南瓜、西瓜和黄瓜GRF5基因在提高南瓜遗传转化效率中的应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及南瓜、西瓜和黄瓜GRF5基因在提高南瓜遗传转化效率中的应用。本发明通过构建含有南瓜、西瓜以及黄瓜GRF基因的植物过表达载体，以南瓜“京欣砧4号”为材料，用农杆菌介导法进行遗传转化，通过与不含有上述三种基因的重组载体进行遗传转化效率的比较，发现南瓜、西瓜和黄瓜GRF5基因均能促进南瓜的遗传转化效率且能够获得一定比例的转基因植株，这对于加快南瓜新品种培育进程具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种南瓜、西瓜和黄瓜GRF5基因在提高南瓜遗传转化效率中的应用。

背景技术

南瓜(Cucurbiteae)是属于葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)中的重要园艺作物之一。南瓜具有多种用途，除了主要作为食用外，南瓜还可作观赏植物，其果实含有丰富的营养成分和生物活性物质，具有保健功效。此外，由于南瓜植株具有发达的根系和较强的抗逆性等特点，因此常作为其他瓜类蔬菜如黄瓜、西瓜和甜瓜等的砧木，能够提高接穗的抗逆性以及果实的产量和品质。自2017年南瓜的参考基因组被公布以来，南瓜的性状改良和基因功能的研究进入了后基因组时代，虽然已经建立了有效的南瓜遗传转化和基因编辑体系，但其普遍存在着转化效率较低、稳定性较差等问题，如付洪冰等(2010)探究了预培养时间、侵染时间等诸多因素对南瓜‘金辉一号’的不定芽再生影响，建立了农杆菌介导的南瓜遗传转化体系，但转化效率仍旧只有0.56％，且后续未见相关研究人员采用类似的方法进行南瓜遗传转化，可能是由于特殊的处理方法或者是稳定性较差等问题存在难以重现的问题，严重制约了南瓜性状改良和基因功能的研究。

影响南瓜遗传转化效率的主要因素是组织培养中再生效率较低，而利用促再生基因可以在一定程度上克服再生率低和遗传转化效率低的问题。研究表明，通过异位过表达促再生基因如WOX家族基因、BBM基因、GRF基因等来提高植物的遗传转化效率和建立基因编辑体系是一种切实可行的有效途径，目前在小麦、玉米、苹果、西瓜等多种植物上已有报导，但在南瓜遗传转化和基因编辑体系上的应用还尚未见报道。

发明内容

基于此，本发明针对南瓜转化效率较低、稳定性较差等问题进行研究，发现过表达南瓜、西瓜和黄瓜的GRF5基因能够有效改善上述问题。

本发明的目的之一在于保护南瓜、西瓜和黄瓜GRF5基因在提高南瓜遗传转化效率中的应用，所述南瓜GRF5基因为与SEQ ID NO:1具有85％以上相似性并且具有提高南瓜遗传转化效率的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，或是可编码与SEQ ID NO:1序列编码的蛋白质具有85％以上相似性并且具有提高南瓜遗传转化效率功能的蛋白质的核苷酸序列；

所述西瓜GRF5基因为与SEQ ID NO:2具有85％以上相似性并且具有提高南瓜遗传转化效率的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，或是可编码与SEQ ID NO:2序列编码的蛋白质具有85％以上相似性并且具有提高南瓜遗传转化效率功能的蛋白质的核苷酸序列；

所述黄瓜GRF5基因为与SEQ ID NO:3具有85％以上相似性并且具有提高南瓜遗传转化效率的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，或是可编码与SEQ ID NO:3序列编码的蛋白质具有85％以上相似性并且具有提高南瓜遗传转化效率功能的蛋白质的核苷酸序列。

本发明的目的之二在于保护上述南瓜或西瓜或黄瓜GRF5基因的生物材料在南瓜遗传转化效率中的应用，所述生物材料包括但不限于表达盒、重组载体、转基因细胞。

作为一种优选的实施方式，所述重组载体包括但不限于pBSE403载体，所述pBSE403载体是在pBSE401载体的EcoRⅠ酶切位点之间插入35S:DsRed-Terminal表达框改造获得。

