circFam120a siRNA在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬及先心病产品中的应用

摘要

本发明公开了一种circFam120a siRNA在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬及先心病产品中的应用；本发明circFam120a siRNA能够抑制心肌细胞凋亡和自噬，进而实现先天性心脏病的预防和治疗；此外，CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中具有显著的差异表达，因此，通过检测circFam120a的表达量能够实现对先天性心脏病辅助诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种circFam120a siRNA在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬及先心病产品中的应用。

背景技术

先天性心脏病(Congenital heart disease，CHD)是一种常见且严重的出生缺陷，也是导致新生儿死亡的最常见原因。它发生在大约1％的活产婴儿中，并影响着全球数百万人。先天性心脏病是由出生前心脏结构异常引起的，这种缺陷发生在怀孕期间胎儿在子宫中发育时。尽管心血管医学和心脏外科的进步使大多数先心病患者能够得到及时的治疗，使他们能够成年并活得更长，但随着年龄的增长，这些人面临着更高的晚期并发症风险，如心律失常、心内膜炎、肺动脉高压和心力衰竭。由此看来，CHD是导致新生儿死亡和成人晚期并发症的最重要原因之一，给家庭带来了沉重的负担，极大地降低了生活质量。因此，CHD的早期预防和诊治就显得尤为重要。CHD的发生是由环境因素和遗传因素共同引起的。现有研究已经证明环境因素对遗传级联反应的影响和参与基因调控的基因组机制，包括转录后调控。

甲醛(formaldehyde，FA)是一种存在于环境中的常见污染物，但也通过多种基本生物过程内源性产生，包括线粒体单碳代谢、代谢物氧化和核表观遗传修饰。内源性甲醛代谢紊乱与大量暴露于外源性甲醛可导致多系统疾病，包括心血管、神经、呼吸、免疫、血液和生殖系统疾病。甲醛的胚胎毒性和致畸作用日益受到关注。在器官形成期间暴露于甲醛会引起胎盘结构的毒性变化，从而扰乱胎盘功能并导致胎儿体重减轻。患有先天性心脏病的新生儿出生低体重的风险更大，早产的风险较正常高2-3倍。先前的研究表明，怀孕期间长期接触低水平的甲醛会增加流产和胎儿心脏畸形的风险。怀孕期间接触油漆、染料、胶水和其他室内环境污染物可能是后代患先天性心脏病的危险因素。其他研究发现，怀孕早期流产的妇女血浆甲醛水平明显高于足月分娩的妇女。因此，人体内的高甲醛水平可能是流产的独立危险因素，较高的甲醛水平与较高的流产风险相关。一项流行病学病例对照研究表明，住宅环境中的甲醛暴露会导致先天性心脏畸形的风险增加24％。另一项研究表明，亚急性和亚慢性甲醛吸入可刺激氧化应激，从而导致对心脏细胞和组织的继发性毒性效应。高剂量甲醛还可诱导妊娠小鼠及其子代心肌细胞的氧化应激和凋亡。妇女怀孕的前八周是胚胎心脏发育的关键时期。目前，胎儿先天性心脏病主要是在孕中期通过影像技术进行诊断的，此时胚胎心脏发育已成形。因此，了解CHD发生和发展的分子遗传调控机制，阐明胚胎心脏发育过程中甲醛毒性的潜在影响机制和信号调控通路，将有助于CHD的早期诊断和治疗。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种circFam120a siRNA在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬及先心病产品中的应用，本发明中circFam120a可以通过直接靶向EIF4A2从而促进甲醛诱导的心肌细胞的凋亡与自噬，进而导致先天性心脏病的发生，因此，本发明circFam120asiRNA能够抑制心肌细胞凋亡和自噬，进而实现先天性心脏病的预防和治疗；此外，CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中具有显著的差异表达，因此，通过检测circFam120a的表达量能够实现对先天性心脏病辅助诊断。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种circFam120a siRNA在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬产品中的应用。

优选地，所述circFam120a siRNA通过靶向EIF4A2在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬产品中的应用。

优选地，所述circFam120a siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述产品包括药品和食品。

本发明第二方面提供了一种抑制心肌细胞凋亡和自噬的产品，包括所述circFam120a siRNA和辅料。

优选地，所述辅料包括药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。

本发明第三方面提供了一种circFam120a siRNA在制备治疗和/或预防先天性心脏病的产品中的应用。

优选地，所述circFam120a siRNA通过靶向EIF4A2在制备治疗和/或预防先天性心脏病的产品中的应用。

优选地，所述circFam120a siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述产品包括药品和食品。

