提出了心速宁制剂在制备治疗心律失常合并脂代谢异常药物中的应用。心速宁制剂由以下各原料质量份配比制得：黄连、清半夏、茯苓、枳实、常山、莲子心、苦参、青蒿、人参、麦冬、甘草的质量比为1：0.745：0.745：0.496：0.745：0.135：0.745：0.745：0.496：0.745：0.496。

心速宁制剂能下调心律失常合并脂代谢异常大鼠体内10个差异代谢物表达水平，上调6个差异代谢物表达水平，将16个差异代谢物调回正常水平。说明心速宁制剂通过调节体内代谢物紊乱水平来改善心律失常合并脂代谢异常。心速宁制剂下调的10个差异代谢物中，包括3个氧化脂肪酸FA 18:1+1O、FA 18:1+2O、FA 18:1+3O，表明心速宁制剂通过降低氧化脂肪酸的水平来改善体内代谢物紊乱水平。同时心速宁制剂能提高肠道中乳杆菌属丰度，减少布劳特氏菌属丰度来降低长链脂肪酸的水平，表明心速宁制剂通过对肠道紊乱菌属相对丰度进行调节，上调有益菌属丰度来改善体内代谢物紊乱水平，缓解肝脏中甘油三酯的蓄积，从而保护肝脏并延缓脂代谢异常的进展。

心速宁制剂还能推迟心律失常出现的时间，缩短心律失常持续时间。同时，降低血清中的TG、TC水平，升高HDL-C水平，具有抗心律失常、减轻脂肪变性、抑制肝脏脂肪沉积、肝保护的作用。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1：心速宁制剂的制备

组合物配方：黄连、清半夏、茯苓、枳实、常山、莲子心、苦参、青蒿、人参、麦冬、甘草的质量比为1：0.745：0.745：0.496：0.745：0.135：0.745：0.745：0.496：0.745：0.496。

工艺步骤如下：

(1)将所述各原料净制、切片、干燥备用；

(2)取黄连、枳实、常山、莲子心、苦参加60％乙醇，回流提取2次，第一次加原料量8倍的乙醇，回流提取2小时，第二次加原料量6倍的乙醇，回流提取1.5小时，合并提取液，滤过，滤液在0.04MPa、75℃下减压回收乙醇，继续浓缩至60℃下相对密度为1.36～1.38的稠膏，80℃下干燥成干膏，药渣弃去；

(3)取人参、茯苓、清半夏加70％乙醇，回流提取2次，第一次加原料量10倍的乙醇，回流提取2.5小时，第二次加原料量8倍的乙醇，回流提取2小时，合并提取液，滤过，滤液另器收集备用；

(4)步骤(3)所得药渣与麦冬、青蒿、甘草合并，加水煎煮二次，第一次加原料量10倍的水，第二次加原料量8倍的水，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至80℃下相对密度为1.05～1.06的清膏，加95％乙醇使含醇浓度达到70％，混匀，静置24小时使沉淀，收集上清液，滤过，滤液和步骤(3)另器收集的滤液合并，在0.04MPa、75℃下减压回收乙醇，继续浓缩至60℃下相对密度为1.36～1.38的稠膏，80℃干燥成干膏；

(5)将步骤(2)和步骤(4)所得的两种干膏合并，粉碎成细粉100目，加入其它药用辅料，混匀，制成制剂即得。

实施例2

本实施例采用左下肢皮下注射异丙肾上腺素加高脂饮食构建心律失常合并脂代谢异常大鼠模型，心速宁制剂给药干预后，通过心电图监测、体重增长量、血清中血脂、肝功指标及肠道菌群测序实验表明：心速宁制剂可用于心律失常合并脂代谢异常的干预治疗。

2.1实验材料

(1)实验药物

心速宁制剂粉末(陕西摩美得气血和制药有限公司)；倍他乐克(阿斯利康制药有限公司)；羧甲基纤维素钠(大连美仑生物技术有限公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料公司)；高脂饲料D12451(小黍有泰生物科技有限公司)。

