血清4型禽腺病毒100K蛋白单克隆抗体10E12-E6-D12-F5的制备及应用

摘要

本发明公开了血清4型禽腺病毒100K蛋白单克隆抗体10E12‑E6‑D12‑F5的制备及应用。本发明提供了分泌FADV4抗体的杂交瘤细胞株10E12‑E6‑D12‑F5，其保藏号为CCTCC NO:C2022101。本发明还提供了由所述杂交瘤细胞株10E12‑E6‑D12‑F5分泌的抗体及其应用。本发明成功研制了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞10E12‑E6‑D12‑F5。其中，10E12‑E6‑D12‑F5这株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，能特异地与I群禽腺病毒所有血清型以及本实验室保存的另外18株FAdV‑4分离株产生阳性反应，具有更广泛的识别谱。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种血清4型禽腺病毒100K蛋白单克隆抗体10E12-E6-D12-F5的制备及应用。

背景技术

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是引起高致病性和高传染性心包积液肝炎综合征的病原，感染的家禽出现急性死亡，病死率为20％-80％。FAdV-4感染能够导致宿主免疫抑制，由此导致的免疫失败、继发感染、混合感染进一步加剧了心包积液肝炎综合征的危害。2015年以前，该病在我国多地零星发现，但自2015年6月起，该病在我国河南、河北、安徽、山东、广东、广西和江苏等多个省份呈暴发式流行。

据报道，2015年后我国流行的FAdV-4毒株毒力显著增强，被定义为新型的FAdV-4，遗传进化分析其与国外的FAdV-4毒株(包括非致病株ON1和KR5，致病株MX-SHP95)不在同一分支，其基因组的右端均出现1 966bp的缺失(包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失)，主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸位点存在多处突变(与毒株毒力相关)，但100K基因的遗传变异情况没有相关的分析报道。

目前对于FAdV-4单克隆抗体的研究，均以penton、Fiber 2和Hexon这三个主要的结构蛋白为免疫原研制的。王萍等(2018)以FAdV-4全病毒免疫小鼠后，以Fiber-2原核表达产物为筛选抗原研发Fiber-2单克隆抗体，该单克隆抗体与FAdV-4反应为阳性，FAdV-8为阴性，其它血清型的FAdV的反应性未确定。刘娜等(2018)用Fiber-2和Hexon蛋白筛选单克隆抗体并研制胶体金试纸，该单克隆抗体与FAdV-4反应为阳性，其它血清型的FAdV的反应性未确定。侯力丹等(2022)将penton基因的原核表达蛋白为抗原免疫小鼠，筛选制备了penton单克隆抗体，该单克隆抗体可识别I群禽腺病毒的所有血清型代表毒株。

100K蛋白是FAdV-4的非结构蛋白，在病毒感染后期大量表达，能促进Hexon蛋白正确折叠，在病毒的感染和复制过程中发挥重要作用。以100K重组蛋白或单克隆抗体建立的血清学检测方法，可区分FAdV-4病毒感染和灭活苗免疫产生的抗体，对于FAdV-4的净化有技术支撑作用。目前还未见100K蛋白单克隆抗体的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供血清4型禽腺病毒100K蛋白单克隆抗体10E12-E6-D12-F5的制备及应用。

第一方面，本发明提供了分泌FADV4抗体的杂交瘤细胞株10E12-E6-D12-F5，其保藏号为CCTCC NO:C2022101。

第二方面，本发明提供了由第一方面所述杂交瘤细胞株10E12-E6-D12-F5分泌的抗体。

上文所述抗体为单克隆抗体。

第三方面，本发明提供了第二方面所述抗体在如下任一种的应用：

1)制备检测或辅助检测禽腺病毒产品；

2)制备检测或辅助检测待测样本是否含有禽腺病毒的产品；

3)制备结合FAdV4-100K蛋白的产品；

4)制备结合禽腺病毒的产品。

上文所述应用中，所述禽腺病毒为血清1-11型禽腺病毒中至少一种或血清4型禽腺病毒的分离株。

上述产品为间接免疫荧光试验试剂盒或Western blot检测试剂盒。

上述应用中的检测或结合，可以通过ELISA检测、间接免疫荧光试验或Westernblot检测实现。

第四方面，本发明提供了一种试剂盒，包括第二方面所述的抗体。

上文所述试剂盒为如下1)至2)中的任意一种：

1)包括二方面所述的抗体和荧光基团标记所述抗体的抗体(如FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体)的试剂盒；在本发明的实施例中用于间接免疫荧光试验；