本发明第四方面提供了一种治疗和/或预防先天性心脏病的产品，其特征在于，包括所述circFam120a siRNA和辅料。

优选地，所述辅料包括药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。

本发明第五方面提供了一种检测circFam120a的试剂在制备诊断先天性心脏病的产品中的应用。

优选地，所述检测circFam120a的试剂包括识别所述circFam120a的标记物。

优选地，所述标记物为所述circFam120a互补的cDNA的结合引物或结合所述circFam120a的生物大分子；

所述生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RAN结合蛋白和RAN结合蛋白功能片段。

本发明中的先心病为先天性心脏病。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明circFam120a siRNA能够抑制心肌细胞凋亡和自噬，进而实现先天性心脏病的预防和治疗；此外，CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中具有显著的差异表达，因此，通过检测circFam120a的表达量能够实现对先天性心脏病辅助诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中的差异表达研究结果；

图2为甲醛诱导心肌细胞自噬的发生的研究结果；

图3为敲低circFam120a抑制心肌细胞凋亡和自噬的发生的研究结果；

图4为过表达circFam120a促进心肌细胞凋亡和自噬的发生的研究结果；

图5为验证circFam120a与EIF4A2蛋白的直接结合实验结果；

图6为CircFam120a对EIF4A2的靶向调控作用的研究结果；

图7为CircFam120a通过靶向EIF4A2调控甲醛诱导的心肌细胞凋亡与自噬的研究结果；

图8为本发明实施例中动物模型证实体内敲低circFam120a缓解了甲醛诱导的凋亡和自噬的研究结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本发明实施例提供了一种circFam120a siRNA在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬产品中的应用。

进一步地，所述circFam120a siRNA通过靶向EIF4A2在制备抑制心肌细胞凋亡和自噬产品中的应用。

本发明中circFam120a可以通过直接靶向EIF4A2从而促进甲醛诱导的心肌细胞的凋亡与自噬，进而导致先天性心脏病的发生，因此，本发明circFam120asiRNA能够抑制心肌细胞凋亡和自噬，进而实现先天性心脏病的预防和治疗。

在一实施方式中，所述circFam120a siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为CUCACUGAAGGUUGCACAG。此外，还可以在上述序列末尾加TT悬垂，方便小千扰RNA双链进入细胞后解链，同时增加稳定性的作用。

本发明对抑制心肌细胞凋亡和自噬产品的种类不作限制，例如，可以是药品，也可以是食品。

本发明实施例还提供了一种抑制心肌细胞凋亡和自噬的产品，包括所述circFam120a siRNA和辅料。

进一步地，所述辅料包括药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。

本发明另一实施例提供了一种circFam120a siRNA在制备治疗和/或预防先天性心脏病的产品中的应用。

进一步地，所述circFam120a siRNA通过靶向EIF4A2在制备治疗和/或预防先天性心脏病的产品中的应用。

在一实施方式中，所述circFam120a siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明对治疗和/或预防先天性心脏病的产品的种类不作限制，例如，可以是药品，也可以是食品。

本发明另一实施例供了一种治疗和/或预防先天性心脏病的产品，所述产品包括所述circFam120a siRNA和辅料。

进一步地，所述辅料包括药学上可接受的辅料或食品上可接受的辅料。

本发明中，CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中具有显著的差异表达，因此，通过检测circFam120a的表达量能够实现对先天性心脏病辅助诊断。

因此，本发明又一实施例提供了一种检测circFam120a的试剂在制备诊断先天性心脏病的产品中的应用。

在一实施方式中，所述检测circFam120a的试剂包括识别所述circFam120a的标记物。

在一实施方式中，所述标记物为所述circFam120a互补的cDNA的结合引物或结合所述circFam120a的生物大分子；

所述生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RAN结合蛋白和RAN结合蛋白功能片段。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例

本实施例为CircFam120a通过靶向EIF4A2调控甲醛诱导的心肌细胞凋亡与自噬的研究

1、实验方法

1.1CHD患者及健康人血液样本的获取

2020年9月-2022年9月，收集期间在我院心脏超声科就诊被确诊为CHD的患儿血液样本15例，并以15例健康儿童血液样本作为对照。纳入标准：①确诊为CHD且未经任何治疗；②未合并肺功能障碍；③未合并凝血功能障碍；④无肝肾功能异常；⑤无其他基础疾病。排除标准：①合并肺功能障碍；②合并先天性免疫缺陷；③合并凝血功能异常；④合并肝肾功能异常；⑤合并已知遗传性疾病。新鲜血液样本经过离心去除红细胞后均妥善保存在液氮中，待后续使用。所有血液样本的获取均得到患者或其法定监护人知情同意，并自愿签署知情同意书。经青岛大学附属医院伦理委员会批准同意。