(2)实验仪器

表1实验仪器

(3)实验动物

实验动物为雄性Wistar大鼠60只，SPF级别，日龄42-48日，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有动物实验操作均遵守天津中医药大学实验动物饲养和使用的相关规定。饲养条件为人工光照12h/d；温度24±2℃；换气速度15次/h和湿度50±10％，所有大鼠均自由摄食饮水。动物实验伦理号为：TCM-LAEC2022125。

2.2实验方法

(1)溶液配置

1)0.5％CMC-Na溶液：精密称取5.00mg CMC-Na均匀撒入900ml超纯水中，静置溶胀，溶胀平衡后水浴加热使其沸腾，并不断搅拌直至CMC-Na均匀溶解，加超纯水定容至1000ml，搅拌均匀，即得0.5％CMC-Na溶液，置于4℃冰箱备用。

2)倍他乐克溶液：将药片精细碾碎至粉末状，精密称取粉末适量配置成浓度为1.8mg/mL的药物混悬液。

3)心速宁制剂溶液：按照1:2:4比例精密称取3份所需质量的心速宁制剂粉末，加一定量0.5％CMC-Na溶液配置成浓度分别为0.052g/mL、0.104g/mL、

0.208g/mL的药物混悬液，即得心速宁制剂低、中、高剂量药液。

4)盐酸异丙肾上腺素溶液：精密称取盐酸异丙肾上腺素0.4g，加入生理盐水100mL，配置成浓度为4mg/mL的溶液，现配现用。

(2)动物分组及给药

雄性健康Wistar大鼠60只，适应性喂养7天后，依次分为6组，每组10只，分别为：空白组(C组)、模型组(M组)、阳性药组(Y组，18mg/kg，临床等效剂量)、心速宁制剂低剂量给药组(XSN-L组，0.52g/kg，临床等效剂量)、心速宁制剂中剂量给药组(XSN-M组，1.04g/kg，临床等效剂量2倍)、心速宁制剂高剂量给药组(XSN-H组，2.08g/kg，临床等效剂量4倍)，除C组喂饲普通饲料外，其余5组皆喂食高脂饲料(D12451)，共饲养8周。从第3周开始，各组按10ml/kg/d的比例灌胃给药，C组和M组给予等量生理盐水，连续灌胃6周。

(3)模型制备及评价

末次给药30min后，称重，给予各组大鼠三溴乙醇(0.75g三溴乙醇+2ml叔戊醇+48ml超纯水，0.8ml/100g)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定在鼠板上，并以针状电极刺入大鼠四肢，记录正常心电图，若造模前发现有心律失常的大鼠则弃之不用。心电图稳定后，除C组外，其余五组按照4mg/kg体重左下肢皮下注射盐酸异丙肾上腺素溶液，5s内注射完毕，C组大鼠左下肢皮下注射同等体积的生理盐水，构建心律失常合并脂代谢异常大鼠模型，开始记录心电图30min，并记录开始出现心律失常的时间及持续时间。具体造模条件见表2。

造模成功标准：宽大畸形的QRS波提前出现或者ST段上斜型压低，即提示出现心律失常；在显微镜下观察，肝组织脂肪变性程度30％以上的肝细胞脂肪变性即视为脂代谢异常。

表2动物分组及造模条件

(4)样本采集

心电图记录完成后，立即腹主动脉取血，室温静置2h，4℃，3500r/min离心10min，取上层血清，存储于-80℃超低温冰箱待用。

动物处死后，摘取大鼠心、肝组织，用预冷的生理盐水洗去残留的血液，滤纸吸干残余水分，称重并记录，计算肝脏指数(肝脏指数＝肝重/体重×100％)。取肝小叶置于10％福尔马林固定液中固定，用于HE染色。剩余组织放入冻存管中，液氮淬灭，存储于-80℃超低温冰箱，待用。

2.3实验结果

(1)心速宁制剂能推迟心律失常出现的时间，缩短心律失常持续时间。

M组大鼠注射异丙肾上腺素后，很快出现心律失常，且持续时间较长。心速宁制剂对大鼠心律失常出现时间和持续时间统计结果如表3所示。心律失常出现的时间：与M组相比，Y组、XSN-L组、XSN-M组以及XSN-H组均能推迟心律失常出现时间，且XSN-M组、XSN-H组可显著推迟心律失常出现的时间，效果优于Y组，差异具有统计学意义(p<0.05)。心律失常持续时间：与M组相比，Y组、XSN-L组、XSN-M组以及XSN-H组均能显著缩短心律失常持续时间，且差异具有统计学意义，其中XSN-H组效果最显著(p<0.001)，且XSN-L组、XSN-M组以及XSN-H组效果均优于Y组。各组对大鼠心律失常的干预作用代表性心电图如图1所示。

