多细胞组分与肿瘤类器官共培养模型的构建方法

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多细胞组分与肿瘤类器官共培养模型的构建方法，所述构建方法为将肿瘤类器官、血液白细胞和肿瘤相关成纤维细胞用培养基共培养。本发明将多细胞组分与肿瘤类器官共培养，所述多细胞组分中含有血液白细胞，其与肿瘤相关成纤维细胞相互作用影响下，促进肿瘤类器官的生长和发展，对肿瘤微环境进行还原。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多细胞组分与肿瘤类器官共培养模型的构建方法。

背景技术

类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3D结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养形成的、与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，故与诸多临床前模型如2D细胞系、PDX模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。

肿瘤细胞与其所处的微环境是一个功能整体，肿瘤细胞看做是种子，而肿瘤细胞所处的微环境看做是土壤，肿瘤细胞与其微环境相互影响，共同进化，促进了肿瘤的产生。目前利用肿瘤类器官进行肿瘤微环境的还原是非常受欢迎的研究方向。中国发明专利CN115094022A公开了一种肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法，通过分离肺癌患者来源的肺癌成纤维细胞和肿瘤细胞，或者正常肺组织来源的肺成纤维细胞和肺泡细胞，建立快速、简单、有效的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养、肺成纤维细胞-肺类器官共培养技术，从而模拟患者真实的病理状态。然而，由于肿瘤具有高度复杂性和异质性，难以仅通过肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤细胞的相互作用还原肿瘤的组织微环境。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种多细胞组分与肿瘤类器官共培养模型的构建方法。将多细胞组分与肿瘤类器官共培养，促进肿瘤类器官的生长和发展，对肿瘤微环境进行还原。

为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种多细胞组分与肿瘤类器官共培养模型的构建方法，将肿瘤类器官、血液白细胞和肿瘤相关成纤维细胞用培养基共培养。

进一步的，所述共培养模型中肿瘤类器官的细胞数为1×10

进一步的，所述培养基的为常规的肿瘤类器官培养基。所用的肿瘤类器官培养基可根据肿瘤的种类进行选择调整。

进一步的，所述共培养的培养时间为3-28天。

进一步的，所述肿瘤类器官包括但不限于肺癌类器官、前列腺癌类器官、子宫内膜癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、卵巢癌、胶质瘤、宫颈癌和肠癌类器官；所述肿瘤相关成纤维细胞与所采用的肿瘤类器官相对应，即肿瘤类器官为肺癌类器官时，肿瘤相关成纤维细胞即为肺癌相关成纤维细胞，以此类推。

进一步的，所述肿瘤类器官的培养方法为；将获得的肿瘤标本经过预处理得到细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20-30min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

优选的，所述预处理包括将肿瘤标本处理成1-10mm

优选的，所述细胞团的细胞数量为20-200个。

进一步的，所述血液白细胞的提取方法为：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于2-8℃静置40-120min后吸取上清液；将上清液加到缓冲液中，再于2-8℃，500g离心20-60min后留沉淀；使用缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中。

进一步的，所述缓冲液为PBS+Tris+HEPES缓冲液。

进一步的，所述肿瘤相关成纤维细胞的提取方法为：去除肿瘤组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肿瘤相关成纤维细胞。

本发明的有益效果为：

本发明将多细胞组分与肿瘤类器官共培养，所述多细胞组分中含有血液白细胞，其与肿瘤相关成纤维细胞相互作用影响下，促进肿瘤类器官的生长和发展，对肿瘤微环境进行还原。

附图说明

图1是实施例1共培养模型获得的肺癌类器官光镜图；

图2是实施例2共培养模型获得的前列腺癌类器官光镜图；

图3是实施例3共培养模型获得的子宫内膜癌类器官光镜图；

图4是实施例4共培养模型获得的胃癌类器官光镜图；

图5是实施例5共培养模型获得的肝癌类器官光镜图；

图6是实施例6共培养模型获得的肠癌类器官光镜图；

图7是实施例1和对比例1培养的共培养模型SMA表达量的数据图；

图8是实施例1和对比例2培养的共培养模型CD45表达量的数据图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例采用的葡聚糖Dextran T-500，购自上海生工。