1.2动物模型的构建

采用Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250–300g，包含雌性20只(周龄：9周)，雄性10只(周龄：9周)，饲养于青岛大学SPF级动物中心，常规喂养，给予12小时光照和12小时黑暗。将雌性大鼠随机分为四组：对照组(生理盐水)、甲醛诱导组(2.0mg/kg)、AAV9-shNC+甲醛诱导组、AAV9-shcircFam120a+甲醛诱导组。从饲养第2天起，进行甲醛诱导，采用经腹腔注射2.0mg/kg甲醛溶液或生理盐水1次/天。于饲养第7日，夜间将SD大鼠按雌雄比例为2∶1进行合笼，次日晨检查阴栓，以见到阴栓记为怀孕第一天。合笼一周后将雌雄大鼠分离。孕鼠甲醛诱导直至分娩。分娩后，观察大鼠的后代数量，有无死胎。对胎鼠进行超声心动图检查，结束后收集胎鼠心脏组织，分别存放于组织固定液或液氮中保存。后续通过qRT-PCR、WB、IHC、IF、HE染色等实验观察相应指标。所有动物实验均经青岛大学附属医院动物伦理委员会批准。

1.3细胞培养与药物处理

H9C2大鼠心肌细胞购置于上海赛百慷生物公司，采用DMEM高糖培养基，添加10％胎牛血清(FBS)，在37℃含5％ CO

1.4细胞转染

将细胞接种到孔板中，放入培养箱至70％-90％融合度时进行转染；使用无血清DMEM培养基稀释Lipofectamine 3000试剂，充分混匀，静置5分钟；使用无血清DMEM培养基稀释circFam120a的DNA过表达质粒，制备DNA预混液，然后添加P3000试剂，充分混匀；在每管已稀释的试剂中按1：1的比例加入稀释的DNA，充分混匀，静置15分钟；将DNA-脂质体复合物加入至对应孔的细胞中；37℃培养箱中孵育细胞2-4天，然后进行后续分析。

表1转染用人工合成RNA序列见下表

1.5RNA逆转录及实时荧光定量PCR

采用Trizol reagent法提取细胞或组织的RNA，采用诺维赞公司的HiScript IIIRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂进行RNA逆转录。然后采用翌圣公司的qPCRSYBR Green Master Mix试剂进行Qrt-pcr。按照说明书，根据样品数量配制预混液，八联排每孔内加入18μl预混液和2μl cDNA，将待测样品放入Qrt-PCR仪中进行扩增(95℃/30s，退火：30s，延伸：72℃/40s，进行40个循环。反应结束后确认扩增曲线及熔解曲线，并记录Ct值，使用公式2-Ct比较阈值循环(Ct)方法得到基因相对表达量，PCR引物见表2。

表2PCR引物序列

1.6蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)

制胶：采用雅酶PAGE快速凝胶试剂盒，选择合适浓度，按照说明书进行配制。电泳：配制1L1×电泳液加入电泳槽中，于上样孔中加入30ug蛋白样品，左边加入5μl蛋白marker，多余的孔用1×loading补齐，恒压80V，30min，120V，60min进行电泳。转膜：PVDF膜裁剪成8×5cm大小，甲醇激活30s。配制1L1×转膜液(含200ml甲醇)，先预冷。转膜夹放置顺序从上而下依次为：白板(正极)-海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-海绵-滤纸-黑板(负极)，夹紧。将其转移至电转槽中，加入预冷的转膜液，并放入冰盒降温。将仪器置于冰浴中，接好电极，设置转膜条件，0.29A恒流90min进行转膜。封闭：将膜放入5％的脱脂牛奶(TBST配制)中摇床(15r/min)室温封闭1小时，回收牛奶。一抗孵育：1×TBST缓冲液摇床(35r/min)快速洗膜3次，每次10min，然后加入一抗(5％BSA配制)室温摇床(15r/min)孵育2小时或者4℃孵育过夜，回收一抗。二抗孵育：1×TBST缓冲液摇床(35r/min)快速洗膜3次，每次10min，加入二抗(5％BSA配制)室温摇床(15r/min)孵育1小时，回收二抗，1×TBST洗膜3次。显影：将膜放于ECL化学发光液(A液+B液)，室温避光孵育1min，放入显影仪，在化学发光成像系统中曝光并保存图像。图像处理：使用ImageJ软件进行灰度值分析，以β-Actin为内参，用待测蛋白与内参的比值代表待测蛋白的相对表达量。