表3心速宁制剂对大鼠心律失常的影响

注：与M组相比，*p<0.05,**p<0.01，***P＜0.001

(2)心速宁制剂能抵抗心律失常合并脂代谢异常模型大鼠体重增长量升高，降低血清中的TG、TC水平，升高HDL-C水平。

于实验每周周末对大鼠称重并记录，分析造模过程中各组大鼠每周体重变化及造模前后体重增长量(％)。

体重增长量计算公式如下：

由图2可知，实验前，各组大鼠体重无明显差异。8周后，与C组相比，M组大鼠体重增长量显著增加。与M组相比，XSN-L组、XSN-M组、XSN-H组体重增长量显著降低，Y组无明显变化。表明心速宁制剂能抵抗心律失常合并脂代谢异常模型大鼠体重增长量升高的现象。

如图3所示：血清中TG水平，与C组相比，M组大鼠TG水平明显升高，差异具有极显著统计学意义(P<0.0001)。与M组相比，XSN-L组、XSN-M组、XSN-H组TG水平明显降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01、P<0.001)，Y组无明显变化；血清中TC水平，与C组相比，M组大鼠TC水平升高，与M组相比，XSN-L组、XSN-M组具有下降趋势，XSN-H组TC水平明显降低，差异具有显著统计学意义(P<0.001)，Y组无明显变化；血清中HDL-C水平，与C组相比，M组大鼠HDL-C水平明显降低，差异具有显著统计学意义(P<0.001)。与M组相比，XSN-L组、XSN-H组HDL-C水平有升高趋势，XSN-M组HDL-C水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，Y组无明显变化。可见，阳性对照药物倍他乐克(Y组)除能作用于心律失常外，对脂代谢异常并无相关作用。

(3)心速宁制剂能调节心律失常合并脂代谢异常大鼠肠道菌群结构。

择选C组、M组和心速宁制剂中剂量药液组(XSN-M组)，采用16S rRNA测序实验开展大鼠肠道菌群分析，具体分析内容包括：

(3.1)肠道菌群Beta多样性分析

Beta多样性分析有很多，例如常见的PCoA(主坐标分析)、PCA(主成分分析)、NMDS(非度量多维尺度分析)等，本研究中使用PCoA、PCA分析各组大鼠的粪便菌群Beta多样性，结果如图4所示，C组、M组和XSN-M组各组样本能较好聚集在一起，C组、M组能明显区分(p＝0.008)，说明心律失常合并脂代谢异常大鼠肠道菌群结构发生显著变化；XSN-M组菌群结构向C组菌群结构靠近，说明心速宁制剂对心律失常合并脂代谢异常大鼠菌群结构的改变有调节作用。

(3.2)肠道菌群物种结构分析

利用统计学方法对物种结构进行分析，可以获得各样本在各水平(域、界、门、纲、目、科、属、种)上包含哪些优势物种，以及每个优势物种的相对丰度。在本实施例中，主要分析了门水平及属水平上的物种结构。

如图5所示，在门水平上，检测到厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)等为各组大鼠肠道中相对丰度较高的菌门，其中厚壁菌门的丰度最高，为优势菌门。与C组大鼠相比，M组大鼠中厚壁菌门和放线菌门丰度相对提高，拟杆菌门的丰度相对降低；与M组相比，XSN-M组放线菌门和变形菌门丰度相对降低，拟杆菌门及疣微菌门的丰度相对提高。

