公开/公告号CN116635424A
专利类型发明专利
公开/公告日2023-08-22
原文格式PDF
申请/专利权人 纳维格蛋白质有限公司;
申请/专利号CN202180061168.1
申请日2021-07-15
分类号C07K16/32(2006.01);
代理机构北京康信知识产权代理有限责任公司 11240;
代理人杜升
地址 德国哈雷
入库时间 2024-01-17 01:23:17
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-09-08
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K16/32 专利申请号:2021800611681 申请日:20210715
实质审查的生效
2023-08-22
公开
国际专利申请公布
技术领域
本发明涉及基于泛素骨架的对膜结合受体酪氨酸激酶(Her2)具有高度特异性的新型血清稳定的非免疫球蛋白结合蛋白。本发明提供了在用于Her2过表达的癌症的诊断或疗法的医学应用，具体地放射性药物应用中使用的具有高血清稳定性且本质上组合了高温稳定性和对于Her2的高亲和性的新型特异性重组Her2结合蛋白。
背景技术
膜结合的受体酪氨酸激酶Her2的增加的表达在多种乳腺癌，以及卵巢癌、胃癌和子宫癌，特别是对于癌症侵袭形式的发生和发展中起到重要作用。对于恶性肿瘤，主要在上皮细胞来源的恶性肿瘤中报道了这种致癌基因的过表达，并且其与癌症复发和不良预后有关。3种结构域蛋白(胞外、跨膜、胞内酪氨酸激酶结构域)介导细胞增殖并且抑制细胞凋亡。Her2形成二聚体，由此Her2的胞内域被激活，其介导细胞过程，如增殖、分化、迁移或细胞凋亡。因此，调节Her2的功能是开发癌症治疗剂，具体地基于结合至Her2胞外域的单克隆抗体的那些治疗剂的重要方法。治疗性抗Her2单克隆抗体，如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗对于癌症，具体地乳腺癌的治疗是可获得的。
本发明的潜在技术问题
抗体已知的缺点是复杂的分子结构，大尺寸和困难的生产方法。这些分子的大尺寸限制了具有复杂、致密组织结构的肿瘤的渗透。另外，用现用的Her2结合分子对疾病的治疗并不是在所有患者中有效，并且可能具有严重的副作用。因此，使用这些抗体的治疗仅在将肿瘤诊断为Her2阳性肿瘤后才是可能的。对通过活组织检查获得的材料的测试是变化且不准确的。
更不必说对于发现可以在诊断和疗法两者(治疗诊断学)中使用并且克服现用分子的缺点的新型试剂存在强烈医学需要。
因此，本发明的目标是提供基于泛素骨架的新型Her2结合非免疫球蛋白分子，用于Her2过表达的癌症的治疗和诊断中的新型且改善的策略，具体地用于放射性药物应用。目标是为特定肿瘤适应症提供可以在诊断和疗法两者中使用的特异性重组结合蛋白。具体地，目标是提供对Her2具有高亲和性和特异性，以及在血清和高温下的高结构稳定性的新型结合蛋白。
在本发明中，通过如本文公开的血清稳定的Her2结合蛋白(也称为
本发明提供了用于Her2相关癌症的新型且改善的治疗诊断学策略的新型优化的Her2结合分子。
通过所包括的权利要求的主题实现了上述目标和优势。本发明通过提供Her2结合蛋白的实例满足了以上所提出的需求。以上概述不必然描述通过本发明所解决的所有问题。
发明内容
本发明公开提供了下列项目[1]至[14]，但不具体受限于此：
1.一种人Her2的结合蛋白，包含具有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的组，优选地选自SEQ ID NO：1-14的组的任一种具有至少97％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列，其中在血清中温育至少24h后，与在血清中温育前的结合亲和性相比，该人Her2的结合蛋白对Her2的结合亲和性(KD)损失不超过3倍，可选地其中在血清中温育至少24h后，该人Her2的结合蛋白具有至少85％的对Her2最大结合(Bmax)，并且优选地其中该人Her2的结合蛋白在至少64℃的温度下稳定。优选地，该人Her2的结合蛋白包含与SEQ ID NO：1具有至少97％同一性的氨基酸序列，其中在血清中温育24h后，如通过ELISA确定的，Her2结合蛋白对Her2的结合亲和性小于0.5nM。
2.根据项目1所述的人Her2的结合蛋白，其中所述结合蛋白在至少64℃的温度下是稳定的，优选地在64℃至70℃的范围内是稳定的，优选地与项目1和2中所述的特征组合。
3.根据项目1-2所述的人Her2的结合蛋白，包含选自SEQ ID NO：1-14中任一种的氨基酸序列。
4.一种融合蛋白，包含根据以上项目中任一项所述的人Her2的结合蛋白。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含另外至少一种调节药代动力学的分子，其可选地选自血清白蛋白、白蛋白结合蛋白、免疫球蛋白结合蛋白或者免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖、包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的非结构化的氨基酸序列或者聚乙二醇。
6.根据项目4-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含另外至少一种诊断活性部分，其可选地选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料或酶或者以上的任意组合。
7.根据项目4-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含另外至少一种治疗活性部分，其可选地选自单克隆抗体或其片段、结合蛋白、受体或受体结构域、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶或其衍生物或者上述的任意组合。
8.根据项目1-3所述的人Her2的结合蛋白或者根据项目4-7所述的融合蛋白，用于在诊断或药物，优选地用于癌症的诊断或治疗。
9.一种核酸分子，编码如项目1至8中任一项限定的人Her2的结合蛋白。
10.一种载体，包含根据权利要求9所述的核酸分子。
11.一种宿主细胞或非人宿主，包含如项目1至3中任一项限定的人Her2的结合蛋白、权利要求9限定的核酸和/或权利要求10的载体。
12.一种组合物，包含如项目1至3中任一项限定的人Her2的结合蛋白；权利要求9限定的核酸分子；权利要求10限定的载体；和/或权利要求11限定的宿主细胞。
13.一种用于生产项目1至3中任一项所述的人Her2的结合蛋白的方法，包括在适合的条件下培养权利要求11所述的宿主细胞以获得所述Her2结合蛋白和可选地分离所述人Her2的结合蛋白。