作为一种优选的实施方式，所述转基因细胞包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。

作为一种优选的实施方式，具体应用包括以下步骤：

构建含有上述南瓜或西瓜或黄瓜GRF5基因的表达载体，将表达载体转入农杆菌中并制备侵染液，将南瓜外植体放入到侵染液中依次进行超声处理、真空转化处理，之后取出进行共培养，分化再生。

作为一种优选的实施方式，所述表达载体中插入有荧光蛋白作为遗传转化筛选标记。

作为一种优选的实施方式，所述荧光蛋白包括但不限于DsRed标记。

作为一种优选的实施方式，超声处理的功率为50～150W，超声处理的时间为8～12s。

作为一种优选的实施方式，超声处理时，不断摇晃三角瓶，保证外植体不沉入底部。

作为一种优选的实施方式，真空转化的方法为：将外植体取出后转移到医用注射器中，加入侵染液，排出空气，封闭注射器远端，拉动柱塞施加压力。

本发明首先鉴定并克隆得到了南瓜、西瓜和黄瓜GRF5，之后将其连接到含有DsRED荧光标记的pBSE403R质粒中获得过表达载体，以南瓜“京欣砧4号”为材料，用农杆菌介导法进行遗传转化，通过与不含有上述三种基因的重组载体以及其它多种促转化基因进行遗传转化效率的比较，发现过表达南瓜、西瓜和黄瓜GRF5可以将南瓜转基因器官再生效率分别提高到3.23％、3.36％、2.89％，且能够获得部分比例的转基因植株，平均遗传转化效率1.03％、1.47％、0.66％，这对于加快南瓜新品种培育进程具有重要意义。

附图说明

图1为现有遗传转化方法转化结果；

图2为过表达ZmBBM-ZmWUS基因组合的结果；

图3为过表达CsGRF5、ClGRF5和CmoGRF5l基因的结果；

图4为pBSE403R质粒的物理图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明首先以再生能力较强的京欣砧4号为研究对象，使用含有报告基因35S:DsRed的pBSE403R载体，以子叶为外植体，采用农杆菌浸泡，并通过施加超声波和真空负压处理来加强侵染强度的方法进行遗传转化，使用手持荧光蛋白观测灯进行观察，结果如图1所示，发现未被转化的愈伤组织由于没有表达DsRed荧光蛋白而均无红色荧光，而外植体上被转化的愈伤组织由于表达DsRed荧光蛋白呈现出红色荧光(图1A、B)，表明报告基因35S：DsRed荧光蛋白可以用做对南瓜阳性转化事件的筛选标记。然而，进一步继续培养，所得再生芽均无DsRed荧光(图1C、D)，经过8次独立的遗传转化试验，共计转化1000个外植体，未获得阳性转基因植株，分析原因可能是由于现有的南瓜遗传转化体系对技术细节要求较高或对组培室条件要求较高等，导致不同研究小组间推广时存在技术难度、稳定性差的问题。

图1为上述遗传转化方法转化结果，其中A和B是外植体的明场和荧光图像(红色箭头指向表达DsRed的愈伤组织，白色箭头指向没有表达DsRed的愈伤组织)，C和D是阴性再生芽的明场和荧光图像(红色箭头指向表达DsRed的愈伤组织，白色箭头指向没有表达DsRed的再生芽)。

基于此，发明人尝试以促转化基因进行研究，以期能够改善南瓜的遗传转化效率低、稳定性差的问题。

实施例1CmoGRF5l、CsGRF5和ClGRF5基因的克隆

分别根据基因号CmoCh01G000380、基因号Cla97C07G140860、基因号CsaV3_3G031320的核苷酸序列设计能够扩增南瓜CmoGRF5l、西瓜CsGRF5、黄瓜ClGRF5基因的引物，然后以本实验室保存的纯种中国南瓜R214(见文献：张春雨.适合小果型西瓜嫁接的砧用南瓜新组合的配制和评价[D].华中农业大学,2022.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2022.001239.)、西瓜97103(见文献：鲁军阳.南瓜砧木嫁接提高西瓜耐冷性的机制研究[D].华中农业大学,2021.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2021.000052.)和黄瓜CU2(见文献：王文博.黄瓜耐低氮种质筛选及其低氮耐受性指标评价[D].华中农业大学,2022.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2022.001262.)分别作为CmoGRF5l(具体序列信息见SEQ ID NO:1)、ClGRF5(具体序列信息见SEQ ID NO:2)、CsGRF5(具体序列信息见SEQ IDNO:3)的基因扩增材料，使用TransZol(北京全式金生物技术股份有限公司)按照说明书提取RNA，根据HiScriptIII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书进行逆转录，cDNA产物存放在-20℃。使用Geneious软件设计南瓜、西瓜和黄瓜的GRF5基因克隆引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，使用2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)(诺唯赞)进行高保真PCR反应体系进行扩增南瓜、西瓜、黄瓜的GRF5基因的CDS序列，扩增完按照天根普通DNA产物纯化试剂盒说明书进行液体回收。其中，南瓜、西瓜和黄瓜的GRF5基因克隆引物如下：

