柳蝙蛾液泡ATP酶A亚基（PeV-ATPase A）基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用

摘要

本发明公开了一种柳蝙蛾液泡ATP酶A亚基(PeV‑ATPase A)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用，通过转录组分析，设计并合成PeV‑ATPase A基因开放阅读框的特异性引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO:5，经过基因克隆获得PeV‑ATPase A基因序列，核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2，然后选择序列为SEQ ID NO：3的基因片段为RNAi靶序列，设计并合成带有酶切位点的引物对SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，PCR扩增，构建原核表达载体并诱导dsRNA表达。通过对柳蝙蛾幼虫进行dsRNA的饲喂，干扰PeV‑ATPase A基因的表达，柳蝙蛾幼虫出现进食障碍死亡等异常表型，靶标基因表达量显著降低，幼虫死亡率升高。本发明为林业柳蝙蛾的害虫防治提供高效性、特异性和安全性的广泛应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及林业害虫防治技术领域，具体涉及一种柳蝙蛾液泡ATP酶A亚基(PeV-ATPase A)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用。

背景技术

柳蝙蛾(Phassus excrescens Butler)也称疣纹蝙蝠蛾，属鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)是一种危害包括水曲柳、丁香、猕猴桃在内的多种林木、果树、农作物的蛀干害虫，其幼虫有较强钻蛀性，前期环形取食，危害枝干，后期钻入髓部啃食，该害虫常造成果木减产，严重时使树木枯死。因柳蝙蛾幼虫为蛀干害虫，隐蔽性较强，且有较强的适应性和抗逆性，因此该虫难以发现，即使发现也大多只能采用敌敌畏乳油等化学药物灌注法除虫，或预防时期在树下喷施50％对硫磷乳油或25％蝰硫磷乳油，容易造成害虫抗药性增强，且对生态环境并不友好。

RNAi技术因其高效性、特异性及可遗传性等特性成为昆虫防治的重要方法之一，它的主要作用方式就是通过注射法、饲喂法、浸泡法等将靶标基因的dsRNA导入昆虫体内，使其沉默内源基因，造成昆虫发育障碍、繁殖量减少甚至死亡。

液泡ATP酶又称V-ATP酶(Vacuolar-type ATPase，V-ATPase)是一种广泛存在于真核细胞多种细胞器膜及某些细胞质膜上的一种ATP水解驱动的质子泵。在昆虫中，V-ATP酶主要存在于中肠、唾液腺和马氏管中，该酶属于能量代谢系统，对个体生存有重要作用。研究表面，昆虫V-ATP酶A亚基在昆虫整个生命周期中均有表达，尤其在幼虫期及中肠的表达量较高。目前国内外还没有关于柳蝙蛾PeV-ATPase A的任何研究报告，研究柳蝙蛾PeV-ATPase A可以为新型杀虫剂提供合适的靶标。

发明内容

为解决上述问题，本发明目的在于提供一种柳蝙蛾液泡ATP酶A亚基(PeV-ATPaseA)基因，可作为药物靶点，对柳蝙蛾进行防治。

本发明另一个目的在于提供基于上述柳蝙蛾PeV-ATPase A基因合成的dsRNA方法，柳蝙蛾虫摄入dsRNA后可使其致死，起到防治的作用。

为实现上述发明目的，本发明所采用以下技术方案：

本发明提供一种柳蝙蛾PeV-ATPase A基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1"PeV-ATPase A"所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2"PeV-ATPase A"所示，柳蝙蛾PeV-ATPase A基因编码区全长1848bp，编码615个氨基酸，蛋白的分子式为C

本发明提供基于上述柳蝙蛾PeV-ATPase A基因合成的dsRNA靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3"dsPeV-ATPase A"所示。

本发明还提供用于获得所述柳蝙蛾PeV-ATPase A基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4"PeV-ATPase A-F"和SEQ ID NO:5"PeV-ATPase A-R"所示。

本发明还提供用于合成所述RNAi干扰目的片段的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6"YPeV-ATPase-F"和SEQ ID NO.7"YPeV-ATPase-R"所示。