本发明实施例采用的PBS溶液，购自上海生工。

本发明实施例采用的Tris，购自上海生工。

本发明实施例采用的HEPES，购自上海生工。

本发明实施例采用的HBSS，购自上海生工。

本发明实施例采用的DMEM，购自Gibco。

本发明实施例采用的Matrigel，购自Corning。

本发明实施例采用的类器官培养基，购自Stemcell和Accurate InternationalBiotechnology。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种多细胞组分与肺癌类器官共培养模型的构建方法，将肺癌类器官、血液白细胞和肺癌相关成纤维细胞用培养基共培养。具体方法为：

步骤1、肺癌类器官的培养：将获得的肺癌标本经过预处理得到细胞数量为50个的细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

步骤2、血液白细胞的提取：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于4℃静置40min后吸取上清液；将上清液加到PBS+Tris+HEPES缓冲液中，再于4℃，500g离心25min后留沉淀；使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中；

步骤3、肺癌相关成纤维细胞的提取：去除肺癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肺癌相关成纤维细胞；

步骤4、将步骤1获得的肺癌类器官、步骤2获得的血液白细胞和步骤3获得的肺癌相关成纤维细胞分别加入到4mL培养基中，其中肺癌类器官的细胞数为1×10

实施例2

一种多细胞组分与前列腺癌类器官共培养模型的构建方法，将前列腺癌类器官、血液白细胞和前列腺癌相关成纤维细胞用培养基共培养。具体方法为：

步骤1、前列腺癌类器官的培养：将获得的前列腺癌标本经过预处理得到细胞数量为100个的细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定30min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

步骤2、血液白细胞的提取：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于4℃静置40min后吸取上清液；将上清液加到PBS+Tris+HEPES缓冲液中，再于4℃，500g离心25min后留沉淀；使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中；

步骤3、前列腺癌相关成纤维细胞的提取：去除前列腺癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得前列腺癌相关成纤维细胞；

步骤4、将步骤1获得的前列腺癌类器官、步骤2获得的血液白细胞和步骤3获得的前列腺癌相关成纤维细胞分别加入到2mL培养基中，其中前列腺癌类器官的细胞数为1×10

实施例3

一种多细胞组分与子宫内膜癌类器官共培养模型的构建方法，将子宫内膜癌类器官、血液白细胞和子宫内膜癌相关成纤维细胞用培养基共培养。具体方法为：

步骤1、子宫内膜癌类器官的培养：将获得的子宫内膜癌标本经过预处理得到细胞数量为60个的细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定30min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

步骤2、血液白细胞的提取：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于4℃静置40min后吸取上清液；将上清液加到PBS+Tris+HEPES缓冲液中，再于4℃，500g离心25min后留沉淀；使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中；

步骤3、子宫内膜癌相关成纤维细胞的提取：去除子宫内膜癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得子宫内膜癌相关成纤维细胞；

步骤4、将步骤1获得的子宫内膜癌类器官、步骤2获得的血液白细胞和步骤3获得的子宫内膜癌相关成纤维细胞分别加入到4mL培养基中，其中子宫内膜癌类器官的细胞数为6×10

实施例4

一种多细胞组分与胃癌类器官共培养模型的构建方法，将胃癌类器官、血液白细胞和胃癌相关成纤维细胞用培养基共培养。具体方法为：

步骤1、胃癌类器官的培养：将获得的胃癌标本经过预处理得到细胞数量为160个的细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定30min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

步骤2、血液白细胞的提取：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于4℃静置40min后吸取上清液；将上清液加到PBS+Tris+HEPES缓冲液中，再于4℃，500g离心25min后留沉淀；使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中；

步骤3、胃癌相关成纤维细胞的提取：去除胃癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得胃癌相关成纤维细胞；