1.7细胞凋亡测定

(1)TUNEL法：①采用96孔板，将处理好的细胞从培养箱中取出，吸弃旧培养基，用PBS洗涤细胞一次。②用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤一次。③加入含0.3％TritonX-100的PBS，室温孵育5min。④配制TUNEL检测液：每孔用5μl TdT酶加上45μl荧光标记液，配制成50μl检测液。⑤用PBS洗涤细胞2次，加入检测液，均匀覆盖细胞，37℃避光孵育60min。⑥吸弃检测液，PBS洗涤细胞3次，加入DAPI孵育20min，PBS清洗2次。⑦荧光显微镜下进行观察并保存图片。

(2)细胞流式实验：①采用六孔板，将处理好的细胞从培养箱中取出，吸弃旧培养基，预冷PBS洗涤细胞一次，加入适量不含EDTA的胰酶室温消化细胞约1min，吸弃胰酶。②加入1ml培养基将细胞轻轻吹打下来，转移至1.5ml ep管中，1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次后重悬并计数。③取5×104-1×105个重悬的细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入100μl 1×Annexin V结合缓冲液轻轻重悬细胞。④加入5μl Annexin V-APC，轻轻混匀。加入5μl的PI，轻轻混匀。⑤室温避光孵育10-15min。⑥流式细胞仪检测：孵育完成后，加入400μl 1×Annexin V结合缓冲液重悬细胞，于1h内上机检测，Annexin V-APC由633nm激发，检测荧光发射光谱在660nm处。PI由488nm激发，检测发射光谱约在617nm处。

1.8RNA pull-down实验

(1)珠子的制备：①采用链霉亲和素琼脂糖珠，将珠子混匀，准备两个1.5ml离心管，标记为NC组和目标组，每组各吸取40μl珠子，离心(1000g，4℃，5min)，吸弃上清。②每组各加入1ml lysis buffer洗涤珠子，离心(1000g，4℃，5min)，吸弃上清。③每组各加入1mlblocking buffer 4℃旋转1-3h，离心(1000g，4℃，5min)，吸弃上清，每组用lysis buffer各洗三次，离心(1000g，4℃，5min)，吸弃上清，每组各加入40μl lysis buffer。

(2)珠子-探针结合：将NC和目标的生物素探针分别加入到对应的离心管中，4℃旋转孵育2-3h，使珠子与探针充分结合。

(3)探针与目标蛋白结合：将先前制备的蛋白样品取出100μl作为Input,剩余蛋白样品平均加入到NC组和目标组对应的离心管中，4℃旋转孵育过夜。

(4)清洗：次日将样品离心(1000g，4℃，5min)，吸弃上清，每组各用1ml high-saltbuffer清洗珠子-探针-蛋白复合物3次，以去除未结合的蛋白

(5)洗脱：离心(1000g，4℃，5min)后，每组加入36μl low-salt buffer对结合的蛋白进行洗脱，离心后收集蛋白洗脱液。

(6)在蛋白洗脱液液中按1/4体积比加入5×蛋白上样缓冲液，金属浴中95℃变性15min，在PAGE胶中进行电泳分离。后续进行质谱分析或目标蛋白的检测。

1.9RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)

(1)磁珠预处理：准备两个1.5ml离心管，分别标记为IgG组和目标蛋白组。将磁珠充分混悬，每管各取30μl磁珠，置于磁力架上，磁性分离，吸弃磁珠保护液，加入400μl结合/洗涤缓冲液，充分混悬洗涤磁珠,置于磁力架，磁性分离，吸弃上清；重复以上洗涤步骤2次。

(2)抗体与磁珠结合：①抗体预处理：使用结合/洗涤缓冲液将抗体稀释至终浓度为25μg/ml。②抗体-磁珠结合：将稀释好的400μl抗体加入预处理好的磁珠中，充分混悬，置于翻转混合仪孵育(4℃，2h)，磁性分离，收集磁珠，上清液收集于新的EP管中，以备后续使用。③洗涤：加入500μl结合/洗涤缓冲液，充分混悬磁珠，磁性分离，弃上清；重复洗涤4次。

(3)抗原与抗体-磁珠复合物结合：①抗原-抗体-磁珠复合物结合：加入500μl先前准备的蛋白样品，充分混悬，置于翻转混合仪孵育(4℃，8h)，磁性分离，弃上清。②洗涤：使用500μl结合/洗涤缓冲液充分重悬磁珠，磁性分离，弃上清；重复洗涤4次。

(4)蛋白结合RNA提取：①用100μl结合/洗涤缓冲液重悬磁珠，加入30μg蛋白酶K，充分混悬，放入55℃金属浴30min(期间用指尖弹拨离心管)，使蛋白与磁珠分离，磁性分离，收集上清。②取100μl先前制备的蛋白样品作为Input组，用trizol法分别提取Input,IgG和目标组三个组的RNA，方法同细胞RNA提取。其中异丙醇那步需加5μl糖原-20℃过夜，以助于RNA沉淀。