如图6所示，在属水平上，检测到相对丰度较高的菌属主要集中在乳杆菌属(Lactobacillus)、Blautia(布劳特氏菌属)、Allobaculum、Ruminococcaceae_UCG_014(瘤胃球菌属)、Romboutsia(罗姆布茨菌属)上。与C组相比，M组中乳杆菌属、Allobaculum相对丰度显著降低，布劳特氏菌属、罗姆布茨菌属相对丰度显著升高；与M组相比，XSN-M组给药干预后乳杆菌属、Allobaculum菌属、Erysipelatoclostridium菌属相对丰度升高，布劳特氏菌属、罗姆布茨菌属相对丰度降低。心速宁制剂可以逆转放线菌门，拟杆菌门，乳杆菌属，Allobaculum菌属，布劳特氏菌属丰度的改变。

(3.3)LEfSe组间群落物种差异分析

LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size，线性判别分析)分析可以检测到丰度有显著差异的菌群。分析结果见图7和图8。结合两组之间差异菌属相对丰度柱状图与LEfSe分析结果可知，在属水平上，M组与C组相比，主要差异体现在布劳特氏菌属、乳梭菌属(lachnoclostridium)、Erysipelotrichaceae UCG-003、乏养菌属相对丰度显著增加，差异具有统计学意义；XSN-M组与M组相比，主要差异体现在Allobaculum菌属、Erysipelatoclostridium菌属、[Eubacterium_fissicatena]group、塞利单胞菌属(sellimonas)、[Clostridium_innocuum]group属、Ruminococcaceae_UCG_004、明串珠菌(Leuconostoc)相对丰度显著增加。

实施例3

本实施例使用UPLC-Q-Exactive-MS及结合多元统计分析的代谢组学方法对模型大鼠的血清进行研究，筛选出各组间的差异代谢物及涉及到的代谢通路，并与肠道菌群结果进行相关性分析，表明心速宁制剂通过改善体内代谢物紊乱水平来治疗心律失常合并脂代谢异常。

3.1实验材料

(1)实验试剂

表4实验试剂

(2)实验仪器

表5实验仪器

实验动物及样本采集与实施例2中的实验动物及样本采集相同。

3.2实验方法

择选C组、M组和心速宁制剂中剂量药液组(XSN-M组)，采用非靶向代谢组学测序技术进行分析，具体方法步骤如下：

步骤1：样品处理

吸取C组、M组、XSN-M组各组大鼠血清样品100μL，加入400μL冰乙腈沉淀蛋白，涡旋5min，4℃、12000rpm离心15min，吸取上清液，于氮气流下吹干，加入100μL预冷的80％甲醇-水复溶，涡旋3min，4℃、12000rpm离心10min，取上清液于进样小瓶的内衬管中，待测。

步骤2：质量控制(QC)样品

QC样品采用与步骤1相同的处理方法进行处理，首先连续测定3个QC样本，测定样品过程中，每10个样品后测定一次QC样品，对所有QC样品进行整体主成分(PCA)分析，以此来考察整个分析过程的重复性及稳定性。

通过得分图中QC样本的离散程度对仪器和方法的稳定性进行评价。整体PCA得分图如图9，正负离子模式下，QC样本波动都在均数±2倍标准差的范围内，表明实验过程中仪器和方法较为稳定，可进行后续分析。

步骤3：LC-MS分析条件

表6色谱与质谱条件

任意选择C组、M组、XSN-M组血清样本各1例，其总离子流图见图10。由总离子流图可以看出，各组色谱图在色谱峰的种类、峰的响应值上均存在差异，推测血清代谢产物存在差异。

步骤4：数据处理

采用OPLS-DA(正交偏最小二乘判别分析)分析各组之间的总体差异和代谢轮廓，结果如图11所示，负离子模式下R2X＝0.59，R2Y＝0.948，Q2＝0.847，在正离子模式下R2X＝0.534，R2Y＝0.978，Q2＝0.849。由得分图可知，各组之间存在代谢差异，有待进一步分析。

将得到的正、负离子2种检测模式获得的raw谱图使用AbfConverter软件转换成可以识别的abf格式文件；使用MS-DIAL软件导入项目，设置具体参数，进行峰提取、峰识别、峰对齐、归一化等预处理，得到包括保留时间(RT)、质荷比(m/z)、离子强度信息和化合物名称等在内的三维数据矩阵。使用MS-DIAL软件内置数据库及HMDB数据库(Human MetabolomeDatabase，人类代谢组学数据库)进行差异代谢物的鉴定。将获得的数据矩阵导入Simca-P14.1软件，对其进行多元变量统计分析。利用Metaboanalyst 5.0数据库计算代谢物的差异变化倍数(Fold Change，FC)，同时满足Pvalue<0.05，FC>1.5筛选差异代谢物。将所筛选的差异代谢物导入Metaboanalyst 5.0进行通路分析。