南瓜：[pBSE403R]-CmoGRF5l

F：5’-acgatactcgagtaatctagATGAATTCAGGTCCAAAGCCC-3’(SEQ ID NO:4)；

R：5’-tacgaacgaaagctctgagcTTACCCATCCAAGCTGAGATTG-3’(SEQ ID NO:5)。

西瓜：[pBSE403R]-ClGRF5

F：5’-acgatactcgagtaatctagATGAATTCAAGTCCAAAGACCTG-3’(SEQ ID NO:6)；

R：5’-tacgaacgaaagctctgagcTCATAACCCAATAAAATTTCCACTTTG-3’(SEQ ID NO:7)。

黄瓜：[pBSE403R]-CsGRF5

F：5’-acgatactcgagtaatctagATGAATTCAAGTCCAAAGACCTG-3’(SEQ ID NO:8)；

R：5’-tacgaacgaaagctctgagcTTAACCATTTGAATTTGAGGCTAAATC-3’(SEQ ID NO:9)。

其中，扩增后的CmoGRF5l的序列如下所示：ATGAATTCAGGTCCAAAGCCCTGCGTCTCTCCTTTCACACCAACTCAATGGCAAGAACTAGAACACCAAGCTCTCATATTCAAATACATGGTTTCAGGAGTACCTATCCCTCCTGATCTAATCTTCTCTGTGAAAAGAAGCTTGGATTCCTCCATTTCTGCAAGACTCTTCCCTCACCAACCCATTGGGTGGGGATGCTTTGAGATGGGTTTTGGCAGAAAAGCAGATCCTGAACCAGGAAGGTGCAGAAGAACAGATGGGAAAAAATGGAGATGCTCAAAAGAAGCTTATCCAGACTCCAAATACTGCGAGAGGCACATGCACAGAGGCAGAAACCGTTCAAGAAAGCCTGTGGAAATCTCTTCAACGCCACCAGCTCAAACGCCACCGCCTTTAATCCTCACTTCAACCCGGAGCCTCTCTGCTTCCTCCCCAACCTCCTCTTCCTATTCTCTCTCTACACTTTCCTCTTCTTCTTCTCTGACATGTGAAACTCAGTCCTATCACCAAGCTCCTGCTCCTGCTCCTGCCCCTGCTCCTGCTGCTTATCAGGAATCCTCCATTCATCCATATTTGTATCCTCAATCATCATCCTCCAGACCTCCATGTTCTGATTTCTCTCCAAACAGTACAAACCCTCAACTCTTTTTGTACTCAGGGACTCATCCTCAAGCTGACAAAGACTACAGGGATATTAATGGTCCAAGAGAGGGTGTGGGCGTGCAGGCGTTCTTTCCCTCAGTTGCAGACTCTGCAAGAAGCATAGGTGAGGTTTATAGTCAGCCAATAGGGATGGATTCTTACAAAGGATTCTCCCATGCTGTTTCCAACAGCCACCAAATTTACAGTTCGAAACAGGCGAGGCAACAACAAGAGCAACACTGCTTTGTTTTGGGCACAGATTTTAATAAATCAACAAGATCAGCTAAAACAGAGGAAGAAGATGATGCAGAAACCCAGAAGCCACTACTCCACTTCTTTGAGGATTGCCCACCAAAAAACTCAGATTCCTGGCTTGATTTAGCCTCAAATTCAAATGGTTAA(SEQ ID NO:1)；