(5)琼脂糖凝胶电泳检测：①将提取的RNA进行普通逆转录，然后进行PCR扩增，扩展产物置于冰上备用，配制体系及反应条件见表6。②琼脂糖凝胶配制：称取0.9g琼脂糖，加入1×TAE中，混匀后微波炉加热至100℃，然后加入5μl核酸染料，配制成1.8％琼脂糖凝胶。③电泳：将配好的胶放在加有1×TAE的电泳槽中，在上样孔内按顺序加入marker和各组扩增产物各5μl，120V，电泳30min。④显影仪中采用紫外光照进行显影并保存图片。

1.10细胞或组织免疫荧光原位杂交实验(fluorescence in situhybridization，FISH)

采用48孔板，放入爬片，按照1×10

1.11LC3自噬双标腺病毒检测自噬

将H9C2细胞接种于共聚焦皿中，细胞培养箱中过夜，待到细胞密度约30-50％时，将LC3自噬双标腺病毒转染进细胞，每个皿中加入10μl稀释后的病毒，放入培养箱12h后去除旧的含病毒的培养基，进行后续操作，处理好后，激光共聚焦显微镜观察。

1.12活性氧(ROS)检测

①装载探针：将DCFH-DA以1∶1000的比例用无血清培养液稀释，使终浓度为10μM/L。采用六孔板，将处理好的细胞从培养箱中取出，吸弃旧培养液，加入1ml稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育30分钟。用无血清DMEM洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。设置阳性对照孔，采用活性氧阳性对照刺激细胞30分钟。②荧光显微镜进行观察并记录。

2、统计学方法

每次实验数据以三次独立重复实验的平均值±标准误(SEM)表示。两两独立组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析one-way ANOVA。统计图的绘制采用GraphPad Prism 8.0软件对所有数据进行分析。P值<0.05认定差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中的差异表达的研究

通过前期构建的甲醛暴露组大鼠模型，以健康组为对照，进行了全转录组测序，从中筛选了几个差异表达最为显著的circRNA。通过构建甲醛诱导的H9C2细胞模型，采用Qrt-PCR验证circRNA的表达趋势，从中筛选出了趋势最为明显的circFam120a。测序结果中，circFam120a在甲醛暴露组中上调。通过在甲醛诱导细胞模型中验证，发现circFam120a在甲醛浓度梯度处理24h的细胞模型中呈逐渐上调趋势，并且在150μM浓度时上调最为显著(P<0.05)(图1中A)。随后，用150μM甲醛溶液时间梯度处理H9C2细胞，采用Qrt-PCR验证circFam120a的表达量，发现随着处理时间的延长，circFam120a的表达量逐渐升高(P<0.05)(图1中B)。又在动物组织中验证了circFam120a的表达量，与测序结果一致，甲醛暴露组中circFam120a表达量升高(P<0.05)(图1中C)。在临床上收集了15例先天性心脏病病人的血液样本，并以15例健康人的血液样本进行对照，检测了circFam120a的表达量，发现在CHD患者血液样本中，circFam120a的表达量显著高于正常人(P<0.05)(图1中D)。另外还采用qRT-PCR检测了circFam120a在成年大鼠和乳鼠各器官组织的表达量，发现其在心脏组织中表达量最为显著(P<0.05)(图1中E)。另外为了排除心脏组织中成纤维细胞的干扰，分别提取了心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)和心肌细胞(cardiomyocyte，CM)的RNA，用qRT-PCR检测了circFam120a的表达量，发现其在心肌细胞中的表达明显高于成纤维细胞(P<0.05)(图1中F)。做了circFam120a在人和大鼠中的保守性分析，通过序列比对，发现circFam120a在人和大鼠中是保守的(图1中G)。采用免疫荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization，FISH)发现circFam120a在H9C2细胞的核质中均有表达(图1中H)。

图1为CircFam120a在甲醛诱导的动物组织、心肌细胞和CHD患者血浆中的差异表达研究结果。图1中，A：qRT-PCR检测甲醛浓度梯度处理的H9C2细胞中circFam120a的表达水平。B：qRT-PCR检测甲醛时间梯度处理的H9C2细胞中circFam120a的表达水平。C：qRT-PCR检测大鼠胎鼠心脏组织中circFam120a的表达水平。D：qRT-PCR检测CHD患者和健康人血液中circFam120a的表达水平(n＝15)。E：qRT-PCR检测成年大鼠和胎鼠皮肤、肌肉、心、脑、肝、肾、结肠中circFam120a的表达水平。F：qRT-PCR检测大鼠心脏成纤维细胞和心肌细胞中circFam120a的表达量。G：人和大鼠中circFam120a的保守性分析。H:FISH检测circFam120a在H9C2细胞中的定位。ns：没有显著性差异；*P<0.05**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