3.3实验结果

(1)心律失常合并脂代谢异常大鼠体内形成代谢物紊乱。

采用代谢组学数据分析网址Metaboanalyst 5.0，将经MS-DIAL软件处理后所得的数据矩阵导入，采用非参数检验计算FC，选择p<0.05且FC>1.5筛选差异代谢物并绘制火山图。各组相比火山图结果见图12。M组与C组相比：正离子模式下，差异变量共4876个，其中下调的有2411个，上调的有2465个；负离子模式下，差异变量共10475个，其中下调的有6081个，上调变量有4394个。M组与XSN-M组相比：正离子模式下，差异变量共1844个，其中下调的有1076个，上调的有768个；负离子模式下，差异变量共5929个，其中下调的有3942个，上调的有1987个。结果表明，M组与C组相比、M组与XSN-M组相比其体内代谢物水平均发生了较大变化。

对所得的差异变量中具有二级质谱图的变量，通过MS-FINDER(质谱分析)结合HMDB数据库对其进行解析鉴定。M组与C组相比，共鉴定出88个差异代谢物，其中正离子模式下差异代谢物共41个，负离子模式下有47个。M组与XSN-M组相比共鉴定出55个差异代谢物，其中正离子模式下差异代谢物共26个，负离子模式下有29个。

(2)代谢物紊乱指示心律失常合并脂代谢异常病变的发生。

将M组与C组筛选得到的88种差异代谢物导入Metaboanalyst 5.0，利用热图分析，对这88种差异代谢物在两组中的变化趋势进行分析。结果如图13所示，所筛选的88种差异代谢物在M组与C组中含量明显不同。

为了分析引起M组大鼠代谢紊乱的88种差异代谢物之间的相互关系，对这88种代谢物进行了Pearson(皮尔森)相关性分析。由图14可知：3-硫酸吲哚酚与牛磺结合型脱氧胆酸、FA 18:1+3O；牛磺结合型脱氧胆酸与N-果糖基异亮氨酸、柠檬酸盐、2-羟基异己酸、抗坏血酸、壬二酸、R-3-苯基乳酸；牛磺结合型猪脱氧胆酸与苯丙氨酸、N-甲酰蛋氨酸、抗坏血酸、D-葡萄糖醛酸、皮质酮、4-羟基苯丙氨酸、全反式维甲酸等之间相关系数均在0.9以上，说明其相关性极高。

ROC曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线)是描述敏感性和特异性相互关系的曲线，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。AUC表示ROC曲线下方面积，代表的是一个概率值，面积越大则判别准确性越高，其数值应在1.0-0.5之间，表明模型或方法具有较高的临床诊断和应用价值。如图15所示，M组与C组之间的差异代谢物的ROC曲线下面积均大于0.978(95％置信区间为0.803～1之间)，ROC曲线下面积最高(AUC＝1)，说明有较高的准确性，且预测精度均大于或等于93.3％和预测准确值为0.898，以上结果表明这些差异代谢物在一定程度上可以指示心律失常合并脂代谢异常病变的发生。

将M组与C组相比所得到的88个差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0在线软件进行代谢通路分析，结果如图16所示。差异代谢物主要被富集到6条代谢通路中，分别为维生素B6代谢(Vitamin B6 metabolism)、不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesis ofunsaturated fatty acids)、色氨酸代谢(Tryptophan metabolism)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、鞘脂代谢(Sphingolipidmetabolism)、亚油酸代谢(Linoleic acid metabolism)。

(3)心速宁制剂能改善代谢物紊乱水平。

根据差异代谢物的FC值，对M组比C组中上调的差异代谢物与M组比XSN-M组中上调的差异代谢物取交集，通过韦恩分析，共筛选出10个代谢物；对M组比C组中下调的差异代谢物与M组比XSN-M组中下调的差异代谢物取交集，共筛选出6个代谢物，结果见图17和表7。对所得到的16种药效差异代谢物进行了相关性分析，结果见图18。结果表明，大多数化合物之间均有较高的相关性。