2)包括二方面所述的抗体和酶标记所述抗体的抗体(如HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体)的试剂盒。在本发明的实施例中用于Western blot检测。

上文所述试剂盒具有如下任一功能：

1)检测或辅助检测禽腺病毒；

2)检测或辅助检测待测样本是否含有禽腺病毒；

3)结合FAdV4-100K蛋白；

4)结合禽腺病毒。

第五方面，本发明提供了第四方面所述试剂盒，或，第二方面所述抗体和荧光基团标记所述抗体的抗体，或第二方面所述和酶标记所述抗体的抗体，在如下任一种的应用：

1)制备检测或辅助检测禽腺病毒产品；

2)制备检测或辅助检测待测样本是否含有禽腺病毒的产品；

3)制备结合FAdV4-100K蛋白的产品；

4)制备结合禽腺病毒的产品。

上文中，所述禽腺病毒为血清1-11型禽腺病毒中至少一种或血清4型禽腺病毒的分离株。

上文中，血清4型禽腺病毒为FAdV-4CACC AV211和2015年以后的分离株，具体为GX2017-001、GX2017-002、GX2017-003、-GX2017-004、GX2018-005、GX2018-006、GX2017-007、GX2018-008、GX2019-009、GX2019-010、GX2019-011、GX2019-012、GX2019-013、GX2019-014、GX2019-015、GX2019-016、GX2019-017、GX2019-018和GX2020-019。

本发明的实验证明，以GX2019-010的100K重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，经过ELISA筛选，成功研制了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5。其中，10E12-E6-D12-F5这株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，能特异地与I群禽腺病毒所有血清型(FADV-1、FADV-2、FADV-3、FAdV-4CACC AV211、FADV-5、FADV-6、FADV-7、FADV-8a、FADV-8b、FADV-9、FADV-10、FADV-11和GX2019-010)以及本实验室保存的另外18株FAdV-4分离株产生阳性反应，具有更广泛的识别谱。制备的100K重组蛋白单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，为FAdV-4抗原和抗体检测试剂的研发奠定了基础。

附图说明

图1为FADV4-100K单克隆抗体的IFA试验结果。

图2为FADV4-100K单克隆抗体的Western blot试验结果。

菌种名称：杂交瘤细胞株

菌株编号：10E12-E6-D12-F5-E6-D12-F5

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国.武汉.武汉大学

保藏日期：2022年8月25日

保藏中心登记入册编号：CCTCC No：C2022101

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

部分实施例所用材料如下：

FAdV-4CACC AV211于2009年购自中国兽医药品监察所，网站地址为http://cvcc.ivdc.org.cn/，公众可以直接在网上进行菌种订购。

FAdV-4广西分离株(GX2019-010)100K重组蛋白(FADV4-100K蛋白)(以下也记作FADV4-100K蛋白，氨基酸序列为序列1)；

FAdV-4 19个毒株信息如下：

GX2017-01、GX2017-02、GX2017-03、GX2017-04、GX2017-05、GX2017-06、GX2018-07、GX2018-08、GX2019-09记载于如下非专利文献中：“Rashid F,Xie Z,Zhang L,etal.Genetic characterization of fowl aviadenovirus 4isolates from Guangxi,China,during 2017–2019[J].Poultry Science,，2020,99(9):4166-4173.”；