由图1可知，circFam120a在甲醛诱导下会发挥一定的调控作用。

3.2甲醛诱导心肌细胞自噬的发生的研究

采用甲醛浓度梯度处理H9C2细胞24h，发现随着甲醛浓度的升高，细胞数目明显减少(图2中A)。前期的研究已经证明甲醛会引起H9C2细胞凋亡，而凋亡和自噬之间也存在某种窜扰，因此考虑甲醛是否会诱导H9C2细胞自噬的发生。采用WB检测了甲醛处理的H9C2细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和p62的表达，发现随着甲醛浓度的升高，LC3Ⅱ表达水平明显升高而p62表达水平明显下降，证明有自噬的发生(图2中B)。用150μM甲醛处理H9C2细胞，用自噬双标腺病毒检测也显示甲醛处理后自噬水平有所升高(P<0.05)(图2中C)。

图2为甲醛诱导心肌细胞自噬的发生的研究结果。图2中，A：甲醛浓度梯度处理的H9C2细胞，比例尺：200μm。B：自噬相关蛋白在甲醛浓度梯度处理的H9C2细胞中的表达。C：自噬双标腺病毒检测H9C2细胞自噬水平。****P<0.0001。

由图2可知，甲醛能够引起H9C2细胞的自噬。

3.3敲低circFam120a抑制心肌细胞凋亡和自噬的发生

为了验证circFam120a的功能，设计了它的小干扰RNA(序列如SEQ ID NO:1所示)，将小干扰RNA转染进H9C2细胞中对circFam120a进行敲低。采用Qrt-PCR验证circFam120a的敲低效率，发现其表达水平明显降低(P<0.05)(图3中A左)，而敲低circFam120a对其母基因Fam120a的表达水平没有明显的影响(图3中A右)。为了观察甲醛刺激是否会导致细胞的氧化应激，用150μM/L的甲醛溶液刺激细胞24h，检测了细胞中的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平，发现甲醛刺激后细胞内ROS水平升高，而敲低circFam120a后细胞内ROS水平有所降低(图3中B)。随后用WB检测了细胞内凋亡和自噬相关因子的表达水平，发现甲醛刺激后，cleaved caspase3和LC3Ⅱ的表达水平升高，p62的表达水平降低，证明有凋亡和自噬的发生，而敲低circFam120a后则减轻了这一现象，凋亡和自噬水平有所降低(图3中C)。Tunel和流式实验也显示出了同样的结果，甲醛刺激后细胞凋亡水平升高，敲低circFam120a后凋亡有所缓解(图3中D和E)。同时，自噬双标腺病毒检测细胞自噬水平也发现敲低circFam120a后减轻了甲醛刺激引起的细胞自噬现象(图3中F)。

图3为敲低circFam120a抑制心肌细胞凋亡和自噬的发生的研究结果。图3中，A：qRT-PCR检测circFam120a的敲低效率和对Fam120a表达水平的影响。B：检测细胞中ROS的水平。C：WB检测细胞中凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。D：Tunel检测细胞凋亡(Tunel为绿色，DAPI为蓝色)。E：细胞流式实验检测细胞凋亡。F：自噬双标腺病毒检测细胞自噬水平。ns表示没有显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

由图3可知，敲低circFam120a能够减少细胞凋亡和自噬的发生。

3.4过表达circFam120a促进心肌细胞凋亡和自噬的发生的研究

接着又构建了circFam120a的过表达质粒，将其转染进H9C2细胞。采用Qrt-PCR验证circFam120a的过表达效率，发现其表达水平明显升高(P<0.05)(图4中A左)，而过表达circFam120a对其母基因Fam120a的表达水平没有明显的影响(图4中A右)。ROS检测显示过表达circFam120a后使得甲醛刺激引起的细胞内ROS水平进一步升高，说明circFam120a可以加重细胞内氧化应激水平(图4中B)。随后用WB检测了细胞内凋亡和自噬相关因子的表达水平，发现过表达circFam120a后使得甲醛刺激引起的细胞内凋亡和自噬水平进一步增加，表现为cleaved caspase3和LC3Ⅱ的表达水平进一步升高，p62的表达水平进一步降低(图4中C)。Tunel和流式实验也显示出了同样的结果，过表达circFam120a后使得甲醛刺激引起的细胞凋亡现象进一步加重(图4中D和E)。同时，自噬双标腺病毒检测也发现过表达circFam120a后进一步加重了甲醛刺激引起的细胞自噬水平(图4中F)。