本发明内容不必需描述本发明的所有特性。通过审阅以下具体实施方式，其它实施方式将是显而易见的。
附图说明
附图显示：
图1显示在血清中具有高稳定性的Her2结合
图2-7显示了Her2结合蛋白在血清中的稳定性。经由如实施例6中所述的ELISA确定血清稳定性。
图2显示了Affilin-206479(SEQ ID NO：2)的血清稳定性。
图3显示了Affilin-206499(SEQ ID NO：13)的血清稳定性。
图4显示了Affilin-206494(SEQ ID NO：4)的血清稳定性。
图5显示了Affilin-206495(SEQ ID NO：10)的血清稳定性。
图6显示了Affilin-206486(SEQ ID NO：5)的血清稳定性。
图7显示了Affilin-206497(SEQ ID NO：14)的血清稳定性。
图8显示了Affilin-206478(SEQ ID NO：1)的血清稳定性。
图9显示了融合蛋白Affilin-206479的血清稳定性，其在图9A中融合至鼠IgG
图10以每克肿瘤组织的注射剂量百分比显示了七天内Affilin-206479的吸收。与泛素二聚体对照(SEQ ID NO：16)相比，以未修饰形式和与鼠IgG
具体实施方式
本发明人已发展了扩大通过提供新型Her2结合蛋白来诊断和治疗癌症的医学选择的解决方案以符合本领域中强烈且不断发展的需求。如本文所定义的Her2特异性蛋白在功能上的特征在于对Her2的高特异性亲和性。具体地，本发明提供了基于泛素突变蛋白(也称为
在以下更详细地描述本发明之前，应理解本发明不局限于本文描述的具体方法、规程和试剂，并且这些是可以变化的。还应理解本文所使用的术语仅出于描述具体方面和实施方式的目的，并且不意欲限制将由所附权利要求反映的本发明的范围。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。这包括在蛋白质工程和纯化领域中工作的技术人员，而且还包括在开发用于技术应用以及疗法和诊断的新型靶标特异性结合分子领域中工作的技术人员。
优选地，如A multilingual glossary of biotechnological terms:(lUPACRecommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Kolbl,H.eds.(1995),HelveticaChimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland中描述的，定义了本文所使用的术语。
在整个说明书和所附权利要求中，除非上下文另外要求，否则单词“包含(comprise)”和变化形式如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”将被理解为表示对所指明的整数或步骤或者整数或步骤的组的包含，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。术语“包含(comprise(s))”或“包含(comprising)”可以涵盖对“组成”或“由……组成”的限制，这种限制应出于任何原因和在任何程度上是必需的。
可以在整个本说明书中引用一些文档(例如：专利、专利申请、科技出版物、生产商的说明书、说明书、GenBank登录号序列提交等)。在本文中任何事物均不应被视为承认本发明因在先发明而无权先于这种发明公开。本文引用的一些文档可以被称为“作为参考并入”。如果这些并入的参考文献的定义或教导内容与在本说明书中所列举的定义或教导内容矛盾，则以本发明的文本为准。
在所附序列表中公开了本文所提及的所有序列，序列表以其整个内容和公开内容构成了本说明书的公开内容的一部分。
一般定义
术语“Her2”是指人表皮生长因子受体2；同义名称为ErbB-2、Neu、CD340或p185)。通过NCBI登录号NP_004439表示人Her2；通过uniprot登录号p04626表示Her2的胞外域(残基1-652)。术语“Her2”包括对NP_004439显示出至少70％、80％、85％、90％、95％、96％或97％或以上或者100％的序列同一性并且具有Her2的功能性的所有多肽。
术语“Her2结合蛋白”或“人Her2的结合蛋白”可以在本文中可互换地使用并且表示与Her2具有亲和性结合的蛋白。
术语“蛋白”和“多肽”表示通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何的链，并且不表示产物的具体长度。因此，用于表示两个或更多个氨基酸的链的肽、蛋白、氨基酸链或任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且术语多肽可以代替任何这些术语或与任何这些术语可互换地使用。术语多肽还旨在表示多肽翻译后修饰的产物，其在本领域中是熟知的。术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指亲代多肽序列中特定位置处的参考氨基酸被另一种氨基酸的取代、缺失或插入。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可以容易地构建编码氨基酸变体的DNA。术语“Affilin”或
术语“替换”应被理解为氨基酸被另一种氨基酸更换。
术语结合“亲和性”和“结合活性”可以在本文中可互换地使用，并且它们表示多肽结合至另一种蛋白、肽或其片段或结构域的能力。通常通过平衡解离常数(K
通过B
术语“融合蛋白”涉及包含基因连接至至少第二蛋白的至少第一蛋白的蛋白。通过连接最初编码单独的蛋白的两个或更多个基因产生融合蛋白。融合蛋白还可以包含不参与靶标结合的其它结构域，如(但不限于)，例如，多聚化部分、多肽标签、多肽接头或者结合至不同于Her2的靶标的部分。
术语“氨基酸序列同一性”是指两种或更多种蛋白的氨基酸序列的同一性(或差异)的定量比较。将相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对并且如有必要，引入缺口以实现最大序列同一性百分比后，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的序列中的氨基酸残基的百分比。为了确定序列同一性，将查询蛋白序列与参考蛋白或多肽序列进行比对。序列比对方法在本领域中是熟知的。例如，对于确定任意多肽相对于SIM的氨基酸序列的氨基酸序列同一性程度，优选地使用如本领域中已知的局部相似性程序。对于多重比对分析，优选地使用Clustal Omega，如本领域技术人员已知的。
本发明实施方式的详细描述