GX2019-010、GX2019-011、GX2019-012、GX2019-013、GX2019-014、GX2019-015、GX2019-016记载于如下非专利文献中：“栾勇娇.血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究[D].广西大学,2021.”，为广西壮族自治群兽医研究所兽医生物技术室保存。

GX2019-017、GX2019-018和GX2019-019的信息见表1，为广西壮族自治群兽医研究所兽医生物技术室保存。

LMH细胞和骨髓瘤SP2/0细胞记载于如下非专利文献中：韦悠,谢芝勋,邓显文,李小凤,谢志勤,范晴,张艳芳,黄娇玲,王盛.血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备[J].南方农业学报,2022,53(08):2341-2349.，为广西壮族自治群兽医研究所兽医生物技术室保存。

血清1～11型禽腺病毒(FADV-1～FADV-11)、禽呼肠孤病毒(ARV)均购于中国兽医药品监察所。网站地址为http://cvcc.ivdc.org.cn/，公众可以直接在网上进行菌种订购。

新城疫病毒(NDV)记载于如下非专利文献中：“曾婷婷,谢芝勋,华俊,谢丽基,李孟,黄娇玲,张民秀,张艳芳,苑亚东,撒薇.2株广西鹅源基因XII型新城疫病毒的病原学分析[J].南方农业学报,2022,53(07):2007-2014.”，为广西壮族自治群兽医研究所兽医生物技术室保存。

减蛋综合症病毒(EDSV)记载于如下非专利文献中：“谢芝勋,谢志勤,刘加波,庞耀珊,唐旭平,梁少锋,兰烦顺.产蛋下降综合征的血清学调查[J].中国家禽,1994(01):28-29.”，为广西壮族自治群兽医研究所兽医生物技术室保存。

传染性支气管炎病毒(IBV)记载于如下非专利文献中：“谢志勤,谢芝勋,吕华刚.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报,2008,21(06):1733-1736.”，为广西壮族自治群兽医研究所兽医生物技术室保存。

SPF级雌性BALB/c小鼠购自广西医科大学实验动物中心；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、灭活剂β-丙内醋、HAT选择培养基、HT培养基、PEG融合试剂和鼠源MAb亚类鉴定试剂盒均购自Sigma公司；DMEM培养基购自Hycon公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；BW-V1160Vira TrapTM Adenovirus Purification Miniprep Kit购自Biomiga公司；96孔酶标板、BSA及四甲基联苯胺(TMB)、HRP和FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自深圳晶美生物工程有限公司。

表1为GX2019-017、GX2019-018和GX2019-019的信息

实施例1、FAdV-4单克隆抗体的制备及鉴定

一、FAdV-4单克隆抗体的制备

1、FAdV-4广西分离株的培养及纯化浓缩

使用SPF鸡胚肝细胞培养GX2019-010，收获细胞培养液，参照BW-V1160 ViraTrapTM Adenovirus Purification Miniprep Kit试剂盒说明书，对GX2019-010病毒进行纯化浓缩。

2、杂交瘤细胞的获得

1)、动物免疫及细胞融合

将FADV4-100K蛋白(氨基酸序列为序列1)用PBS稀释为120ug/ml，按1：1的比例与弗氏完全佐剂等体积乳化后作为免疫抗原，多点皮下注射免疫6-8周雌性BALB/c小白鼠(1ml/只)。免疫后21d和35d，使用弗氏不完全佐剂乳化FADV4-100K蛋白进行加强免疫。首免49d后采血测抗体效价，选出抗体效价最高的BALB/c小白鼠，在细胞融合前3d用FADV4-100K蛋白做加强免疫。无菌取免疫小鼠脾脏放入细胞筛，做成脾细胞悬液，计算细胞数，按5：1的比例将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合试验。

