肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的构建方法及应用。所述构建方法包括以下步骤：使ob/ob小鼠保持在进食状态，并可以自由饮水，在12小时光照‑12小时黑暗循环中饲养数天；将ob/ob小鼠经口灌胃给予单剂量乙醇，乙醇用量为5g/kg体重，53％v/v水溶液；灌胃9小时后得到肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型。本申请使用单次狂饮乙醇灌胃ob/ob小鼠，只需要最小的干预和相对较短的时间，便可产生类似于MAFLD和AH患者的炎症和损伤表型，所得小鼠模型可用于研究疾病发病机制和测试治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及疾病模型构建技术领域，特别涉及一种肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

肥胖源于热量摄入和能量消耗之间的不平衡，目前影响全球1.077亿儿童和6.037亿成年人。肥胖导致代谢综合征(MetS)和合并症的发展，包括糖尿病和代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)。MAFLD由非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)更名而来，其总体患病率在普通人群中为6％-30％，越来越受到公众的关注。MAFLD是一种多系统疾病，与慢性肝病和心血管疾病的发病率和死亡率增加密切相关。

酒精性肝病表现出广泛的病症，包括单纯性脂肪变性、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、纤维化、肝硬化以及某些情况下的肝细胞癌。酒精性肝炎(AH)是一种以黄疸和肝衰竭为特征的急性临床综合征，可发生在酒精性肝病的任何阶段。由于多种饮酒模式，包括长期酗酒和狂饮，男性和女性的AH发病率都在上升，AH的总体预后较差。重度酒精性肝炎患者的平均30天死亡率估计为17-50％，5年死亡率为50％。在存活的患者中，80％的重度AH患者可能患有潜在肝硬化。如今，平均生活水平的提高和日常饮食习惯的改变导致肥胖和代谢综合征的患病率显著增加。因此，在相当多的患者中，这两种情况都与酒精性肝炎并存。

尽管MAFLD-AH共存的患病率越来越高，但这种情况的机制仍不清楚。肥胖和饮酒都与肝病有关，两者之间存在超相加的相互作用。即使饮酒量低，肥胖也会增加肝损伤的风险。另一方面，酗酒者有更高的MAFLD进展风险，更有可能发展为肝纤维化或肝细胞癌。不幸的是，肥胖诱导的MAFLD合并酒精性肝炎的发病机制尚不清楚，相应地缺乏以病理生理学为导向的治疗方法。

现有技术中已经开发了几种实验模型来模拟同时存在MAFLD和AH的患者。但存在以下问题：首先，没有完全概括患者的临床表现和MAFLD-AH共存情况的病理特征，如肝脏中性粒细胞浸润。其次，由于体重减轻和饮食摄入差异，饮食模型中可能存在高动物死亡率或高个体间变异性。第三，随着过去几十年酒精消费模式的改变，酗酒的增加引起了公众的关注。然而，目前现有的动物模型大多模仿慢性酗酒模式，而与短期大量饮酒精即狂饮相关的动物模型仍然缺乏。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的构建方法及应用。

第一方面，本申请提供了一种肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的构建方法，是采用以下技术方案得以实现的。

一种肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

S1.使ob/ob小鼠保持在进食状态，并自由饮水，在12小时光照-12小时黑暗循环中饲养数天；

S2.将ob/ob小鼠经口灌胃给予单剂量乙醇，乙醇用量为5g/kg体重，53％v/v水溶液；

S3.灌胃9小时后得到肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型。

第二方面，本申请提供了一种肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型的应用，是采用以下技术方案得以实现的。

一种上述构建方法构建得到的肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型在研究肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎的发病机制中的应用。

一种上述构建方法构建得到的肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎小鼠模型在评估肥胖诱导的代谢相关脂肪性肝病合并酒精性肝炎的治疗药物或治疗方法中的应用。

