缀叶丛螟几丁质合成酶1（LmCHS1）基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用

摘要

本发明公开了缀叶丛螟几丁质合成酶1(LmCHS1)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用，通过转录组分析，设计并合成LmCHS1基因开放阅读框的特异性引物对，经过基因克隆获得LmCHS1基因序列，核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2，然后选择序列为SEQ ID NO：3的基因片段为RNAi靶序列，设计并合成带有酶切位点的引物对SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，PCR扩增，构建原核表达载体并诱导dsRNA表达。对缀叶丛螟幼虫进行dsRNA的饲喂，干扰LmCHS1基因的表达，24h观察到了幼虫出现体表异常，部分幼虫无法正常完成蜕皮过程或蜕皮后不能形成正常体表而死亡等异常现象，96h后幼虫死亡率为72.22％，此时GFP对照组为40％，效果显著。本发明在林业缀叶丛螟害虫的防治中具有高效性、特异性和安全性的广泛应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及林业害虫防治技术领域，具体涉及一种缀叶丛螟几丁质合成酶1(LmCHS1)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用。

背景技术

缀叶丛螟(Locastra muscosalisWalker)又称核桃缀叶螟，属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，该害虫在我国南部爆发区域较多，主要危害漆树、黄连木、胡桃楸、枫香等树木。随着近几年气温升高和城市效应加剧，缀叶丛螟逐年向北扩散为害，现今在辽宁省及黑龙江省都见报道。缀叶丛螟幼虫一次性孵育数量多，吐丝结巢裹覆叶片，且活泼易动，受惊时会迅速后窜藏于叶内，且迁移性较强，幼龄及熟龄幼虫皆耐饥饿，因此一旦爆发常常危害数棵邻近树木，尤其对树种单一的种子园或人工林危害严重，如不在爆发初期迅速处理则容易造成同一林区连年受灾，严重影响树木成活性及观赏性。对该害虫的治理防治有人工治理、物理防治、化学防治、生物防治等，其中应用性较强的方式还是以喷洒氯氰菊酯及除虫脲等药物为主的化学防治。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，又名基因沉默，是指由双链RNA分子诱导与之同源的mRNA特异性降解，使得特定的靶标基因沉默的现象。害虫侵扰是危害植物生长发育，造成林业或农业生产量下降，而常用的防治方法主要为喷洒农药，成本高昂且会污染环境，甚至对人类健康造成威胁。在这样的困扰下，RNAi技术因其高效性、特异性及可遗传性等特性成为昆虫防治的重要方法之一，它的主要作用方式就是将靶标基因的dsRNA导入昆虫体内，使其沉默内源基因，造成昆虫发育障碍、繁殖量减少甚至死亡。

几丁质又称甲壳素，是一种广泛分布于昆虫、节肢动物等生命体中的多聚糖，几丁质的存在保证了昆虫表皮及食膜的正常生长，在昆虫营养吸收及蜕皮活动中发挥重要用，甚至影响着昆虫的生命。CHS1主要负责昆虫表皮及气管中几丁质的合成，参与昆虫蜕皮等重要生命活动，至今在多种昆虫中都发现了沉默CHS1基因引起的致死效应，而国内外还没有关于缀叶丛螟CHS1的任何研究报告。

发明内容

为解决上述问题，本发明目的在于提供一种缀叶丛螟几丁质合成酶1(LmCHS1)基因可作为药物靶点，进行缀叶丛螟防治。

本发明另一个目的在于提供基于上述缀叶丛螟LmCHS1基因合成dsRNA，饲喂该dsRNA至缀叶丛螟体内，导致其部分幼虫发生无法正常完成蜕皮过程或蜕皮后不能形成正常体表而死亡等异常现象，起到防治的作用。

为实现上述发明目的，本发明所采用以下技术方案：

本发明提供一种缀叶丛螟LmCHS1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，缀叶丛螟的LmCHS1基因编码区全长4692bp，编码1563个氨基酸。

本发明提供基于上述缀叶丛螟LmCHS1基因合成的dsRNA所对应的靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供用于获得上述缀叶丛螟LmCHS1基因开放阅读框的特异性引物对，上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供用于合成所述RNAi干扰目的片段的引物对，设计带有L4440酶切位点的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物序列如SEQ ID NO.7所示

