烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因表达在烟草种子老化程度检测中的应用

摘要

本申请公开了一种烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因表达在烟草种子老化程度检测中的应用，烟草种子中异丙基苹果酸合酶基因NtIPMS核苷酸序列SEQIDNO.1的表达水平与烟草种子活力存在定量关系。利用该关系通过检测烟草种子中SEQIDNO.1的表达水平可以快速检测种子老化程度，评价烟草种子活力。

说明书

技术领域

本申请涉及烟草种子活力检测技术领域，特别是一种烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因表达在烟草种子老化程度检测中的应用。

背景技术

种子活力在种子发育过程中形成、在种子生理成熟期达到高峰，种子成熟后在贮藏过程中会经历不可逆的、活力逐步下降的劣变过程，这会给种质资源保存和农业生产带来巨大损失。种子老化或劣变本质上是一系列细胞结构和生理功能上复杂变化，伴随着质膜损伤、细胞器损伤、呼吸效率和ATP产生以及酶活力下降等变化。在种子贮藏过程中有毒物质不断积累也会对种子产生严重的毒害作用。此外，过量的ROS积累会导致蛋白损伤、脂质过氧化、遗传物质损伤等，也是种子劣变的主要因素之一。

生产上，常用的检测种子在贮藏期间劣变、衰老的方法有标准发芽法、控制劣变法、加速老化法、四唑染色法、甲烯蓝法、红墨水染色法、溴麝香草酚蓝法等。其中标准发芽法、控制劣变法、加速老化法是目前较为常用的种子活力检测方法，但存在费时、费力、鉴定结果易受环境及操作条件影响等缺点。其他方法仅能表征种子的生活力。如何快速准确评价烟草种子老化程度和种子活力，进而提高种子价值仍然是亟待解决的问题。因此，很有必要开发能快速监测烟草种子老化、评价种子活力的分子标记法，从而准确掌握种子老化进程，确定最佳贮藏时间，避免生产损失。

现有技术中α-异丙基苹果酸合酶(α-isopropylmalatesynthase)由leuA基因编码,在生物体内参与亮氨酸的合成。He等(InfluenceofisopropylmalatesynthaseOsIPMS1onseedvigourassociatedwithaminoacidandenergymetabolisminrice[J].YongqiHe,JinpingCheng,YingHe,BinYang,YanhaoCheng,CanYang,HongshengZhang,ZhoufeiWang.PlantBiotechnologyJournal.2019(2))基于蛋白质学信息，克隆了位于11号染色体上的α-异丙基苹果酸合酶基因OsIMPS1，并利用T-DNA与CRISPR/Cas9突变体材料，揭示其调控水稻种子活力作用机制。但现有技术的研究仅止步于该酶相关基因在水稻种子中的活力作用机制。由于烟草种子的基因序列、其中所含酶的表达，均与水稻种子不同，该酶的OsIMPS1表达，并不在烟草种子的表达中，且现有技术中并未见该酶相关基因在烟草种子老化监测和烟草种子活力评价中运用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测烟草种子老化程度的方法，用于解决现有技术中存在的无法准确快速评价种子活力的技术问题。

本申请提供了一种烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因在烟草种子老化程度检测中的应用，其特征在于，所述烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因为SEQIDNO.1。

本申请首先发现烟草种子中该酶的NtIPMS基因表达水平与烟草种子活力存在定量的关系，可用于快速检测烟草种子老化程度、定量评价烟草种子活力，提高检测效率，提高种子活力检测准确性。

优选地，烟草种子包括：烟草裸种和烟草包衣种子。

优选地，包括以下步骤：

分别获取待检测烟草种子、新鲜烟草种子中SEQIDNO.1的表达水平；

按下式获取待检测种子相对新鲜种子的基因表达水平倍数：待检测种子该基因表达水平/新鲜种子该基因表达水平＝基因表达水平倍数；

根据基因表达水平倍数评价待检测烟草种子活力。

优选地，当待检测烟草裸种中的表达相对新鲜烟草裸种中的表达水平上调大于等于4倍时，发芽指数下降大于等于50％，12天成苗率降低小于等于78.0％；当待检测烟草包衣种子中的表达相对新鲜烟草包衣种子中的表达水平上调大于等于2.2倍时，发芽指数下降大于等于26％，12天成苗率降低小于等于81.3％。

本申请中所述新鲜种子包括：新生产加工于17℃、相对含水量40％条件下贮藏1个月内的种子。

本申请首先研究发现可采用该引物对实现烟草种子中NtIPMS基因表达的荧光定量PCR分析。

优选地，烟草种子中，烟草异丙基苹果酸合酶基因NtIPMS检测所用引物对的上游引物如序列表SEQIDNO.2所示，下游引物如序列表SEQIDNO.3所示。采用烟草基因NtEF-1α作为内参基因，所述基因上游引物如序列表SEQIDNO.4所示，下游引物如序列表SEQIDNO.5所示。