图4为过表达circFam120a促进心肌细胞凋亡和自噬的发生的研究结果。图4中，A：qRT-PCR检测转染circFam120a过表达质粒后circFam120a和Fam120a的表达水平。B：检测细胞内ROS水平。C：WB检测细胞内凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。D：Tunel检测细胞内凋亡水平(Tunel为绿色，DAPI为蓝色)。E：流式实验检测细胞凋亡水平。ns表示没有显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

由图4可知，过表达circFam120a可以引起细胞凋亡和自噬的发生。

3.5验证circFam120a与EIF4A2蛋白的直接结合

为了探究circFam120a是否是通过与其直接结合的蛋白而发挥调控作用，构建并使用circFam120a的生物素探针进行了RNA pull-down实验并进行质谱分析(图5中A和B)。结果显示EIF4A2是与circFam120a相结合含量最丰富的蛋白之一。结合生物信息学预测分析以及现有文献对EIF4A2的研究结果，推测EIF4A2为circFam120a的潜在下游靶标。再次通过circFam120a的RNA pull-down实验证实了circFam120a可以与EIF4A2结合(图5中C)。又通过RIP实验反向验证了EIF4A2可以与circFam120a相结合(图5中D)。这表明circFam120a可以直接靶向EIF4A2。通过FISH实验检测circFam120a与EIF4A2的共定位情况，结果显示circFam120a和EIF4A2在H9C2细胞核和质中均有表达(图5中E)。

图5为验证circFam120a与EIF4A2蛋白的直接结合实验结果。图5中，A：RNA pulldown实验，PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色法测定RNA 相关结合蛋白。B：RNA pull-down实验RNA相关结合蛋白质谱分析。C：RNA pull-down实验EIF4A2被circFam120a的生物素探针拉下，WB验证了它们的结合。D：RIP实验反向验证circFam120a与EIF4A2的结合。E：circFam120a和EIF4A2在H9C2细胞中的共定位(circFam120a为红色，EIF4A2为绿色，DAPI为蓝色)，比例尺：10μm。

由图5可知，证实了circFam120a可以与EIF4A2直接结合，并可能通过直接靶向EIF4A2而发挥调控作用。

3.6CircFam120a对EIF4A2的靶向调控作用研究

采用甲醛浓度梯度刺激H9C2细胞，WB实验结果显示甲醛刺激使得EIF4A2的表达水平降低，并且是随着甲醛浓度的升高而逐渐下降的(图6中A)。另外采用150μM/L浓度的甲醛刺激H9C2细胞，按照时间梯度在不同时间点收集样品，WB实验结果显示EIF4A2的表达水平随着甲醛刺激时间的延长而逐渐降低(图6中B)。在生理条件下，使用circFam120a小干扰RNA转染H9C2细胞，WB实验结果显示敲低circFam120a后EIF4A2的表达水平较对照组显著上升(图6中C)；使用circFam120a过表达质粒转染H9C2细胞，WB实验结果显示过表达circFam120a后EIF4A2的表达水平较对照组显著下降(图6中D)。接着在H9C2细胞中分别转染circFam120a的小干扰RNA和过表达质粒，然后用甲醛刺激，在病理条件下，WB检测EIF4A2的表达，同样发现敲低circFam120a可使EIF4A2表达水平升高(图6中E)，过表达circFam120a可使EIF4A2表达水平降低(图6中F)。

图6为CircFam120a对EIF4A2的靶向调控作用的研究结果。图7中，A：甲醛浓度梯度处理H9C2细胞后EIF4A2的表达水平。B：150μM/ml甲醛时间梯度处理H9C2细胞后EIF4A2表达水平。C：生理条件下WB检测敲低circFam120a后EIF4A2的表达水平。D：生理条件下WB检测过表达circFam120a后EIF4A2的表达水平。E：病理条件下WB检测敲低circFam120a后EIF4A2的表达水平。F:病理条件下WB检测过表达circFam120a后EIF4A2的表达水平。ns表示没有显著性差异；*P<0.05；***P<0.001。