本发明还提供基于上述缀叶丛螟LmCHS1基因诱导dsRNA表达的方法，包括以下步骤：

(1)基于缀叶丛螟转录组数据分析，设计并合成用于克隆LmCHS1基因开放阅读框的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示，引物由生物公司合成；

(2)提取缀叶丛螟总RNA，通过RT-PCR反转录得到cDNA；

(3)以(2)中得到的cDNA为模板和(1)中合成的引物进行LmCHS1基因全长的PCR扩增，PCR体系为：模板2μL、10x聚合酶buffer 5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL、R taq酶1μL、2.5mM dNTP 5μL、ddH

(4)PCR产物测序后使用在线分析软件分析基因序列，并选择合适的RNAi干扰目的片段，设计带有载体L4440酶切位点SacⅠ(gagctc)和XbaⅠ(tctaga)的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；

(6)构建含有上述选定目的基因片段的L4440载体，以GFP序列片段作为阴性对照，并转入宿主大肠杆菌HT115中获得HT115-L4440-LmCHS1菌液及阴性对照的HT115-L4440-GFP菌液；

(7)dsRNA的诱导表达：对(6)中转化的大肠杆菌进行PCR验证，对验证后的大肠杆菌按照1:50比率接种于含有100mg/L氨苄青霉素及50mg/L四环素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，之后在按照菌液：培养基＝1：100的比例再次培养，37℃，200rpm/mim培养约3-4h，直至OD

本发明还提供上述dsRNA对缀叶丛螟抗虫性的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

经过多次实验表明，缀叶丛螟体内摄入dsRNA后能有效的抑制LmCHS1基因的表达，24h观察到了幼虫出现体表异常，部分幼虫无法正常完成蜕皮过程或蜕皮后不能形成正常体表而死亡等异常现象，96h后幼虫死亡率为72.22％，此时GFP对照组为40％，效果显著。

另外用dsRNA抑制缀叶丛螟幼虫，种属特异性强，不会对其他物种造成基因干扰；同时dsRNA在自然环境中易降解，涉及的菌液也是通用的大肠杆菌，对生态环境友好。因此，鉴于本发明的高效性、特异性和安全性，在缀叶丛螟幼虫抗虫性方面有广阔的应用前景，对保护我国林业资源、生态安全具有良好的经济效益。

附图说明

图1为缀叶丛螟幼虫摄入dsRNA后的表型变化，最左为对照组正常幼虫体态。

图2为摄入dsRNA72h内缀叶丛螟幼虫的死亡率变化，注：采用单因素方差分析法进行差异显著性分析，误差条表示标准误差，数据表示三个独立生物复制的平均±SE。星号显示处理组与对对照组之间有显著性差异，*p<0.05，**p<0.01。

图3为dsRNA表达菌液后LmCHS1的相对表达量，注：采用单因素方差分析法进行差异显著性分析，误差条表示标准误差，数据表示三个独立复制的平均±SE。星号显示处理组与对对照组之间有显著性差异，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1缀叶丛螟LmCHS1基因序列的获取

(1)缀叶丛螟总RNA的提取：使用Trizol试剂(Invitrogen)提取缀叶丛螟四龄幼虫的RNA；

(2)利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(康为生物)将提取的缀叶丛螟的总RNA反转录为cDNA；

(3)根据转录组比对信息，采用Primerpremier 5.0软件设计目的基因的上下游引物分别为

LmCHS1-F SEQ ID NO:4

GAGATGGCGACGTCGGGA

LmCHS1-R SEQ ID NO:5

GCCTTCTAAAATCTTCCCTGG

引物合成由有资质的生物公司合成；

(4)以cDNA为模板PCR扩增得到目的基因LmCHS1的开放阅读框全长，PCR体系为：模板2μL、10x聚合酶buffer 5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL、R taq酶1μL、2.5mM dNTP 5μL、ddH

(5)将(4)中获得的目的基因连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞，PCR验证，将验证无误的阳性克隆菌液送至哈尔滨博瑞兴科生物公司测序，获得LmCHS1基因序列；

(6)对(5)中的LmCHS1序列进行生物学分析，LmCHS1核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，结果为：

缀叶丛螟的LmCHS1基因编码区全长4692bp，编码1563个氨基酸，分子量为178077.22，理论等电点为6.50，根据protparam分析，该蛋白的分子式为C