通过实验研究发现，该基因序列在烟草种子中的表达，与种子活力存在该定量关系，根据该定量关系，可对烟草种子老化程度进行检测，定量评价种子活力。

本申请的另一方面还提供了一种基于烟草异丙基苹果酸合酶NTIPMS基因表达的烟草种子老化程度检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：将待测烟草种子和新鲜烟草种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，得到检测样品，检测样品贮存于-80℃下。烟草包衣种子需先在80目网袋中用清水清洗，获取其中的烟草裸种，快速吹干表面水份后制备检测样品。

步骤S2：检测待测烟草种子和新鲜烟草种子中如权利要求1～4中任一项所述的烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因SEQIDNO.1的表达水平；

步骤S3：获取待检测烟草种子相对新鲜种子的NtIPMS基因表达水平倍数，评价烟草种子活力。

采用该方法可检测烟草种子的老化程度，定量评价种子活力，提高种子检测效率，避免生产损失。

优选地，优选地，当待检测烟草裸种中的表达相对新鲜烟草裸种中的表达水平上调大于等于4倍时，发芽指数下降大于等于50％，12天成苗率降低小于等于78.0％；当待检测烟草包衣种子中的表达相对新鲜烟草包衣种子中的表达水平上调大于等于2.2倍时，发芽指数下降大于等于26％，12天成苗率降低小于等于81.3％。

优选地，步骤S2中包括以下步骤：提取待检测样品的RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板采用荧光定量PCR检测烟草中种子中SEQIDNO.1基因表达水平。

优选地，荧光定量PCR检测基因NtIPMS所用上游引物如序列表SEQIDNO.2所示，荧光定量PCR检测基因NtIPMS所用下游引物如序列表SEQIDNO.3所示。采用烟草基因NtEF-1α作为内参基因，所述基因上游引物如序列表SEQIDNO.4所示，下游引物如序列表SEQIDNO.5所示。

通过采用烟草基因NtEF-1α作为内参基因并配合所用引物对，能实现对烟草种子中该基因表达水平的准确检测。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因表达在烟草种子老化程度检测中的应用，通过检测不同老化程度种子中异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因表达情况，建立种子老化过程中基因表达与老化程度的关系，将基因作为分子标记应用于种子老化检测，从而有效监测贮藏过程中种子的老化程度。

2)本申请所提供的烟草异丙基苹果酸合酶NtIPMS基因表达在烟草种子老化程度检测中的应用，通过检测待测烟草种子和新鲜烟草种子的NTIPMS表达水平，获取二者该基因表达水平的变化率，从而快速准确的评价待检测种子活力。该方法检测效率高，可大幅缩短种子活力评价时间，尤其适用于紧急情况下的烟草种子活力评价。

附图说明

图1为本申请实施例1中种子试验示意图，其中A为各试验组照片；B为各试验组老化处理后的发芽指数与老化时间关系柱状图；C为各试验组老化处理后的12天成苗率与老化时间关系柱状图；

图2为本申请实施例2中不同老化时间种子中NTIPMS相对表达水平与老化时间关系图；

图3为本申请实施例3中包衣种子试验示意图，其中A为各试验组照片；B为各试验组老化处理后的发芽指数与老化时间关系柱状图；C为各试验组老化处理后的12天成苗率与老化时间关系柱状图；

图4为本申请实施例2中不同老化时间包衣种子中NTIPMS相对表达水平与老化时间关系图；

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

并不用于解决本申请技术问题的技术特征，均按现有技术中常用方法设置或安装，在此不累述。

实施例

以下实施例中各项仪器、原料如无特殊说明，均为商业渠道购入。

实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由天一辉远生物科技有限公司完成；实验中用到的各种酶及反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司，方法均参照说明书进行。

实施例1：烟草裸种不同老化时间活力比较

将MS云烟87品种的种子放到人工老化箱中，置于一层湿润滤纸上，在温度45℃、相对湿度100％条件下进行0d、3d、6d、8d的老化处理，得到对照组、第二老化种子组、第三老化种子组、第四老化种子组。

以对照组、第二老化种子组、第三老化种子组、第四老化种子组进行发芽试验。对对照组、第二老化种子组、第三老化种子组、第四老化种子组的种子，先用75％酒精浸泡30s，再用30％次氯酸钠浸泡10min，无菌水洗4-5次，再用无菌水浸泡10min，将种子表面擦干净置于垫有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入5mL蒸馏水，放置25℃(光照/黑暗各12h)光照培养箱培养中，统计每天的发芽和成苗数，试验处理后各组照片如图1A所示。以上试验对同一组种子重复3次。

结果表明，与对照组的新鲜种子相比，随着老化时间增加，种子活力逐渐降低(参见图1B、C)。裸种老化6天，发芽指数降低至9.79，降低了50％，12天成苗率降低至78.0％。裸种老化8天，种子的发芽指数降低至4.65，降低了76％，12天成苗率降低至37.3％。