现将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同实施方式。除非明确相反指明，否则以下定义的每个实施方式可以与任何其它实施方式组合。具体地，指明为优选的或有利的任何特征可以与指明为优选或有利的任何其它一种或多种特征组合。
结构特征：
本发明所述的Her2结合蛋白包含152个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTTENVKAKIQDKEGIPPDQQTLAFV GKQLEDGRTLSDYNIQKESTLWLYLTX
在一个实施方式中，Her2结合蛋白包含与选自SEQ ID NO：1(Affilin-206478)、SEQ ID NO：2(Affilin-206479)、SEQ ID NO：3(Affilin-206480)、SEQ ID NO：4(Affilin-206494)、SEQ ID NO：5(Affilin-206486)或者SEQ ID NO：6(Affilin-206482)的组的任一项具有至少97％的氨基酸序列同一性或者至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。在一个实施方式中，Her2结合蛋白包含与SEQ ID NO：1(Affilin-206478)具有至少97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。在一个实施方式中，Her2结合蛋白包含与SEQ ID NO：2(Affilin-206479)具有至少97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Her2结合蛋白包含如SEQ ID NO：1-14中所示的任何氨基酸序列的氨基酸序列。本发明出乎意料地显示本发明的Her2结合蛋白维持了SEQ ID NO：16(二泛素)的野生型位置L73、R74、K82、Q138或S141的2、3、4或5个氨基酸残基。
在一些实施方式中，稳定的Her2结合蛋白的实例包含选自如图1所示的SEQ IDNO：1-14中任一个的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：1-14中的任一个具有至少97％的同一性的氨基酸序列或者由其组成。在一些实施方式中，稳定的Her2结合蛋白的实例包含选自如图1所示，SEQ ID NO：1-14中任一个的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：1-14中的任一个具有至少98％的同一性的氨基酸序列或者由其组成。在多个实施方式中，Her2结合蛋白包含选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的任一个具有至少97％的同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。在多个实施方式中，Her2结合蛋白包含选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的任一个具有至少98％的同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，Her2的结合蛋白与SEQ ID NO：1-14的氨基酸序列中的任一个具有至少97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，Her2的结合蛋白与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少97％、98％、99％或100％的序列同一性。在本文描述的多种其它实施方式中，对于至少97％的序列同一性，所述序列同一性可以优选地为与各自参考序列至少97％、98％、99％或100％的同一性中的任一种。
在一些实施方式中，如本文公开的稳定的Her2结合蛋白可以与双泛素(SEQ IDNO：16)的氨基酸序列具有至少90.5％的同一性的任何氨基酸同一性。
功能鉴定。
本发明所述的Her2结合蛋白在功能上的特征在于即使在血清中的高稳定性。即使在血清中长期温育后，与在血清中温育前的结合亲和性相比，结合蛋白对Her2不具有超过三倍或两倍的结合亲和性损失(参见实施例)。优选地，即使在血清中长期温育后，与在血清中温育前的结合亲和性相比，所述结合蛋白对Her2具有至少85％的最大结合(表示为B
(i)与在血清中温育前的结合亲和性相比，在血清中温育至少24h后对Her2的结合亲和性(K
(ii)在血清中温育至少24h后，对Her2具有至少85％的最大结合(B
(iii)在血清中温育24h后，对Her2的结合亲和性小于0.5nM，如通过ELISA所确定的，且
(iv)在至少64℃的温度下是稳定的。
在一些实施方式中，如本文描述的Her2结合蛋白结合至细胞上表达的Her2和/或即使在血清中，例如，在小鼠血清中温育24h，对Her2具有5nM或以下，优选地0.1-2nM，优选地小于0.5nM的结合亲和性。
在一些实施方式中，如本文描述的Her2结合蛋白对Her2具有小于5nM的结合亲和性(K
在一些实施方式中，如本文描述的Her2结合蛋白在高温下，在高于64℃，优选地高于65℃，优选地高达70℃或甚至更高的温度下是稳定的。Her2结合蛋白的这种高温稳定性对于一些应用，例如，对于放射化学应用是重要的。对于稳定性分析，例如，与化学或物理去折叠有关的基于光谱学或荧光的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用标准方法，通过测量热解(T
具有延长半衰期的分子。对于诊断和治疗应用，获得具有延长半衰期的分子可以是极其重要的。一些实施方式涉及融合至延长Her2结合蛋白的半衰期的分子的选自SEQ IDNO：1-14中任一种，或者与其具有至少97％或至少98％的同一性的蛋白，优选地选自与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少97％的同一性的蛋白的Her2结合蛋白。一些实施方式涉及包含如本文描述的，SEQ ID NO：1-6或者与其具有至少97％的同一性的蛋白，例如SEQ IDNO：1-14的稳定Her2结合蛋白的融合蛋白。在多个实施方式中，将包含选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，或者与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中任一个具有至少97％的同一性的氨基酸序列的氨基酸序列的Her2结合蛋白融合至延长Her2结合蛋白的半衰期的分子。在多个实施方式中，将包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中任一个具有至少98％的同一性的氨基酸序列的Her2结合蛋白融合至延长Her2结合蛋白的半衰期的分子。一些实施方式涉及包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，或者与其具有至少97％、98％或99％的同一性的蛋白的稳定的Her2结合蛋白的融合蛋白。
