一种基于蛋白乳酸化水平预测主动脉瘤的生长和破裂风险的试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于蛋白乳酸化水平预测主动脉瘤的生长和破裂风险的试剂盒。本发明通过构建主动脉瘤和夹层小鼠模型，检测其血管组织中蛋白乳酸化水平，将其分为高乳酸水平组和低乳酸水平组，发现低乳酸化水平小鼠主动脉瘤形成减少，主动脉夹层发生减少，进一步经过生存分析，显示两组间生存曲线具有显著差异。因此，在主动脉瘤检测指标的基础上，以蛋白乳酸化水平为切入点，通过鉴定蛋白乳酸化水平，将蛋白乳酸化水平和主动脉瘤的生长和破裂风险进行关联，从而达到早期预测主动脉瘤恶化、夹层发生的目的，有助于临床危急事件的预测和早期诊治，减少夹层等严重不良事件的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于蛋白乳酸化水平预测主动脉瘤的生长和破裂风险的试剂盒，属于生物医学检测技术领域。

背景技术

主动脉瘤/夹层(AA/AD)是一种高发病率和死亡率的临床急症。当主动脉壁内层(内膜)破裂时，血液经撕裂处进入主动脉中膜，就会发生AD。AD在全球的患病率为1.3％-8％。早期筛查高危人群(高血压高危因素等)已被证明是预防AD相关死亡的有效方法，AD早期诊断和筛查显得尤为必要。

蛋白翻译后修饰是在翻译后的蛋白上进行的进一步调控，近期研究发现，乳酸衍生的蛋白乳酸化是一种新发现的可影响蛋白功能的重要修饰方式之一。有趣的是，乳酸化的蛋白结构及功能受到极大的影响。在肿瘤中，其对免疫细胞的影响巨大，会影响抗炎性巨噬细胞的分化和成熟，从而影响肿瘤的免疫逃逸和杀伤。其乳酸化水平与肿瘤的发生和不良预后密切相关。但是目前还没有关于通过检测蛋白乳酸化水平预测主动脉瘤的生长和破裂风险的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为解决如何预测主动脉瘤的生长和破裂风险以实现对主动脉瘤/夹层的早期筛查的技术问题。

为达到解决上述技术问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供用于检测蛋白乳酸化水平的试剂在制备预测主动脉瘤的生长和破裂风险的试剂盒中的应用。

优选地，检测样本为病变血管组织。

优选地，所述用于检测蛋白乳酸化水平的试剂为利用泛乳酸化抗体或采用LC-MS/MS方法检测总蛋白乳酸化水平所用到的试剂。

优选地，所述利用泛乳酸化抗体检测总蛋白乳酸化水平所用到的试剂包括：蛋白提取试剂盒和检测抗体，所述检测抗体包括一抗赖氨酸残基乳酸化抗体和山羊抗兔二抗。

优选地，所述采用LC-MS/MS方法检测总蛋白乳酸化水平所用到的试剂包括：蛋白提取试剂盒和内标。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明基于蛋白乳酸化水平和主动脉瘤的生长及破裂风险相关，为乳酸化水平检测应用于临床预测主动脉瘤预后提供理论依据，在临床上检测主动脉瘤患者病变血管组织中总蛋白乳酸化水平，筛选高心血管事件风险，可以对既往临床指标进行补充，从而达到早期预测主动脉瘤恶化、夹层发生的目的，有助于临床危急事件的预测和早期诊治，减少夹层等严重不良事件的发生。

附图说明

图1为小鼠高乳酸水平组和低乳酸水平组的生存差异曲线(高水平组生存率较低水平组明显降低，P＜0.05)；

图2为通过蛋白乳酸化水平预测主动脉瘤的生长和破裂风险的受试者工作特性曲线(ROC)。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

其中，检测蛋白乳酸化水平的方法如下：

(1)采用蛋白提取试剂盒提取总蛋白并测定蛋白浓度；

(2)通过western blot法测总蛋白乳酸化水平。其中，一抗可采用赖氨酸残基乳酸化抗体(在QuickBlock

实施例

1)实验动物及动物模型制备：使用SPF级成年雄性C57BL/6小鼠(8周龄，20-25g)，小鼠用皮下埋藏植入式微量渗透缓释泵皮下输入AngⅡ(2500ng/kg·min)和渗透量为0.5μl/hr的0.9％生理盐水，持续泵入28天，构建主动脉瘤和夹层模型。分为WT+Control组，WT+AngⅡ药物组，每日记录小鼠生存曲线。28天后安乐死处死小鼠取材，固定包埋组织做石蜡切片并且进行H&E染色及EVG染色，显微镜下观察主动脉弹性纤维撕裂和假腔形成情况。实验方案得到复旦大学动物管理与伦理委员会批准。

2)取材观察主动脉扩张及成瘤情况检测蛋白乳酸化水平

血管取材，打开腹腔取出血管，置于冰上的含预冷的PBS缓冲液的10cm培养皿中，快速剪去多余组织，于纱布上稍吸取多余的PBS后天平称重并记录，注意避免挤压、挫伤和干枯。于莱卡显影镜进行拍照留下证据，以观察主动脉成瘤情况及血管扩张情况。在每只老鼠个体血管组织的同样的部位进行大小约0.5cm的组织进行取材，将该组织进行蛋白提取后检测总蛋白乳酸化水平。根据检测结果，按照中位数将乳酸修饰水平将小鼠分为两组：低水平组(标化值1±0.23)vs高水平组(标化值2.34±0.45)。结果显示：低乳酸化水平小鼠主动脉瘤形成减少，主动脉夹层发生减少，进一步经过生存分析，显示高乳酸水平组和低乳酸水平组的生存曲线具有显著差异，如图1所示。

通过计算乳酸化水平与主动脉生长及破裂情况，生成ROC曲线，通过乳酸化水平预测主动脉瘤生长情况，其C值＝0.76，最佳截断值为(1.56mg/ml)，如图2所示。说明通过检测乳酸化水平预测主动脉瘤生长及破裂风险具有良好的灵敏度和特异性。

检测患者术后病变组织的蛋白乳酸化水平，经过随访(时间为1年)，得到实际患者情况进行对比，发现：乳酸化水平较高(大于1.56)的患者，主动脉瘤再生长及破裂风险较高，发生率为15％，乳酸化水平较低(小于1.56)的患者，主动脉瘤生长及破裂风险较低，发生率为0％，具有统计学差异(P＜0.05)。因此，本发明通过检测患者血管病变部位乳酸化水平，对动脉瘤再生长及破裂风险的预后评估准确可靠，可作为一种早期筛查再破裂风险检测手段。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。