实施例2：烟草裸种不同老化时间基因表达分析

分别取实施例1中所得对照组、第二老化种子组、第三老化种子组、第四老化种子组的种样。种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。试验重复3次。

用

结果表明，随着裸种老化时间的增加，种子中NtIPMS基因转录水平逐渐上升，所得结果参见图2。与新鲜种子比较，裸种老化6天的NtIPMS基因表达上调至14，上升了9.7倍。裸种老化8天的NtIPMS基因表达上调至28。

结合实例1中发现，老化处理6天的第三老化种子组，其NtIPMS基因表达上调至9.7倍时，种子发芽指数下降至10以下，比对照降低了50％。老化处理8天的第四老化种子组，其NtIPMS基因表达上调19.5倍时，种子发芽指数下降至4.65，比对照降低了76％。

可见，该NtIPMS基因表达可作为烟草裸种老化程度的分子标记，通过检测该基因在裸种老化过程中的表达情况，并与新鲜种子的表达情况进行比较，得到二者定量的关系：该基因上调大于等于9.7倍时，发芽指数显著下降大于等于50％，12天成苗率显著降低小于等于78.0％。

实施例3：烟草包衣种子不同老化时间活力比较

将MS云烟87品种催芽包衣种子放到人工老化箱中，置于2层湿润滤纸上，在温度47℃、相对湿度100％条件下进行0d、1d、2d、3d的老化处理，得到对照组、第五老化种子组、第六老化种子组、第七老化种子组。

以对照组、第五老化种子组、第六老化种子组、第七老化种子组进行发芽试验。将种子置于垫有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入10mL蒸馏水，放置25℃(光照/黑暗各12h)光照培养箱培养中，统计每天的发芽和成苗数，试验处理后各组照片如图3A所示。以上试验对同一组种子重复3次。

结果表明，与对照组包衣种子比较，随着老化时间的增加，种子活力逐渐降低(参见图3B、C)。包衣种子老化1天，发芽指数降低至13.90，降低了26％，12天成苗率降低至81.3％。包衣种子老化2天，发芽指数降低至11.68，降低了38％，12天成苗率降低至70.0％。包衣种子老化3天，发芽指数降低至7.81，降低了58％，12天成苗率降低至53.0％。

实施例4：烟草包衣种子不同老化时间基因表达分析

分别取实施例3中所得对照组、第五老化种子组、第六老化种子组、第七老化种子组的包衣种子样品。在80目网袋中用清水清洗包衣种子，获取其中的烟草裸种，快速吹干表面水份后，经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。试验重复3次。

用

结果表明，随着包衣种子老化时间的增加，种子中NtIPMS基因转录水平逐渐上升(参见图4)。与对照比较，包衣种子老化处理1天的第七老化种子组的NtIPMS基因表达上调至2.21，上升了2.2倍。包衣种子老化处理2天的第七老化种子组的NtIPMS基因表达上调至2.44，上升了2.4倍。包衣种子老化处理2天的第七老化种子组的NtIPMS基因表达上调至3.94，上升了3.9倍。

结合实例3中发现，该NtIPMS基因表达可作为烟草包衣种子老化程度的分子标记，通过检测该基因在包衣种子老化过程中的表达情况，并与新鲜种子的表达情况进行比较，得到二者定量的关系：当老化种子中NtIPMS基因表达上调大于等于2.2倍，发芽指数显著下降大于等于26％，12天成苗率显著降低小于等于81.3％。

实施例5烟草裸种老化程度检测方法

采集待检测烟草裸种、新鲜种子作为待测种子，将待测种子和新鲜种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，得到检测样品，检测样品贮存于-80℃下。试验重复3次。

用

得到待检测烟草裸种、新鲜种子中NtIPMS基因表达水平，按下式获取待检测烟草种子相对新鲜种子的NtIPMS基因表达水平倍数：

基因表达水平倍数＝待检测种子基因表达水平/新鲜种子基因表达水平。

按上述方法，MS云烟87品种的种子收获入库后，于17℃、相对含水量40％条件下贮藏，在贮藏1个月内检测NtIPMS基因表达水平；对MS云烟87品种的待检测种子NtIPMS基因表达水平进行检测，并获取待检测种子相对新鲜种子的基因表达水平倍数。

本实施例中，待检测种子NtIPMS基因表达水平为新鲜种子基因表达水平的19.5倍时，待检测种子发芽指数下降至4.65，12天成苗率降低至37.3％。

采用本申请提供方法可实现对烟草裸种活力的快速评价。

实施例6烟草包衣种子老化程度检测方法

重复实施例5，不同点在于：烟草包衣种子需先在80目网袋中用清水清洗，获取其中的烟草裸种，快速吹干表面水份。

本实施例中，MS云烟87待检测包衣种子NtIPMS基因表达水平为新鲜包衣种子基因表达水平的2.44倍时，待检测包衣种子发芽指数降低至11.68，12天成苗率降低至70.0％。

采用本申请提供方法可实现对烟草包衣种子活力的快速评价。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。