血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

摘要

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体,为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化,截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段,PCR扩增其基因序列,连接至pET-32a(+)构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化,并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选阳性细胞株,再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法(IFA)对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统,获得大小约为67 kD的Fiber-2截短蛋白,以包涵体的形式出现,经纯化后可获得单一的特异性条带,经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(2C2、4F6、5A5、6G10和10B5),其抗体分泌稳定性、特异性好,诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400,腹水抗体效价为1:320000~1:1280000,秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型,轻链为Kappa链;5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型,轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系(LMH)进行IFA检测,结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性,可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。