2)、杂交瘤细胞筛选

用含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的HAT培养基培养融合细胞，在融合后9d、12d、15d收集细胞培养上清液。使用FADV4-100K-ELISA(FADV4-100K蛋白作为抗原建立的ELISA方法)，对融合细胞上清液进行检测。将ELISA检测为阳性的细胞孔，用有限稀释法连续进行3次单细胞亚克隆。亚克隆的细胞培养10d后，收集细胞培养上清液进行FADV4-100K-ELISA检测。对筛选出的阳性孔融合细胞上清液，进一步以FADV4-ELISA(以GX2019-010病毒作为抗原建立的ELISA检测方法)进行检测筛选。

选取生长状态稳定、分泌抗体效价高且效价稳定的细胞株进保存。

用FAdV4-100K-ELISA对第9d、12d、15d融合细胞上清液进行检测筛选，获得172株阳性杂交瘤细胞。用FAdV4-ELISA检测方法，对172株阳性杂交瘤细胞上清液进一步进行检测，得到39个OD值较高的阳性杂交瘤细胞，经过3次亚克隆化和筛选，共获得1株阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5。

杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5已于2022年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:C2022101。

3)细胞冻存和复苏

用冻存液将上述筛选出的杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5制成10

3、FADV4-100K单克隆抗体的制备与纯化

1)培养上清液获得单克隆抗体

将上述2的3)冻存不同时间后的杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5置于细胞培养基(采用Gibco品牌DMEM/F12培养基，含10％胎牛血清)中，37℃培养5天，400g离心10时间，收集上清液，记作来自上清液的FADV4-100K单克隆抗体。

2)腹水制备抗体

将上述2的3)冻存后的杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5在DMEM/F12培养基(含10％胎牛血清，Gibco品牌)中进行培养，37℃培养72h～96h，直至密度约70％。用胰酶EDTA溶液消化细胞，用PBS溶液悬浮成细胞悬液，并进行计数。

经腹腔注射8周龄BALB/c小白鼠1mL灭菌注射级白油，7～14d后腹腔注射2×10

二、单克隆抗体生物学特性分析

1、抗体分泌稳定性的分析：

将上述一的3的1)获得的液氮中冻存3个月、6个月后的阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自上清液的FADV4-100K单克隆抗体进行如下实验：

参照武小倩建立的FAdV4-100K-ELISA检测方法，用FADV4-100K蛋白(6微克/毫升)进行包被，过夜；洗涤3次后加入不同稀释度的来自上清液的FADV4-100K单克隆抗体，37℃作用1h；洗涤3次后按1：3000加入山羊抗鼠的酶标二抗(HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体)，37℃作用1h；洗涤3次，用TMB显色液显色，读取OD450值，测定阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌抗体的能力。

结果显示，杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5冻存3、6个月后复苏传代，经FAdV4-100K-ELISA检测杂交瘤细胞株培养上清液，来自上清液的FADV4-100K单克隆抗体的ELISA效价均大于2

2、腹水抗体效价检测

采用同样的方法检测上述一的3的2)液氮中冻存3个月后的阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自腹水的FADV4-100K单克隆抗体的效价。

腹水抗体效价检测结果显示，杂交瘤细胞均能诱导小鼠产生高效价抗体，来自腹水的单克隆抗体的FADV4-100K的效价达到2

3、单克隆抗体亚类鉴定

收集上述一的3的1)获得的液氮中冻存3个月后阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自上清液的FADV4-100K单克隆抗体，按照鼠源MAb亚类鉴定试剂盒说明书的操作步骤，进行亚类鉴定。

来自上清液的单克隆抗体亚类的鉴定结果如表2所示，10E12-E6-D12-F5(保藏号：CCTCC NO:C2022101)杂交瘤细胞分泌的FADV4-100K单克隆抗体重链为IgG1亚类，轻链为K链。

表2为单克隆抗体亚类ELISA鉴定结果

4、单克隆抗体特异性检测

将禽腺病毒其它血清型毒株(FADV-1～FADV-11)、NDV、ARV、EDSV和IBV等病毒作为包被抗原，上述一的3的2)获得的液氮中冻存3个月后阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自腹水的FADV4-100K单克隆抗体为一抗，进行ELISA检测；具体如下：