使用ROC曲线对这16种差异代谢物进行评价，结果如图19和图20所示。M组与C组之间ROC曲线下面积均大于0.993，ROC曲线下面积最高(AUC＝1)，说明有较高的准确性，且预测精度均大于或等于97.3％和预测准确值为0.99，说明心律失常合并脂代谢异常发生时这些代谢物也会随之发生变化。

M组与XSN-M组之间ROC曲线下面积均大于0.96(95％置信区间为0.581～1之间)，ROC曲线下面积最高(AUC＝1)，说明有较高的准确性，且预测精度均大于或等于92.3％和预测准确值为0.927，说明心速宁制剂通过影响这些差异代谢物的表达水平来发挥调控心律失常合并脂代谢异常的作用。

表7取交集后筛选得到的差异代谢物

(4)心速宁制剂通过降低氧化脂肪酸的水平来改善体内代谢物紊乱水平。

为了深入分析各组之间差异代谢物的相对含量变化，对M组vs C组和M组vs XSN-M组之间所筛选的16个差异代谢物所对应的归一化的峰面积做箱式图进行分析，结果如图21所示，心速宁制剂对这16种化合物均有回调作用，可显著下调10个差异代谢物，上调6个差异代谢物，将16个差异代谢物调回正常水平。心速宁制剂显著下调的10个差异代谢物中，包括3个氧化脂肪酸FA 18:1+1O、FA 18:1+2O、FA 18:1+3O。

对16种差异代谢物进行代谢通路分析，结果如图22所示。这些代谢物主要被富集到缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成(Valine,leucine and isoleucine biosynthesis)和维生素B6代谢(Vitamin B6 metabolism)途径中。

(5)心速宁制剂通过对肠道紊乱菌属相对丰度进行调节，上调有益菌属丰度来改善体内代谢物紊乱水平。

将“实施例2中(3)”大鼠肠道菌群的分析结果与血清代谢组学所筛选的差异代谢物进行Pearson相关性分析，肠道菌群与血清差异代谢产物的相关性分析结果见图23。在门水平上，放线菌门(Actinobacteria)与pyridoxal 5＇-phosphate呈正相关(p＜0.05)，与多孔菌酸(polyporic acid)呈负相关(p＜0.05)。在属水平上，乳杆菌属(Lactobacillus)与多孔菌酸、N-巴豆酰基甘氨酸(N-Tigloylglycine)、酮亮氨酸(ketoleucine)、N-乙酰色氨酸(N-Acetyltryptophan)呈正相关(p＜0.05)，与pyridoxal 5＇-phosphate、FA 18:1+3O呈负相关(p＜0.05)；布劳特氏菌属(Blautia)与pyridoxal 5＇-phosphate、2-Mercaptobenzothiazole、FA 18:1+3O、N-Acetyl-5-hydroxytryptamine呈正相关(p＜0.05)，与多孔菌酸、酮亮氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸(N-Acetyl-l-leucine)、N-乙酰色氨酸呈负相关(p＜0.05)；回肠杆菌属(Ileibacterium)与酮亮氨酸呈正相关(p＜0.05)等。

结果可知，肠道菌群结构与血清代谢物密切相关，进而影响疾病的发生发展。其中，FA 18:1+3O与布劳特氏菌属(Blautia)呈正相关，与乳杆菌属(Lactobacillus)呈负相关。膳食中的脂肪酸以长链脂肪酸居多，高脂饮食导致大鼠摄入过多的脂肪，长链脂肪酸在肝脏中大量积累，不能及时通过β氧化分解，导致脂代谢异常的发生。乳杆菌属是一种益生菌，具有减少肝脏内脂质积累、抑制肠道致病菌的作用。有研究表明，在脂代谢异常患者中，布劳特氏菌属增加，且该属与肝脏甘油三酯蓄积呈正相关。因此，心速宁制剂可通过提高肠道中乳杆菌属丰度，减少布劳特氏菌属丰度来降低长链脂肪酸的水平，缓解肝脏中甘油三酯的蓄积，从而保护肝脏并延缓脂代谢异常的进展。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。