ClGRF5的序列如下所示：ATGAATTCAAGTCCAAAGACCTGCACCTCTCCTTTCACAGCAACTCAATGGCAAGAACTGGAACACCAAGCTCTGATCTTCAAATACATGGTTTCAGGAGTACCAATCCCTCCTGATCTAATCTTCTCTGTGAAAAGAAGCTTGGATTCCTCCATTTCTGCAAGACTCTTCCCTCACCAACCCATTGGATGGGGGTGTTTTGAGATGGGTTTTGGCAGAAAAGCAGACCCAGAGCCAGGAAGGTGCAGAAGAACAGATGGGAAAAAATGGAGATGCTCCAAAGAGGCATATCCAGACTCCAAATACTGCGAGAGGCACATGCACAGAGGCAGAAACCGTTCAAGAAAGCCTGTGGAAATATCTTCAACGCCACCAACTCAAAACCCAACGCCTTTAATCCTCACCTCAACCAGGACCCTCTCTTCTTCCACTCCAACCTCCTCTTCCTATCCTCTCTCTACACTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCACTAACCTGTGAAACTCAATCTTATCACCAACCTCCTACTGCTTATCATGAATCCTCCATTCATCCATTTCTGTATCCCCAAACTTCCTCTAGACCTCCATGCTCTGATTTCTCTTCAAACAATACAAACCCTCAACTCTTCTTGTACTCAGGGACTCATTCTCAAGCAGATAAAGAGTACAGGGATAATAGTGGTCCAAGAGAGGGTGTGGGAATGCAGGCGTTCTTTCCCTCAGTTGCAGATTCTGCAAGAAGCATTGCTGAGGTTTATAGTCAGCCAATAGGGATGGATTCTTACAAAGGATGCTCCCAATTTGTTTCCCAAAGCCATCAAATTTACAGTTCGAAACAGGCAAGGCAACAACAAGAGCAACACTGCTTTGTTTTGGGCACAGACTTCAATAAATCGTCAAGATCAGCTAAAACAGAGGAAGAAGAAGATTCAGAAACCCAGAAGCCGCTACTCCACTTCTTTGAGGATTGCCCACCTAAAAACTCAGATTCCTGGCTTGATTTAGCCTCAAATTCAAGTATACAAAGTGGAAATTTTATTGGGTTATGA(SEQ ID NO:2)；

CsGRF5的序列如下所示：ATGAATTCAAGTCCAAAGACCTGCGTCTCTCCTTTCACACCAACTCAATGGCAAGAACTAGAACACCAAGCTCTCATATTCAAATACATGGTTTCAGGAGTACCTATCCCTCCTGATCTAATCTTCTCTGTGAAAAGAAGCTTGGATTCCTCCATTTCTGCAAGACTCTTCCCTCACCAACCCATTGGGTGGGGATGCTTTGAGATGGGTTTTGGCAGAAAAGCAGATCCTGAACCAGGAAGGTGCAGAAGAACAGATGGGAAAAAATGGAGATGCTCAAAAGAAGCTTATCCAGACTCCAAATACTGCGAGAGGCACATGCACAGAGGCAGAAACCGTTCAAGAAAGCCTGTGGAAATCTCTTCAACGCCACCAGCTCAAACGCCACCGCCTTTAATCCTCACTTCAACCCGGAGCCTCTCTGCTTCCTCCCCAACCTCCTCTTCCTATTCTCTCTCTACACTTTCCTCTTCTTCTTCTCTGACATGTGAAACTCAGTCCTATCACCAAGCTCCTGCTCCTGCTCCTGCCCCTGCTCCTGCTGCTTATCAGGAATCCTCCATTCATCCATATTTGTATCCTCAATCATCATCCTCCAGACCTCCATGTTCTGATTTCTCTCCAAACAGTACAAACCCTCAACTCTTTTTGTACTCAGGGACTCATCCTCAAGCTGACAAAGACTACAGGGATATTAATGGTCCAAGAGAGGGTGTGGGCGTGCAGGC+GTTCTTTCCCTCAGTTGCAGACTCTGCAAGAAGCATAGGTGAGGTTTATAGTCAGCCAATAGGGATGGATTCTTACAAAGGATTCTCCCATGCTGTTTCCAACAGCCACCAAATTTACAGTTCGAAACAGGCGAGGCAACAACAAGAGCAACACTGCTTTGTTTTGGGCACAGATTTTAATAAATCAACAAGATCAGCTAAAACAGAGGAAGAAGATGATGCAGAAACCCAGAAGCCACTACTCCACTTCTTTGAGGATTGCCCACCAAAAAACTCAGATTCCTGGCTTGATTTAGCCTCAAATTCAAATGGTTAA(SEQ ID NO:3)。