由图6可知，circFam120a对EIF4A2具有靶向调控作用。

3.7CircFam120a通过靶向EIF4A2调控甲醛诱导的心肌细胞凋亡与自噬的研究

为了研究circFam120a与EIF4A2的相互调控，构建了EIF4A2的小干扰RNA，将其转染进H9C2细胞对EIF4A2进行敲低，qRT-PCR和WB结果显示EIF4A2的表达水平降低(P<0.05)(图7中A和B)。将circFam120a的小干扰RNA或过表达质粒与EIF4A2的小干扰进行共转染，并用甲醛刺激，采用WB实验检测凋亡和自噬相关蛋白表达水平，结果显示circFam120a敲低部分逆转了EIF4A2敲低所引起的凋亡和自噬，表现为cleaved caspase3,LC3Ⅱ表达水平降低，p62表达水平升高(P<0.05)(图7中C)；CircFam120a的过表达进一步加重了EIF4A2敲低所引起的凋亡和自噬，表现为cleaved caspase3,LC3Ⅱ表达水平升高，p62表达水平降低(P<0.05)(图7中D)。为了进一步验证凋亡的发生，采用Tunel和流式实验检测circFam120a的小干扰RNA或过表达质粒与EIF4A2的小干扰进行共转染后在甲醛刺激下细胞凋亡情况，结果同样显示circFam120a敲低部分逆转了EIF4A2敲低所引起的凋亡(图7中E和G)，circFam120a的过表达进一步加重了EIF4A2敲低所引起的凋亡(图7中F和H)。为了进一步验证自噬的发生，采用自噬双标腺病毒转染H9C2细胞，再用circFam120a的小干扰RNA或过表达质粒与EIF4A2的小干扰进行共转染后在甲醛刺激下检测细胞自噬情况，结果显示circFam120a敲低部分逆转了EIF4A2敲低所引起的自噬(图7中I)，circFam120a的过表达进一步加重了EIF4A2敲低所引起的自噬(图8中J)。

图7为CircFam120a通过靶向EIF4A2调控甲醛诱导的心肌细胞凋亡与自噬的研究结果。图7中，A：qRT-PCR检测EIF4A2的敲低效率。B：WB检测EIF4A2的敲低效率。C和D：WB检测各组自噬和凋亡相关蛋白的表达。E和F:细胞流式实验检测各组凋亡情况。G和H：Tunel检测各组细胞凋亡情况。I和J：自噬双标腺相关病毒检测各组细胞自噬水平。ns表示没有显著性差异；*P<0.05；***P<0.001。

由图7可知，circFam120a能够靶向EIF4A2调控心肌细胞凋亡和自噬。

3.8动物模型证实体内敲低circFam120a缓解了甲醛诱导的凋亡和自噬的研究

前面研究了H9C2细胞在甲醛刺激下circFam120a对EIF4A2的调控作用，为了进一步在动物体内证实上述结果，构建了甲醛诱导疾病组和circFam120a敲低治疗组动物模型，根据前期研究结果，选择0.2mg/kg浓度的甲醛作为病理条件对大鼠进行诱导。构建circFam120a敲低的腺相关病毒对大鼠进行尾静脉注射，以此作为治疗组。对各组新生大鼠进行超声心动图检查，发现受到过甲醛刺激的大鼠其后代会出现心功能异常，表现为EF％和FS％较健康组减低，心率减慢，而经过circFam120a敲低治疗的大鼠后代，其心功能和心率正常(图8中A-D)。取各组新生大鼠心脏，qRT-PCR检测circFam120a表达水平，结果显示甲醛刺激使得circFam120a表达水平升高，而敲低circFam120a后，其表达水平明显降低(图8中E)。苏木素染色(HE)结果显示受到甲醛刺激的大鼠后代会出现心脏结构异常，表现为心肌细胞排列疏松、紊乱，部分可见室间隔处有缺损，而经过circFam120a敲低治疗的大鼠后代心脏结构未见明显异常(图8中F)。为了验证circFam120a对EIF4A2的调控作用，采用WB检测了各组新生大鼠心脏中EIF4A2的表达水平，发现甲醛刺激后EIF4A2表达水平降低，敲低circFam120a后EIF4A2表达水平升高(图8中G)。为了观察各组新生大鼠心脏的凋亡和自噬水平，采用WB检测各组新生大鼠心脏中凋亡和自噬相关蛋白表达水平，发现甲醛诱导使得cleaved caspase3和LC3Ⅱ表达升高，p62表达降低，敲低circFam120a后则逆转了这一现象(图8中G)。

图8为动物模型证实体内敲低circFam120a缓解了甲醛诱导的凋亡和自噬的研究结果。图8中，A-D：各组新生大鼠有代表性的超声心动图。E：Qrt-PCR检测各组大鼠circFam120a的表达水平。F：各组新生大鼠心脏切片的HE染色。G：WB检测各组新生大鼠心脏凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。ns表示没有显著性差异；*P<0.05；***P<0.001。

上述结果与细胞实验结果一致，一定浓度的甲醛会引起心肌细胞凋亡和自噬的发生。CircFam120a的敲低可以部分逆转这一现象。

本发明上述实验足以证明circFam120a siRNA能够抑制心肌细胞凋亡和自噬，进而实现先天性心脏病的预防和治疗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。