除稳定的Her2结合蛋白之外，融合蛋白可以另外包含至少一种其它分子，调节药代动力学。包含如本文描述的稳定的Her2结合蛋白和调节药代动力学的分子的融合蛋白可以具有延长的半衰期。适合于半衰期延长的分子可以选自血清白蛋白(例如，人血清白蛋白或小鼠血清白蛋白)、白蛋白结合蛋白、免疫球蛋白结合蛋白或者免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖(例如：羟乙基淀粉)、提高水力半径的非结构化的氨基酸序列，如包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的多聚体或者聚乙二醇。在SEQ ID NO：18中提供了包含融合至免疫球蛋白的以上描述的稳定的Her2结合蛋白的融合蛋白的实例，并且在图9中显示了这种融合蛋白的血清稳定性。在一些实施方式中，融合蛋白在融合蛋白的N末端包含本文描述的Her2结合蛋白并且在C末端包含免疫球蛋白结合蛋白(如单体、二聚体、三聚体或四聚体)。
用于产生具有延长的半衰期的Her2结合蛋白的一些技术在本领域中是已知的，例如，调节药代动力学的部分与如以上描述的Her2结合蛋白的直接融合或者化学连接方法。在一些实施方式中，例如，可以直接或在Her2结合蛋白的一个或几个位点通过肽接头序列或者通过如以上描述的连接位点连接调节药代动力学的部分。
其它部分。在一些实施方式中，可以应用本领域熟知的化学方法实施蛋白质或非蛋白质部分与Her2结合蛋白的缀合。在一些实施方式中，对半胱氨酸或赖氨酸残基衍生化特异的连接化学可以是适用的。可以通过本领域技术人员熟知的化学性质实施化学连接，化学性质包括(但不限于)取代、加成或环化加成或者氧化化学性质(例如，二硫键形成)。
一些实施方式涉及其中融合蛋白另外包含至少一种诊断活性部分的融合蛋白。这种诊断活性部分可以选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料或酶或者以上的任意组合。在多个实施方式中，Her2结合蛋白还包含诊断部分。在其它实施方式中，Her2结合蛋白还包含多于一种诊断部分。在一些实施方式中，可以使用包含至少一种诊断部分，例如，作为成像剂，例如，评价肿瘤细胞或转移的存在、肿瘤分布和/或肿瘤复发的Her2结合蛋白。用于检测或监测癌细胞的方法包括成象方法。这些方法包括通过(例如)放射成像或光致发光或荧光使Her2相关癌细胞成像。一些实施方式涉及使受试者的至少一部分成像的方法，其包括向受试者施用组合物，其中组合物包含SEQ ID NO：1-14，优选地与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2具有至少97％、98％、99％或甚至100％同一性的蛋白所示的分离的多肽和成像剂。在一些实施方式中，方法还包括诊断患有表达Her2的癌症，例如，乳腺癌的受试者的步骤。在一些实施方式中，方法还包括监测组合物向受试者的递送的步骤。
一些实施方式涉及融合蛋白，其中除如以上描述的Her2特异性蛋白之外，融合蛋白包含至少一种治疗活性部分。这种治疗活性部分可以选自单克隆抗体或其片段、结合蛋白、受体或受体结构域、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶或其衍生物或者上述的任意组合。在一些实施方式中，可以在任何以上所列组分向表达Her2的肿瘤细胞的靶向递送中使用包含治疗活性成分的Her2结合蛋白并在其中积累，由此导致对正常细胞的低毒性水平。在一些实施方式中，将包含如本文描述的稳定的Her2结合蛋白和单克隆抗体的融合蛋白称为Mabfilin
适合于在体内或体外成像中应用或者适合于放射疗法的放射性核素包括(例如)，但不限于发射γ-射线的同位素组、正电子发射体组、β-射线发射体组和α-射线发射体组。在一些实施方式中，适合的缀合伴侣包括螯合剂，如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或者二乙撑三胺五乙酸(DTPA)或者它们激活的衍生物、纳米颗粒和脂质体。在多个实施方式中，DOTA作为用于成像的放射性同位素及其它试剂的络合剂可以是适合的，如实施例中进一步详细描述的。一些实施方式涉及使受试者的至少一部分成像的方法，其包括向受试者施用组合物，其中组合物包含SEQ ID NO：1-14，优选地与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少97％、98％、99％或甚至100％同一性的蛋白的分离的多肽和缀合至适合的缀合伴侣，例如DOTA的放射性核素。在一些实施方式中，方法还包括诊断患有表达Her2的癌症，例如，乳腺癌的受试者的步骤。在一些实施方式中，方法还包括监测组合物向受试者的递送的步骤。
在一些实施方式中，其它氨基酸可以在Her2结合蛋白的N末端或C末端或两端延伸。其它序列可以包括例如引入用于例如纯化或检测的序列。在一个实施方式中，其它氨基酸序列包括赋予对某些色谱柱材料的亲和性的一种或多种肽序列。这些序列的典型实例无限制地包括Strep标签、寡聚组氨酸标签、谷胱甘肽S转移酶、麦芽糖结合蛋白、内含肽、内含肽片段或者蛋白G的白蛋白结合结构域。
药物中的使用。多种实施方式涉及如本文公开的Her2结合蛋白用于药物的使用。在一个实施方式中，在诊断或治疗与Her2表达有关的癌症的药物中使用Her2结合蛋白。如本文公开的Her2结合蛋白允许Her2相关癌细胞或癌症组织的选择性诊断和治疗。已知Her2在肿瘤细胞中上调。已知膜蛋白Her2在肿瘤细胞中上调，从而导致肿瘤细胞不受控制的生长和转移形成。癌症患者的新型疗法包括通过靶向治疗剂，例如单克隆抗体曲妥珠单抗
已在多种癌症中描述了Her2的过表达。例如，在约15％至30％的乳腺癌和10％至30％的胃/胃食管癌中发生Her2过表达，并且还在其它癌症，如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠、头颈癌中观察到Her2过表达。因此，包含如本文描述的Her2结合蛋白的药物组合物可以用于治疗其中Her2对于疾病的发生相关的癌症，其包括但不限于，具体地，乳腺癌、卵巢癌、胃癌，而且还可以用于治疗肺癌、头颈癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰癌等。一种实施方式是诊断(包括监测)患有Her2相关癌症的受试者的方法，诊断(监测)方法包括向受试者施用如描述的，可选地缀合至放射性分子的Her2结合蛋白。在多个实施方式中，如本文公开的Her2结合蛋白可以用于诊断Her2相关癌症，可选地其中Her2结合蛋白缀合至放射性分子。在一些实施方式中，使用具有标记，如放射性或荧光的Her2结合蛋白的成象方法可以用于使特定组织或细胞上的Her2显象，例如，以评价Her2相关肿瘤细胞的存在、Her2相关肿瘤分布、Her2相关肿瘤的复发和/或评价患者对治疗性治疗的反应。