本申请具有以下有益效果。

本发明构建的模型发展了MAFLD-AH共存患者的组织学特征，且在肝脏中有显著的中性粒细胞浸润，并复制了人类AH和NASH的转录组学变化。通过对ob/ob小鼠应用单剂量乙醇狂饮，本申请模型显示出低个体间异质性和相对高的稳定性和再现性，可作为测试治疗药物和研究疾病发病机制的平台，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明口服灌胃给予野生型(WT)和ob/ob雄性小鼠单剂量的乙醇狂饮或等热量麦芽糖糊精溶液后肝细胞损伤、脂肪变性和氧化损伤对比结果图，其中，A-B：血清ALT、AST水平；C：肝脏重量与体重之比；D-E：用麦芽糖糊精或乙醇处理的代表性小鼠的H&E染色和油红染色以及油红O染色的定量，比例尺，50μm；F：通过免疫组织化学和4-HNE免疫染色定量评估肝脏4-羟基壬醛(4-HNE)，比例尺，50μm；G：肝Hmox-1和PTGS2的相对mRNA表达；H：脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球和总分的组织学评估；重量：n＝4；WT狂饮：n＝3；对象/对象：n＝4；ob/ob狂欢：n＝6；数值代表平均值±SEM，并通过配对或非配对t检验进行比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图2是本发明口服灌胃给予WT和ob/ob雄性小鼠单剂量的乙醇狂饮或等热量麦芽糖糊精溶液后中性粒细胞浸润和趋化性对比结果图，其中，A-B：中性粒细胞标记物LY6G和巨噬细胞标记物IBA1的免疫荧光染色和定量分析，比例尺，50μm；C-F：小鼠肝脏中CXCL1、CXCL2、CXCR2和LCN2的相对mRNA表达；重量：n＝4；WT狂饮：n＝3；对象/对象：n＝4；ob/ob狂欢：n＝6；数值代表平均值±SEM，并通过配对或非配对t检验进行比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图3是本发明口服灌胃给予WT和ob/ob雄性小鼠单剂量的乙醇狂饮或等热量麦芽糖糊精溶液后肝细胞凋亡对比结果图，其中，A-B：通过用麦芽糖糊精或乙醇灌胃处理的WT和ob/ob小鼠的石蜡肝切片的TUNEL染色检测细胞凋亡，以及TUNEL阳性细胞的定量数据，比例尺，25μm；C：BAX和BCL2表达的Western印迹分析；D-F：BAX、BCL2和BAX/BCL2比率的定量分析；重量：n＝4；WT狂饮：n＝3；对象/对象：n＝4；ob/ob狂欢：n＝6；数值代表平均值±SEM，并通过配对或非配对t检验进行比较*P<0.05，**P<0.01；

图4是本发明ob/ob小鼠和ob/ob狂饮小鼠肝脏中mRNA的差异表达和KEGG中的富集分析结果图，其中，A：来自RNA-seq的所有基因的PCA(主成分分析)显示，从ob/ob水和ob/ob狂饮组的肝脏样品明显分离为2簇；B：火山图显示ob/ob水与ob/ob狂饮的基因表达变化(蓝色和红色印迹分别表示下调或上调基因，倍数变化>1.5和p<0.05)；C：显示了富含KEGG的前十个上调基因；D：通过qRT-PCR验证和比较从RNA序列分析中选择的不同表达的炎症相关基因；对象/对象：n＝3；ob/ob狂欢：n＝3；

图5是本发明小鼠模型和人类ALD、NASH之间的转录相似性结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本专利申请进行进一步的说明。

1.材料和方法

1.1动物

10周龄雄性WT小鼠(C57BL/6背景)和ob/ob小鼠(B6/JGpt-Lepem1Cd25/Gpt)，体重48至54g，购自Gempharmatech Co.，Ltd.有限公司。每笼3只小鼠，在无病原体条件下，在12小时的光照-12小时黑暗循环中饲养。所有程序均按照上海交通大学医学院(中国上海)动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1.2饮食和酒精治疗

将小鼠随机分为四组(每组3至6只)。所有小鼠均进食正常生长饲料，并可以自由饮水数天。WT酒精狂饮组和ob/ob酒精狂饮组小鼠经口灌胃给予单剂量乙醇(5g/kg体重，53％v/v水溶液)，而WT组和ob/ob组小鼠用异热量麦芽糖糊精溶液灌胃。所有组在灌胃后9小时处死。收集血清，将肝脏组织固定在4％多聚甲醛中或储存在-80℃冰箱中短期使用。

1.3血清生化分析

使用自动生化分析仪(Chemray 240)测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶水平。

1.4组织学、免疫组织化学和免疫荧光

固定并包埋在石蜡中后，将肝组织切成5μm的切片。随后，切片组织用苏木精和伊红(H&E)和油红O(ORO)染色，然后在光学显微镜下观察。非酒精性脂肪性肝病的组织学评分系统根据NAS评分系统(NAS)进行。对于免疫组织化学和免疫荧光，石蜡切片用二甲苯脱蜡并用梯度乙醇(95％、90％、80％和70％乙醇)再水化。然后将组织切片浸入Tris-EDTA(pH＝9.0)中并在微波炉中加热15分钟，之后将其冷却至室温。使用3％过氧化氢阻断过氧化物酶活性10分钟。封闭和洗涤后，将切片与抗4-HNE抗体(1:50，ab48506，Abcam)、抗LY6G抗体(1:200，ab238132，Abcan)和抗IBA1抗体(1:2000，100369-764，VWR)在4℃下孵育过夜。第二天用二级抗体代替一级抗体并孵育1小时。免疫组织化学染色采用DAB和苏木精染色法，免疫荧光染色采用DAPI进行核染色。