本发明还提供基于上述柳蝙蛾PeV-ATPase A基因诱导dsRNA表达的方法，包括以下步骤：

(1)基于柳蝙蛾转录组数据分析，设计并合成用于克隆PeV-ATPase A基因开放阅读框的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4"PeV-ATPase A-F"所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示"PeV-ATPase A-R"，引物由生物公司合成；

(2)提取柳蝙蛾总RNA，通过RT-PCR反转录得到cDNA；

(3)以(2)中得到的cDNA为模板和(1)中合成的引物进行PeV-ATPase A基因全长的PCR扩增，PCR体系为：模板2μL、10x聚合酶buffer 5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL、Rtaq酶1μL、2.5mM dNTP 5μL、ddH

(4)PCR产物测序后使用在线分析软件分析基因序列，并选择合适的RNAi干扰靶标片段，设计带有载体L4440酶切位点SacⅠ(gagctc)和XbaⅠ(tctaga)的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；

(6)构建含有上述选定目的基因片段的L4440载体，以GFP序列片段作为阴性对照，并转入宿主大肠杆菌HT115中获得HT115-L4440-PeV-ATPase A菌液及阴性对照的HT115-L4440-GFP菌液；

(7)dsRNA的诱导表达：对(6)中转化的大肠杆菌进行PCR验证，对验证后的大肠杆菌按照1:50比率接种于含有100mg/L氨苄青霉素及50mg/L四环素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，之后在按照菌液：培养基＝1：100的比例再次培养，37℃，200rpm/mim培养约3-4h，直至OD

本发明还提供上述dsRNA对柳蝙蛾抗虫性的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

经过多次实验表明，柳蝙蛾体内获得dsRNA后能有效的抑制PeV-ATPase A基因的表达，幼虫表现出明显的进食障碍及活动迟缓，干扰8d后死亡率升高26.67％，靶标基因沉默效率为83.45％，效果显著。另外用dsRNA抑制柳蝙蛾幼虫，种属特异性强，不会对其他物种造成基因干扰；同时dsRNA在自然环境中易降解，对生态环境友好。因此，鉴于本发明的高效性、特异性和安全性，在柳蝙蛾幼虫抗虫性方面有广阔的应用前景，对保护我国林业资源、生态安全具有良好的经济效益。

附图说明

图1为饲喂dsRNA 8d内柳蝙蛾幼虫的死亡率变化，注：采用单因素方差分析法进行差异显著性分析，误差条表示标准误差，数据表示三个独立生物复制的平均±SE。星号显示处理组与对对照组之间有显著性差异，*p<0.05，**p<0.01。

图2为饲喂dsRNA后PeV-ATPase A的相对表达量，注：采用单因素方差分析法进行差异显著性分析，误差条表示标准误差，数据表示三个独立复制的平均±SE。星号显示处理组与对对照组之间有显著性差异，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1柳蝙蛾PeV-ATPase A基因序列的获取

(1)柳蝙蛾总RNA的提取：使用Trizol试剂(Invitrogen)提取柳蝙蛾四龄幼虫的RNA；

(2)利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(康为生物)将提取的柳蝙蛾的总RNA反转录为cDNA；

(3)根据转录组比对信息，采用Primerpremier 5.0软件设计目的基因的上下游引物分别为SEQ ID NO:4"PeV-ATPase A-F"

CAATTACAATGGCTACTGGG

SEQ ID NO:5"PeV-ATPase A-R"

GGAGGATGTGTTCCTTAGG

引物合成由有资质的生物公司合成；

(4)以cDNA为模板PCR扩增得到目的基因PeV-ATPase A的开放阅读框全长，PCR体系为：模板2μL、10x聚合酶buffer 5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL、R taq酶1μL、2.5mMdNTP 5μL、ddH

(5)将(4)中获得的目的基因连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞，PCR验证，将验证无误的阳性克隆菌液送至哈尔滨博瑞兴科生物公司测序，获得PeV-ATPase A序列；

(6)对(5)中的PeV-ATPase A序列进行生物学分析，PeV-ATPase A核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，结果为：

柳蝙蛾的PeV-ATPase A基因编码区全长1848bp，编码615个氨基酸，分子量为68100.64，理论等电点为5.30，根据protparam分析，该蛋白的分子式为C