一种实施方式是治疗患有Her2相关癌症的受试者的方法，治疗方法包括向受试者施用如描述的，可选地缀合至放射性分子和/或细胞毒性剂的Her2特异性结合蛋白。在多个实施方式中，如本文公开的Her2结合蛋白可以用于治疗Her2相关癌症，可选地其中Her2结合蛋白缀合至细胞毒性剂和/或放射性分子。一些实施方式涉及用适合的放射性同位素或细胞毒性化合物标记的Her2结合蛋白用于治疗Her2相关肿瘤细胞，具体地，控制或杀死Her2相关肿瘤细胞，例如，恶性细胞的用途。在一个实施方式中，将治疗辐射剂量选择性递送至Her2相关肿瘤细胞，但不递送至正常细胞。
组合物。多种实施方式涉及包含如本文公开的Her2结合蛋白的组合物。一些实施方式涉及用于药物，优选地，用于诊断或治疗如以上描述的多种Her2相关癌症肿瘤的包含如上定义的Her2结合蛋白的组合物。包含如以上描述的Her2结合蛋白的组合物可以出于诊断和治疗目的用于临床应用。具体地，包含如本文描述的Her2结合蛋白的组合物可以用于使表达Her2的病理细胞成像、监测以及消除或失活的临床应用。
多种实施方式涉及用于Her2相关癌症诊断的包含如本文所定义的Her2结合蛋白和诊断可接受的载体和/或稀释剂的诊断组合物。这些包括(例如，但不限于)稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。组合物可以处于液体制剂、冻干剂、颗粒剂的形式，处于乳液或脂质体制剂的形式。
包含如本文描述的Her2结合蛋白的诊断组合物可以用于Her2相关癌症的诊断，如以上描述的。
多种实施方式涉及用于疾病治疗的药物(例如，治疗)组合物，其包含如本文公开的Her2结合蛋白和药物(例如，治疗)可接受的载体和/或稀释剂。药物(例如，治疗)组合物可选地可以含有本身已知的其它助剂和赋形剂。这些包括(例如，但不限于)稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。
包含如本文所定义的Her2结合蛋白的药物组合物可以用于疾病的治疗，如以上描述的。
组合物含有有效剂量的如本文所定义的Her2结合蛋白。要施用的蛋白的量取决于生物、疾病类型、患者的年龄和体重以及本身已知的其它因素。基于盖仑制剂，可以通过注射或输注肠胃外、全身、腹膜内、肌内、皮下、经皮或通过其它常用的应用方法施用这些组合物。
组合物可以处于液体制剂、冻干剂、乳膏剂、用于局部施用的洗剂、气溶胶的形式，处于粉末剂、颗粒剂的形式、处于乳液或脂质体制剂的形式。制剂类型取决于疾病类型、施用途径、疾病严重程度、患者以及医学领域技术人员已知的其它因素。
可以将组合物的多种组分包装成具有使用说明书的试剂盒。
Her2结合蛋白的制备。可以通过多种常规和熟知的技术中的任一种制备如本文描述的Her2结合蛋白，技术如简单的有机合成策略、固相辅助合成技术、片段连接技术或者通过可商购的自动合成仪。另一方面，它们还可以通过单独或与常规合成技术结合的常规重组技术制备。此外，它们还可以通过无细胞体外转录/翻译制备。多种实施方式涉及编码如本文公开的Her2结合蛋白的多核苷酸。一种实施方式还提供了包含多核苷酸的表达载体和包含分离的多核苷酸或者表达载体的宿主细胞。
多种实施方式涉及如本文公开的Her2结合蛋白的生产方法，方法包括在允许Her2结合蛋白表达的适合的条件下培养宿主细胞并且可选地分离Her2结合蛋白。
例如，可以在适合的宿主中表达编码Her2结合蛋白的一种或多种多核苷酸并且可以分离产生的Her2结合蛋白。宿主细胞包含核酸分子或载体。适合的宿主细胞包括原核生物或真核生物。载体表示可以用于将蛋白编码信息转移至宿主细胞的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。多种细胞培养系统，例如但不限于哺乳动物、酵母、植物或昆虫还可以用于表达重组蛋白。适合于培养原核或真核宿主细胞的条件对于本领域技术人员是熟知的。出于蛋白生产的目的，应用本领域任何技术人员熟知的技术，可以在从小体积摇瓶到大型发酵罐的任何规模实施细胞培养和蛋白表达。
一个实施方式涉及制备如以上详细说明的结合蛋白的方法，方法包括以下步骤：(a)制备编码如本文定义的Her2结合蛋白的核酸；(b)将核酸引入表达载体；(c)将表达载体引入宿主细胞；(d)培养宿主细胞；(e)使宿主细胞经受在该条件下表达Her2结合蛋白的培养条件，由此产生如本文定义的Her2结合蛋白；(f)可选地分离在步骤(e)中产生的Her2结合蛋白；和(g)可选地将Her2结合蛋白与如本文所定义的其它功能性部分缀合。
通常，应用在本领域中熟知的常规方法和技术，如离心、沉淀、絮凝、不同色谱实施方式、过滤、透析、浓缩及其组合等，可以实施纯化的Her2结合蛋白从培养混合物中的分离。色谱法是本领域熟知的并且无限制地包括离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法(尺寸排阻色谱法)、疏水相互作用色谱法或亲合色谱法。
为了简化纯化，可以将Her2结合蛋白融合至对分离材料具有提高的亲和性的其它肽序列。优选地，选择对Her2结合蛋白的功能性不具有不利影响的这些融合，或者可以由于特异性蛋白酶切割位点的引入在纯化后分离这些融合。这些方法也是本领域技术人员已知的。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明。具体地，通过导致与Her2结合的最多14个修饰的泛素二聚体举例说明了本发明。然而，本发明不限于此，并且以下实施例仅基于以上描述显示本发明的实用性。
实施例1.Her2结合蛋白
SEQ ID NO：16中显示了泛素二聚体序列：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAAMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAA。
如SEQ ID NO：16所示，产生Her2结合蛋白的氨基酸序列中的13个替换如下所示：
I23T、R42T、I44A、A46V、H68W、V70Y、R72T、Q78R、L84H、E92D、K139E、E140W和T142I。所得的Her2结合蛋白具有152个氨基酸的氨基酸序列(对修饰的氨基酸加下划线；与SEQ IDNO：16相比修饰的)：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDT
如本文描述的Her2结合蛋白与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：1具有至少97％的同一性。
可选地，其它替换包括泛素二聚体(SEQ ID NO：16)中氨基酸L73W或R74Y或K82T或Q138S或S141A中的至少一种。所得Her2结合蛋白可以与SEQ ID NO：16的泛素二聚体具有90.5％的氨基酸序列同一性至92％的氨基酸序列同一性。与泛素二聚体的氨基酸同一性越高，则新型结合蛋白越稳定，如下所示。
SEQ ID NO：1-14中显示了具有出乎意料的高稳定性的新型Her2结合蛋白的实例。
实施例2.Her2结合蛋白的表达和纯化
如下，使用技术人员已知的标准方法，将
用编码各种Affilin蛋白的表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。将细胞在选择性琼脂平板(卡那霉素)上涂布并在21℃温育2天或在37℃温育过夜。将预培养物从单一集落接种到补充有50μg/ml卡那霉素的3ml2xYT培养基中，并在37℃，在14mL培养管中在常规定轨振荡器中以210rpm培养6小时。对于主培养，用整个预培养物接种350mL ZYM-5052培养基(参见Studier 2005)并在2.5L Ultra Yield
通过亲合色谱和尺寸排阻纯化具有亲和性标签的蛋白。在使用Strep-TactinSuperflow大容量柱体(IBA Lifesciences)的亲合色谱后，使用
进一步的分析包括SDS-PAGE、SE-HPLC和RP-HPLC。使用摩尔吸光系数，通过在280nm的吸光度测量确定蛋白浓度。已使用Dionex HPLC系统和Vydac 214MS54 C4(4.6×250mm，5μm，
Her2-mIgG-Fc融合蛋白的哺乳动物表达。将Expi293-F细胞与0.5-1Mio细胞/mL一起在Expi293-F表达培养基(Fisher scientific,13489756)中，在摇瓶中以135rpm，在37℃，8％ CO
实施例3.Her2结合蛋白的溶解度分析
将样品在90μl的提取缓冲液(补充有0.5×BugBuster、6mM MgSO
表1.Her2结合蛋白—表达、纯化、溶解度。
实施例4.Her2结合蛋白在高温下稳定
通过差示扫描荧光法(DSF)确定本发明的结合蛋白的热稳定性。将每种探针以0.1μg/μL的浓度转移至MicroAmp Optical 384孔板，并以适合的稀释度添加SYPRO橙色染料。以1℃每分钟的加热速率将从25至95℃的温度升高编程(ViiA-7Applied Biosystems)。始终在520nm的激发波长和623nm的发射波长下测量荧光(ViiA-7，Applied Biosystems)。结果：在表2中对所选变体显示了热去折叠的转变的中点(T
实施例5.Her2结合蛋白的分析(表面等离子共振，SPR)
用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。通过使EDC和NHS的混合物通过产生反应性酯基来激活表面暴露的羧基。以与靶标1:3的比例(hIgG-Fc：靶标)，将700-1500RU Her2-Fc(结合配体(on-ligand))固定化在流通池上，将IgG-Fc(解离配体(off-ligand))固定在另一个流通池上。在配体固定后，注入乙醇胺以阻断未反应的NHS基团。一旦配体结合，蛋白分析物在表面上积累，从而提高折射率。实时测量折射率的这种变化，并作为响应或共振单位(RU)相对于时间绘图。将分析物以30μl/min的流速以连续稀释的形式施加到芯片上。实施结合30秒并解离60秒。在每次运行后，用30ml再生缓冲液使芯片表面再生并用运行缓冲液平衡。将曲妥珠单抗的稀释系列用作阳性对照，而将未修饰的二泛素的稀释系列代表阴性对照。以30μl/min的流速将对照样品应用于基质，同时使它们结合60秒并解离120秒。如前所述进行再生和再平衡。通过使用Biacore 3000(GEHealthcare)进行结合研究；数据评价通过生产商所提供的BIAevaluation 3.0软件，通过使用Langmuir 1:1模型(RI＝0)进行。与Her2的结合结果如表2所示.
将评价的解离常数(K
表2.Her2结合蛋白的结合分析和温度稳定性
实施例6.Her2结合蛋白的血清稳定性(细胞结合测定)
将Affilin-206478、Affilin-206479、Affilin-206494、Affilin-206486、Affilin-206495、Affilin-206499、Affilin-206497(SEQ ID NO：1、2、4、5、10、13、14)的1μM至6pM的稀释系列在37℃在100％小鼠血清中温育24h。将表达Her2的SK-BR-3-细胞胰蛋白酶化，用FACS封闭缓冲液(PBS、0.1％ SodiumAcite、3％ FCS)清洗并以0.1Mio细胞/100μl的密度接种到96孔圆底板中。在存在血清的情况下，在24h和0h(对照)后将Affilin蛋白的稀释系列与SK-BR-3-细胞温育。在45min后，除去上清液并添加100μl/孔的在FACS封闭缓冲液中1:300稀释的兔抗Strep-标签抗体(得自GenScript；A00626)。在除去一抗后，以1:1000稀释应用山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488抗体(得自Invitrogen；A11008)。以激发波长488nm和发射波长525/30nm，在来自Merck-Millipore的Guava easyCyte 5HT装置上实施流式细胞术测量。结果如表3所示。
表3.通过细胞结合测定和ELISA的Her2结合蛋白的血清稳定性分析
实施例7.Her2结合蛋白的血清稳定性(ELISA)
在4℃下用1.2μg/ml重组人ErbB2/Her2 Fc嵌合体(R&DSystems；目录号1129-ER-050)固定高结合板(Greiner,781061)过夜。将Affilin-206479、Affilin-206494、Affilin-206486、Affilin-206495、Affilin-206499、Affilin-206497(SEQ ID NO：2、4、5、10、13、14)的50nM至1.5pM的稀释系列和37nM至1.8pM的Affilin-206478(SEQ ID NO：1)在37℃，在100％小鼠血清中温育24h。用PBST(PBS+0.1％ Tween)将ELISA板清洗3次并在RT下用3％BSA/0.5％ Tween/PBS封闭2h。在存在血清的情况下温育0h或24h后，将稀释系列在ELISA板上在RT下温育1h。用PBST清洗后，在RT下用生物素化的抗泛素抗体(1:1000)温育孔1h。用抗生蛋白链菌素-HRP(1:5.000)使结合可视化。在24h血清温育后，Her2结合蛋白显示K