实施例2缀叶丛螟LmCHS1基因dsRNA的原核表达

(1)靶标片段的选择

利用在线预测软件https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do以及http://sidirect2.rnai.jp/等，对LmCHS1基因siRNA的有效干扰位点进行预测，选择合适的靶标片段，合成dsRNA所对应的靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)RNAi干扰片段的引物设计

根据序列信息使用Primerpremier 5.0设计目的基因引物并在引物两端分别添加限制性酶切位点SacⅠ(gagctc)和XbaⅠ(tctaga)，

上游引物序列如SEQ ID NO.6所示：ACA

下游引物序列如SEQ ID NO.7所示：GGC

下划线部分为酶切位点，引物均由有资质的生物公司合成；

同时选择片段大小相似的prokII-GFP载体上的GFP序列片段作为阴性对照；

(3)PCR扩增获得RNAi干扰片段，常规方法克隆后进行测序验证；

(4)原核表达系统的构建

对(3)中测序正确的菌液，选择天根的TIANprep Mini PlasmidKit质粒小提试剂盒(离心柱型)进行质粒提取，将提取的LmCHS1及GFP干扰片段单克隆质粒与L4440质粒双酶切后电泳，使用天根的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带，并用T4连接酶连接并转化HT115大肠杆菌感受态细胞；

(5)dsRNA的诱导表达与总核酸提取

将目的基因及GFP菌液按照1:50比率接种于含有100mg/L氨苄青霉素及50mg/L四环素的LB液体培养基(5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，溶于1L去离子水PH调整为7.2，115℃，30min高温灭菌)中，37℃，200转/min震荡培养过夜，再按菌液：培养基比例为1：100混合，37℃，200转/min震荡培养约3-4h，直至OD

A.冷冻离心机提前调至4℃，超净工作台紫外灭菌处理后通风备用；

B.收集1mL经IPTG诱导的菌液及未经诱导的菌液，4℃，10000rpm离心5min后弃上清液；

C.加入700μL的STE buffer(pH5.0)悬浮沉淀，加入同等体积的苯酚：氯仿混合液(25：24，pH＝8.0)涡旋振荡100s以上，至菌体充分裂解；

D.4℃ 13000g离心5min即可观察到混合液明显分层，上层即为菌体总核酸。

dsRNA的纯化：

A.吸取部分上清液加10:1体积的RNaseA稀释液与DNaseⅢ消化，反应时间为37℃5min，75℃ 5min；

B.消化结束后添加5：1体积的5xRNALoading Buffer，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

C.若诱导成功可观察到与目的片段长度相同的dsRNA条带。

实施例3缀叶丛螟LmCHS1基因dsRNA抗虫性应用

(1)缀叶丛螟幼虫对LmCHS1基因dsRNA的摄取

选择生长状态一致且良好的三龄缀叶丛螟幼虫作为实验用虫，采摘新鲜的胡桃楸树叶，用双蒸水按照两倍体积将HT-L4440-LmCHS1菌体进行稀释，喷洒在树叶表面，晾干后用于喂养幼虫，每天更换新鲜树叶2次，每20只幼虫为一个处理，每处理重复3次。

(2)对(1)中的幼虫体态进行观察

24h观察到了幼虫出现体表异常，部分幼虫无法正常完成蜕皮过程或蜕皮后不能形成正常体表而死亡等异常现象(图1)，96h后幼虫死亡率为72.22％，此时GFP对照组为40％(图2)，效果显著。

(3)幼虫LmCHS1基因表达量的测定

在幼虫摄取dsRNA的24h、48h、72h时后，用常规法分别提取幼虫总RNA并合成cDNA，使用TAKARA的TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseHPlu s)试剂盒进行qPCR检测，β-actin基因为内参基因，表达量由

与对照组比较实验组中目的基因的mRNA表达量显著降低，到72h时LmCHS1组仅为对照组的16.36％(图3)，结果证明缀叶丛螟幼虫摄取dsRNA后能够造成幼虫体内相应靶标基因的沉默。

实施例4基因干扰的非靶标效应

为验证RNAi作用的特异性，采用上述实施例3同样的方法对核桃扁叶甲害虫进行饲喂，结果显示在喂食的96h内，核桃扁叶甲幼虫的进食情况、身体形态、生长过程和死亡率均与GFP对照组没有明显区别，多数幼虫都可以正常的完成蜕皮及化蛹等生长阶段，说明缀叶丛螟的LmCHS1基因的dsRNA对非靶标昆虫没有效果，具有特异性和安全性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。