实施例2柳蝙蛾PeV-ATPase A基因的dsRNA的原核表达

(1)靶标片段的选择

利用在线预测软件https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do以及http://sidirect2.rnai.jp/等，对目的基因PeV-ATPase A基因siRNA的有效干扰位点进行预测，选择合适的靶标片段，合成dsRNA所对应的靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)RNAi干扰片段的引物设计

根据(1)中的序列信息使用Primerpremier 5.0设计目的基因引物并在引物两端分别添加限制性酶切位点SacⅠ(gagctc)和XbaⅠ(tctaga)，

上游引物序列如SEQ ID NO.6所示：ACA

下游引物序列如SEQ ID NO.7所示：GGC

下划线部分为酶切位点，引物均由有资质的生物公司合成；

同时选择片段大小相似的prokII-GFP载体上的GFP序列片段作为阴性对照；

(3)PCR扩增获得RNAi干扰片段，常规方法克隆后进行测序验证；

(4)原核表达系统的构建

对(3)中测序正确的菌液，选择天根的TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒(离心柱型)进行质粒提取，将提取的PeV-ATPase A及GFP干扰片段单克隆质粒与L4440质粒双酶切后电泳，使用天根的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带，并用T4连接酶连接并转化HT115大肠杆菌感受态细胞；

(5)dsRNA的诱导表达与总核酸提取

将目的基因及GFP菌液按照1:50比率接种于含有100mg/L氨苄青霉素及50mg/L四环素的LB液体培养基(5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，溶于1L去离子水pH调整为7.2，115℃30min高温灭菌)中，37℃，200转/min震荡培养过夜，再按菌液：培养基比例为1：100混合，37℃，200转/min震荡培养约3-4h，直至OD

A.冷冻离心机提前调至4℃，超净工作台紫外灭菌处理后通风备用；

B.收集1mL经IPTG诱导菌液及未经诱导菌液，4℃，10000rpm离心5min后弃上清液；C.加入700μL的STE buffer(pH5.0)悬浮沉淀，加入同等体积的苯酚：氯仿混合液(25：24，pH＝8.0)涡旋振荡100s以上，至菌体充分裂解；

D.4℃ 13000g离心5min即可观察到混合液明显分层，上层即为菌体总核酸。

dsRNA的纯化：

A.吸取部分上清液加10:1体积的RNase A稀释液与DNaseⅢ消化，反应时间为37℃5min，75℃ 5min；

B.消化结束后添加5：1体积的5xRNA Loading Buffer，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

C.若诱导成功可观察到与目的片段长度相同的dsRNA条带。

实施例3柳蝙蛾PeV-ATPase A基因dsRNA抗虫性应用

(1)柳蝙蛾幼虫对PeV-ATPase A基因dsRNA的摄取

选择生长状态一致且良好的三龄柳蝙蛾幼虫作为实验用虫，将一年或两年生的水曲柳嫩枝剪为5cm左右小段，用双蒸水按照两倍体积将HT115-L4440-PeV-ATPase A和HT115-L4440-GFP稀释，用作浸泡枝条，使其表面均匀沾染菌液，将枝条晾干至没有菌液流动滴落后用于饲喂柳蝙蛾幼虫，每天两次补充喷洒新鲜菌液在枝条表面，两天一次更换新鲜枝条，每15只幼虫为一个处理，每处理重复三次；

(2)对(1)中的幼虫体态进行观察

幼虫摄取dsRNA5d后处理组取食相较对照组逐渐减少，活动缓慢，8d后幼虫死亡率为56.67％，此时GFP对照组为30％(图1)。

(3)幼虫PeV-ATPase A基因表达量的测定

在幼虫摄取dsRNA的2d，5d，8d后，用常规法分别提取幼虫总RNA并合成cDNA，使用TAKARA的TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plu s)试剂盒进行qPCR检测，β-actin基因为内参基因，表达量由2

与对照组比较实验组中目的基因的mRNA表达量显著降低，在5d时，PeV-ATPase A组基因表达量相比对照GFP组降低了36.89％，到8d时PeV-ATPase A组仅为对照组的16.55％，结果证明柳蝙蛾幼虫摄取dsRNA后能够造成幼虫体内相应靶标基因的沉默。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。