实施例8.Her2-mIgGFc-融合(209438)的细胞结合和血清稳定性
通过ELISA分析了小鼠血清中融合蛋白209438(融合至IgG-Fc的Affilin-206479)的血清稳定性(参见实施例7)。0h血清温育时的K
对SK-BR-3-细胞分析了连接至DOTA-Fe的融合蛋白209438在小鼠血清中的稳定性。将1μM至0.07nM的Dota-Fe-连接的融合蛋白209438的稀释系列在37℃与100％小鼠血清温育24h。在24h血清温育和作为对照的0h血清温育后，清洗胰蛋白酶化的SK-BR-3-细胞，用封闭缓冲液(参见以上实施例)封闭并与融合蛋白的稀释系列温育。使用StrepTactin-DY488(IBA；产品目录No.2-1562-050)，通过流式细胞术分析融合蛋白的结合。对照的K
两种融合蛋白在血清中稳定24h。还通过ELISA确认了209438-Dota-Fe在小鼠血清中24h的血清稳定性(数据未显示)。
实施例9.使用融合至mIgG-Fc的Affilin-206479(SEQ ID NO：2)制剂的体内研究以及对于体内研究的融合蛋白分析
通过两步纯化对融合蛋白进行纯化。在使用HiTrap蛋白A HP柱的亲合色谱(缓冲液：20mM NaH
将纯化的蛋白与作为还原剂的150μM TCEP在室温下温育1小时，然后使用HiTrap脱盐柱(GE Healthcare/Cytiva)在连接缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCI、5mM EDTA，pH7.0)中脱盐。在室温下，在以20倍摩尔过量用马来酰亚胺-DOTA(CheMatec)标记3小时后，将样品应用于阴离子交换色谱柱(Resource Q,GE Healthcare/Cytiva)。因此，将20mM Bis-Tris pH 7.0用作上样缓冲液。在30CV内实施从0％至30％缓冲液B(20mM Bis-Tris、1MNaCI，pH 7.0)的梯度洗脱。使用Superdex200pg 26/600柱(GE Healthcare/Cytiva，缓冲液：100mM乙酸钠pH 5.8)进行最终精制步骤。
在
获得DOTA连接的和纯化的蛋白的均一物质；未检测到聚集。在SDS-PAGE分析后，将阳性部分混合并测量它们的蛋白浓度。进一步分析包括SE-HPLC和RP-HPLC。使用摩尔吸光系数，通过在280nm的吸光度测量确定蛋白浓度。使用Dionex HPLC系统和PLRP-S(5μm，
使用LightCycler 480(Roche)，通过差示扫描荧光法确定热转化点。根据生产商的手册，使用Endosafe nexgen-PTS(Charles River)测量内毒素水平。
分别通过使用CM5传感器芯片的Biacore 3000SPR(GE Healthcare)和使用大容量胺传感器芯片的SPR-32(Bruker)进行结合分析。将Her2-His和重组蛋白A固定在传感器芯片的表面上并用SPR运行缓冲液(PBST 0.05％)平衡。一旦结合，蛋白分析物在表面上积累，从而提高折射率。实时测量折射率的这种变化，并作为响应或共振单位相对于时间绘图。将分析物以30μl/min的流速以连续稀释的形式施加到芯片上。实施结合120秒并解离120-180秒。在每次运行后，用30μl再生缓冲液(10mM甘氨酸pH 2.0)使芯片表面再生并用运行缓冲液平衡。结果如表4所示。
表4.
用Lu-177对DOTA-化合物进行放射性标记
用具有约1MBq/nmol的比活性并且显示出≥95％的放射化学纯度(RCP)的
通过融合至mIgG-Fc对Her2结合蛋白半衰期的延长(体内研究-药代动力学和组织分布)
对具有150-300mm
图10以每克肿瘤组织的注射剂量百分比显示了七天内Affilin-206479的吸收。
序列表
<110> 纳维格蛋白质有限公司
<120> 用于治疗诊断学应用的血清稳定的人HER2的结合蛋白
<130> NP49 WO
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206478
<400> 1
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Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
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Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
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Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
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Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206479
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Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
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Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206494
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206483
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<223> 206481
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<213> 人工序列
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<223> 206504
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Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
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145 150