1.5标记法

根据制造商提供的说明，使用TUNEL凋亡检测试剂盒(Servicebio，China，G1501)检测肝组织切片中的凋亡细胞。简言之，石蜡包埋切片在脱蜡和再水化后，用新鲜稀释的蛋白酶K在37℃处理25分钟。根据切片数量和肝组织大小，在tunel试剂盒中取适量的TDT酶、dUTP和缓冲液，以1:5:50的比例混合。将该混合物加入放置在扁平湿盒中的目标组织中，在37℃下孵育2小时。最后，将载玻片与DAPI溶液在室温下反应10分钟。在每个样品的5张非重复显微照片中计算每个场的TUNEL阳性核数。

1.6定量聚合酶链反应

使用Trizol试剂(Invitrogen，USA)从0.5g肝组织中提取总RNA。使用逆转录试剂盒(Takara，Otsu，Japan)逆转录1000ng RNA。在QuantStudio3(Thermo Fisher)中使用SYBRGreen Master Mix(RR420A，Takara，Dalian，China))进行实时PCR。使用NCBI PrimerBLAST工具设计引物(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).引物序列如表1所示。

表1定量PCR引物序列

1.7蛋白质印迹

根据标准方案，使用蛋白质提取试剂盒(Beyotime，南通，中国)分离总蛋白质，并调整至等量。通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物并转移至聚偏二氟乙烯膜。转移后，膜被封闭1 室温下在含有5％(wt/vol)脱脂干乳的TBST(pH 7.4)中培养h。用一级抗体在4 ℃。使用的抗体是：BAX(1:100050599-2-Ig，Proteintech)、BCL2(1:100068103-1-Ig，Proceintech)、β-微管蛋白(1:1000；M30109L，Abmart)。然后将膜与二级抗体(1:1000，A0208，A0216，Beyotime)在室温下孵育1小时。使用Immobilon Western化学发光HRP底物(Millipore Corporation，Billerica，MA)检测化学发光。使用Bio-Rad ChemiDoc XRS+系统观察免疫反应带。相对蛋白表达正常化为β-Tublin，并与对照组进行比较。

1.8RNA序列和生物信息学数据分析

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen，CA，USA)提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)评估RNA纯度和定量。在lluminaNovaseq 6000平台上对文库进行测序，并生成150bp的配对末端读数。使用R(v3.2.0)进行PCA分析，以评估样品的生物重复性。使用DESeq2进行差异表达分析。Q值<0.05，log2(倍数变化)>0.59被设置为显著差异表达基因(DEG)的阈值。使用R(v 3.2.0)对DEGs进行分层聚类分析，以证明不同组和样品中基因的表达模式。基于超几何分布，使用R(v3.2.0)进行KEGG途径以筛选显著富集项。R(v 3.2.0)用于绘制显著富集项的气泡图。使用GSEA软件在人类NASH肝脏转录组数据集(GSE GSE61260，两个人类NASH肝转录组数据集中：男性正常对照组与男性NASH)和人类AH数据库(GSE GSE155907)中进行转录组失调的跨物种比较。

1.9统计分析

数据显示为每组3-6只小鼠的平均值±SEM。统计分析使用Graphpad Prism 8.0(Graphpad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)。进行配对或非配对t检验以比较从四组收集的数据。p值<0.05被认为具有统计学意义。利用ImageJ分析阳性区域并进行油红、TUNEL和免疫染色的定量。

2.结果

2.1酒精狂饮加重ob/ob小鼠的肝损伤和氧化损伤

ob/ob小鼠在单次乙醇狂饮后血清ALT水平显著升高，而WT组之间没有差异(图1A)。与WT小鼠相比，WT暴食小鼠的血清AST水平升高，ob/ob暴食小鼠中AST水平进一步升高(图1B)。血红素-伊红和油红O染色显示ob/ob小鼠肝脏中存在明显的脂肪变性和空泡化，单剂量的乙醇暴饮导致更多的脂质积累，而WT和WT暴饮组显示很少的脂质沉积(图1D-E)。与ob/ob组相比，ob/ob暴饮暴食组的NAFLD活动评分(NAS)明显更高，这归因于脂肪变性和小叶炎症(图1H)。4-HNE(4-羟基壬醛)是氧化应激引起的脂质过氧化的稳定终产物。免疫组织化学分析显示，与ob/ob组和其他两个WT组相比，ob/ob暴食小鼠中的4-HNE阳性染色显著(图1F)。同时，肥胖/肥胖小鼠的肝血红素氧合酶1(Hmox1)和PTGS2 mRNA表达也显著增加(图1G)。