实施例2转化载体的构建

以pBSE403R质粒(质粒图谱见图4，其是在pBSE401载体的基础上使用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切，插入35S:DsRed-Terminal表达框改造而成)用XbaⅠ酶和SacⅠ酶进行酶切，去掉4kb的Cas9序列，回收13kb的大片段。将回收到的13kb的大片段和PCR片段按照诺唯赞的无缝克隆试剂盒说明书进行无缝克隆。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α(购自北京擎科生物科技有限公司)，在50mg/L卡那霉素固体平板上于37℃培养，挑选单克隆后，通过北京擎科生物科技有限公司测序验证其序列。测序结果表明，所获得的含有CmoGRF5l、ClGRF5和CsGRF5的过表达载体与预期相符，说明重组质粒构建成功。

转化农杆菌：先将pBSE403R载体转化到农杆菌菌株EHA105(购自上海唯地生物技术有限公司)中，再将农杆菌置于1mL含50mg/L Kan和25mg/LRif的LB培养基里，28℃、220r/min摇床培养过夜，吸取60μL转移到30mL LB(含Kana、Rif)培养基中，过夜培养至OD

实施例3农杆菌介导的南瓜遗传转化

分别采用表1中的载体对京欣砧4号[购自：京研益农(北京)种业科技有限公司]进行3次独立的遗传转化，具体方法如下：

播种：挑选籽粒饱满，大小一致的种子，用55℃温水浸泡南瓜种子30min以上，去壳后对种子消毒(将种子置于75％乙醇中表面消毒30s，再用0.5％NaClO浸泡消毒15min，最后用无菌水冲洗6遍)。将消毒后的种子播种在种子萌发培养基上，黑暗环境下进行萌发培养(培养温度为28℃)，所用种子萌发培养基：MS+1mg/L6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1mg/L脱落酸(ABA)。

外植体的制备：待播种好的种子萌发36-48h左右，种皮开始脱去、子叶上出现清晰的维管束棱线时，在超净工作台内，将种子放置在铺在滤纸上，滤纸用IM液体培养基润湿，切弃远端约1/3的子叶，去掉胚轴，将两片子叶分开，每片子叶在近端会形成一个U型的伤口，用纳米刷子(KITA Nanotek brush,NANO-1-003)在U形切端附近的背面轻轻刮擦外植体，沿着从远轴到近轴的方向刮擦4-5次，即得到外植体。

农杆菌侵染：挑取阳性农杆菌菌落，置于装有1mL含50mg/L卡那霉素(Kan)和25mg/L利福平(rif)的液体LB培养基在28℃下摇动(200r/min)

24小时。将摇混的菌转移到15mL液体LB培养基中，以1:1000的比例培养过夜，达到OD

共培养：真空操作后，排出农杆菌悬浮液，将外植体转移到带干滤纸的培养皿中，将外植体表面的液体吸干，在带滤纸的共培养培养基[MS+1mg/L6-BA+1mg/L ABA+2.5mMMES+200μM As+250μMα-硫辛酸(LA)上于23℃条件下暗中培养4d。使用荧光体视显微镜和手持荧光蛋白观测灯LUYOR-3415RG(上海路阳生物技术有限公司)观察荧光蛋白的发光情况，评估侵染质量。

分化再生：共培养后的外植体用无菌水冲洗8次，用灭菌后的吸水纸吸表面附着的液体，然后转移到分化培养基上，将外植体略微斜着插入分化培养基[MS+1mg/L 6-BA+1mg/L ABA+200mg/mL特美汀(TMT)。外植体在分化培养基上每隔10d左右继代一次，分别在分化第7周、分化第9周、分化第11周时挑选含有转基因再生芽的外植体置于含有分化培养基的组培瓶中并适当进行修整。