<210> 12
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206485
<400> 12
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Leu Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Asp Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 13
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206499
<400> 13
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Asp Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 14
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 206497
<400> 14
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Asp Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 15
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> her2结合蛋白
<220>
<221> Xaa
<222> (73)..(73)
<223> Xaa可以选自L或W
<220>
<221> Xaa
<222> (74)..(74)
<223> Xaa可以选自R或Y
<220>
<221> Xaa
<222> (82)..(82)
<223> Xaa可以选自K或T
<220>
<221> Xaa
<222> (138)..(138)
<223> Xaa可以选自Q或S
<220>
<221> Xaa
<222> (141)..(141)
<223> Xaa可以选自S或A
<400> 15
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Xaa Xaa Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Xaa Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Asp Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Xaa Glu Trp Xaa Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 16
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wt泛素二聚体
<400> 16
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAdelFc
<400> 17
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Ile Gln Gln Ala Ala Asp Lys Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Lys Phe Arg Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 18
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ2与IgG的融合蛋白(209438)
n[UbFrag_(G4S)x4_mIgG2a-Fc_SA-Strep]c
<400> 18
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Leu Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Asp Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly
180 185 190
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
210 215 220
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
225 230 235 240
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
245 250 255
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
260 265 270
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu
275 280 285
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
290 295 300
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
305 310 315 320
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
325 330 335
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
355 360 365
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
370 375 380
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Cys Thr Pro
385 390 395 400
Gly Lys Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405 410
机译： 用于治疗应用的人HER2的血清稳定的结合蛋白
机译： 结合血液蛋白作为人类血清白蛋白的结合物及其在诊断和治疗应用中的使用方法
机译： 分离的人抗体，治疗患者中ngf表达增加或ngf敏感性增加引起的疾病的方法，药物组合物，生物样品中ngf的检测方法，核酸分子，宿主细胞，分离的细胞系，ngf特异性结合剂，分离的人抗体或其免疫功能性免疫球蛋白片段或其抗原结合剂，多核苷酸，表达载体，用于治疗与ngf表达增加或对ngf敏感性增加相关的疼痛性疾病或病症的药物，以及药物有效量的抗体的用途