用GX2019-010、FAdV-4CACC AV211毒株及其它血清型FADV及NDV、ARV、EDSV、IBV全病毒进行包被，过夜；洗涤3次后加入不同稀释度的来自腹水的FADV4-100K单克隆抗体，37℃作用1h；洗涤3次后按1：3000加入山羊抗鼠的酶标二抗，37℃作用1h；洗涤3次，用TMB显色液显色，读取OD450值，评价来自腹水的FADV4-100K单克隆抗体的特异性。

结果如表3所示，10E12-E6-D12-F5杂交瘤细胞分泌的来自腹水的FADV4-100K单克隆抗体，能与所有血清型的FADV毒株产生良好反应，与其它病毒NDV、ARV、EDSV、IBV无交叉反应，说明阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的抗体具有良好的特异性。

表3为单克隆抗体的特异性检测

以18株FADV-4分离株(不同时间不同养殖场分离的病毒)作为包被抗原，上述一的3的2)获得的液氮中冻冻存3个月后阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自腹水FADV4-100K单克隆抗体为一抗，进行ELISA检测，37℃作用1h；洗涤3次后按1：3000加入山羊抗鼠的酶标二抗(HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体)，37℃作用1h；洗涤3次，用TMB显色液显色，读取OD450值，评价来自腹水的FADV4-100K单克隆抗体的广谱性。

结果如表4所示，10E12-E6-D12-F5杂交瘤细胞分泌腹水的FADV4-100K单克隆抗体，与18株FADV-4分离株产生良好反应，说明阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与FADV-4分离株的反应具有较好的广谱性。

表4为单克隆抗体的对18株FADV-4分离株的检测结果

实施例2、FADV4-100K单克隆抗体的应用

一、FADV4-100K单克隆抗体用于间接免疫荧光试验(IFA)检测FAdV-4病毒

实验组：将SPF鸡胚肝细胞在12孔细胞培养板培养至90％，接种GX2019-010，感染1.5h，用PBS冲洗2次，用含2.5％牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48h，吸弃培养液，用冰预冷甲醇固定细胞，以实施例1获得的液氮中冻存3个月后阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自于腹水的FADV4-100K单克隆抗体作为一抗，37℃温育1h，以FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗。同时设立阴性对照组，37℃温育1h，洗涤3次，晾干，荧光显微镜下观察和拍照结果。

阴性对照组为SPF鸡胚肝细胞不接种GX2019-010，直接用实施例1获得的来自于腹水的FADV4-100K单克隆抗体进行IFA试验。

荧光显微镜下观察，结果如图1所示，上图为实验组，下图为阴性对照组，GX2019-010感染的细胞中有明亮的绿色荧光，阴性对照细胞中未见绿色荧光，表明，FADV4-100K单克隆抗体能够作为抗体实现间接免疫荧光试验(IFA)检测FAdV-4。

另，以FAdV-4CACC AV211毒株(购自中国兽医药品检察所)开展相同试验，结果10E12-E6-D12-F5的检测为阳性。

二、FADV4-100K单克隆抗体用于Western blot鉴定检测FAdV-4病毒

实验组：用0.5MOI的GX2019-010感染LMH细胞，感染48h后收取细胞蛋白，经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，用5％脱脂奶封闭2h，PBST洗涤3次后加入实施例1获得的液氮中冻存3个月后阳性杂交瘤细胞10E12-E6-D12-F5分泌的来自于腹水的FADV4-100K单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体)，室温作用1h，PBST洗涤3次后显影曝光。以未加入GX2019-010为对照组。

结果如图2所示，+为GX2019-010感染实验组，-为未加入GX2019-010对照组；10E12-E6-D12-F5的FADV4-100K单克隆抗体能特异性检测到GX2019-010毒株中的FADV-4，具有良好Western blot反应原性。

另，以FAdV-4CACC AV211毒株开展相同试验，10E12-E6-D12-F5的检测为阳性。