生根培养：转基因再生芽伸长到2～4cm时，将其更换到含有生根培养基的培养瓶中。

阳性芽的鉴定：阳性植株采用手持荧光蛋白观测灯LUYOR-3415RG双波长荧光蛋白激发光源紫外灯进行检测，按照荧光蛋白观测灯的使用说明，打开红色光源激发荧光，使用相应红色滤光片检测是否表达红色荧光，如图3所示。

所用到的促再生基因组合的信息如下：组合1、组合2由北京大学现代农业研究院张华伟老师提供，组合4由西北农林大学袁黎老师提供，组合3和组合5由本实验室构建并保存，组合7、8、9为实施例2中构建，具体信息见下表1：

表1不同促再生基因及基因组合构建的载体信息

其中，CsGRF4基因ID为CsaV3_2G035970，CsGIF1基因ID为CsaV3_2G003880；CmoGRF5基因ID为CmoCh20G009500，CmoGIF3基因ID为CmoCh06G010130，m代表对该基因进行了miR396靶点突变，突变位点参考Feng等(2021)。

结合已有的报道，我们采用以下指标来评估促再生基因在提高南瓜遗传转化效率方面的表现。首先，由于早期很难区分转基因再生芽能否分化出具有健康顶端分生组织的植株(分化10周前)，因此将这一阶段所得转基因再生芽统称为转基因器官(Lian et al，2022)；采用转基因器官数与参试外植体总数的比值表征为转基因器官再生效率。在分化培养后期(分化14周后)，将仍然缺乏顶端分生组织或顶端分生组织畸形的转基因再生芽称为畸形转基因器官，并使用畸形转基因器官数与转基因器官数的比率来表征畸形率；将具有正常顶端分生组织的转基因器官称为转基因植株，并使用转基因植株数与外植体数的比率来表征遗传转化效率。根据上述定义，我们对3次独立的遗传转化实验数据进行统计分析，结果如下表2所示：

表2过表达不同促转化基因对遗传效率的影响

过表达ZmBBM-ZmWUS基因组合的结果如图2所示，其中，A和B是转化空白载体的外植体分化情况的明场和荧光图像，C和D是过表达ZmBBM-ZmWUS组合的外植体分化情况的明场和荧光图像，E和F是转化空白载体的阴性再生芽的明场和荧光图像，G和H是过表达ZmBBM-ZmWUS组合获得的畸形转基因器官的明场和荧光图像。由图2可知，转化pBSE403R空白载体的对照所得再生芽均不表达DsRed荧光(图2A、B)，而过表达ZmBBM-ZmWUS组合可以获得DsRed的再生芽(图2C、D)。然而，与阴性再生芽均能发育为着生健康顶端分生组织的植株相比(图2E、F)，过表达ZmBBM-ZmWUS组合所获得的转基因再生芽(表达DsRed)后期发育畸形，常发育为畸形叶片、簇生叶片等，不能分化出正常的顶端分生组织(图2G、H)。

过表达CsGRF5、ClGRF5和CmoGRF5l基因的结果如图3所示，其中A、B是转化空白载体pBSE403R的外植体分化情况的明场和荧光图像，C和D是过表达CmoGRF5l的外植体分化情况的明场和荧光图像，E和F是过表达ClGRF5的外植体分化情况的明场和荧光图像，G和H是过表达CsGRF5的外植体分化情况的明场和荧光图像。

由上述结果可知，过表达ClGRF4m-ClGIF1不提高南瓜转基因器官再生效率和遗传转化效率，而过表达ZmBBM-ZmWUS、TaGRF4-OsGIF1、CsGRF4m-CsGIF1、CmoGRF5m-CmoGIF3等4种促再生基因组合可以分别将南瓜转基因器官再生效率提高到2.49％、35.73％、2.74％、3.09％，但所得转基因器官均发育畸形，畸形率100％，未能获得含有健康顶端分生组织的转基因植株。过表达CmoGRF5l、ClGRF5和CsGRF5可以将南瓜转基因器官再生效率分别提高到3.23％、3.36％、2.89％，虽然仍然存在部分转基因器官发育畸形的现象，但能够获得部分比例的转基因植株，平均遗传转化效率1.03％、1.47％、0.66％，这对于加快南瓜新品种培育进程具有重要意义。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。