以上数据表明，单剂量饮酒后，ob/ob小鼠的ALT和AST以及组织学特征所反映的肝损伤水平加剧。

2.2酒精狂饮诱导ob/ob小鼠肝免疫细胞浸润和炎症

中性粒细胞在肝脏的浸润是酒精性肝炎最重要的特征之一。为了评估中性粒细胞肝浸润，对四组小鼠的肝组织学切片进行Ly6G的免疫荧光分析。单剂量乙醇经口灌胃在ob/ob小鼠中诱导了显著的中性粒细胞聚集，这表明肝脏切片中Ly6G阳性细胞增加(图2A)。相比之下，IBA1的免疫荧光显示，急性乙醇狂饮并未导致WT和ob/ob小鼠中浸润巨噬细胞数量的显著变化(图2B)。根据上述观察，检测了免疫细胞趋化因子、趋化因子受体和中性粒细胞相关细胞因子的肝脏mRNA表达。在肥胖/肥胖暴食组小鼠中，趋化因子CXCL1、CXCL2及其受体CXCR2的肝脏mRNA水平显著升高(图2C-E)。此外，ob/ob狂饮组中性粒细胞相关细胞因子LCN2的mRNA表达水平显著升高(图2F)。以上结果表明单剂量的乙醇狂饮会加剧ob/ob小鼠的中性粒细胞趋化性和浸润。

2.3酒精狂饮诱导ob/ob小鼠肝细胞凋亡

众所周知，酒精及其代谢物暴露会导致肝脏中的细胞死亡以及适应性细胞存活。乙醇狂饮后，ob/ob小鼠而非WT小鼠的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性肝细胞数量显著增加(图3A-B)。单剂量的乙醇狂饮也降低了抗凋亡成员BCL2的蛋白水平，导致ob/ob小鼠的BAX/BCL2比率增加(图3C-F)。以上结果表明，在ob/ob小鼠肝脏中，酗酒后细胞凋亡水平加剧。

2.4ob/ob狂饮模型中的转录组变化与AH和NASH患者相似

为了表征单剂量乙醇狂饮后ob/ob小鼠肝脏中的基因表达变化，获取了两组小鼠的肝脏样品，并通过高通量RNA序列分析。ob/ob组的样品用作对照。RNA序列数据的主成分分析(PCA)揭示了肥胖/肥胖小鼠肝脏的显著转录组学改变(图4A)。使用log2(倍数变化)标准最终鉴定了总共1600个差异表达基因≥0.59和P≤其中946个基因上调，654个基因下调。两组中差异表达的基因由火山图表示(图4B)。为了进一步研究ob/ob和ob/ob狂饮组之间差异表达基因的功能关联，本申请应用了KEGG富集(图4C)。KEGG分析表明上调的途径包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、癌症中的转录失调、细胞粘附分子、流体剪切应力和动脉粥样硬化等。为了证实测序数据的有效性，本申请使用定量逆转录PCR测量了几种炎症和脂质代谢相关基因的水平。与本申请的RNA测序(RNA-seq)结果一致，与ob/ob组相比，ob/ob狂饮组中性粒细胞相关细胞因子S100A8和S100A9、急性期反应基因Saa1和Saa2的mRNA表达水平显著增加(图4D)。比较转录组学分析反映了本申请的模型与人类酒精性肝炎以及NASH之间的相似性。本申请通过基因集富集分析(GSEA)将人类NASH和酒精性肝炎的失调分子途径与本申请的新模型进行了比较。

结果表明，ob/ob狂饮模型和人类ALD、NASH中的下调项包括药物代谢细胞色素P450、化学致癌等。本申请的模型和NAFLD、AH患者中的上调项包括酒精性肝炎的治疗靶点IL-17信号通路、TNF信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等(图5)。本申请的小鼠模型和人类ALD、NASH之间的转录相似性表明，ob/ob狂饮模型可以用于理解发病机制并测试针对这些功能和途径的治疗策略。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。