步骤4、将步骤1获得的胃癌类器官、步骤2获得的血液白细胞和步骤3获得的胃癌相关成纤维细胞分别加入到8mL培养基中，其中胃癌类器官的细胞数为1×10

实施例5

一种多细胞组分与肝癌类器官共培养模型的构建方法，将肝癌类器官、血液白细胞和肝癌相关成纤维细胞用培养基共培养。具体方法为：

步骤1、肝癌类器官的培养：将获得的肝癌标本经过预处理得到细胞数量为30个的细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定30min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

步骤2、血液白细胞的提取：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于4℃静置40min后吸取上清液；将上清液加到PBS+Tris+HEPES缓冲液中，再于4℃，500g离心25min后留沉淀；使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中；

步骤3、肝癌相关成纤维细胞的提取：去除肝癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肝癌相关成纤维细胞；

步骤4、将步骤1获得的肝癌类器官、步骤2获得的血液白细胞和步骤3获得的肝癌相关成纤维细胞分别加入到8mL培养基中，其中肝癌类器官的细胞数为5×10

实施例6

一种多细胞组分与肠癌类器官共培养模型的构建方法，将肠癌类器官、血液白细胞和肠癌相关成纤维细胞用培养基共培养。具体方法为：

步骤1、肠癌类器官的培养：将获得的肠癌标本经过预处理得到细胞数量为50个的细胞团；将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定30min；加入类器官培养基，于37℃、5％ CO

步骤2、血液白细胞的提取：将全血与葡聚糖Dextran T-500混匀后，置于4℃静置40min后吸取上清液；将上清液加到PBS+Tris+HEPES缓冲液中，再于4℃，500g离心25min后留沉淀；使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗，随后加入裂红试剂，用HBSS清洗并重悬于DMEM中；

步骤3、肠癌相关成纤维细胞的提取：去除肠癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制备成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗后将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100μm滤膜过滤，将过滤后物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肠癌相关成纤维细胞；

步骤4、将步骤1获得的肠癌类器官、步骤2获得的血液白细胞和步骤3获得的肠癌相关成纤维细胞分别加入到6mL培养基中，其中肠癌类器官的细胞数为1×10

对比例1

一种多细胞组分与肺癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例1的区别在于不含有血液白细胞，其余均相同。

对比例2

一种多细胞组分与肺癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例1的区别在于不含有肺癌相关成纤维细胞，其余均相同。

对比例3

一种多细胞组分与前列腺癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例2的区别在于不含有血液白细胞，其余均相同。

对比例4

一种多细胞组分与前列腺癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例2的区别在于不含有前列腺癌相关成纤维细胞，其余均相同。

对比例5

一种多细胞组分与子宫内膜癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例3的区别在于不含有血液白细胞，其余均相同。

对比例6

一种多细胞组分与胃癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例4的区别在于不含有血液白细胞，其余均相同。

对比例7

一种多细胞组分与肝癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例5的区别在于不含有血液白细胞，其余均相同。

对比例8

一种多细胞组分与肠癌类器官共培养模型的构建方法，与实施例6的区别在于不含有血液白细胞，其余均相同。

实验数据

图7为肺癌类器官单独培养体系(PDO)、实施例1以及对比例1培养得到的类器官SMA表达量的数据图。如图7所示，与PDO单独培养体系和对比例1(PDO+CAF)相比，实施例1(PDO+CAF+白细胞)中成纤维细胞marker表达SMA表达量有所上调，说明本发明共培养模型中加入血液白细胞有利于激活并维持成纤维细胞活性。

图8为肺癌类器官单独培养体系(PDO)、实施例1以及对比例2(PDO+白细胞)培养得到的类器官CD45表达量的数据图。如图8所示，与PDO单独培养体系和对比例2(PDO+血液白细胞)相比，实施例1中CD45标记的T细胞有所上调，说明本发明共培养模型中加入肿瘤相关成纤维细胞有利于激活T细胞。

通过流式细胞仪检测实施例2和对比例3、对比例4得到的前列腺癌类器官细胞活性，实施例2活性为85％，对比例3为57％，对比例4为62％。说明本发明共培养模型中加入的血液白细胞和肿瘤相关成纤维细胞有利于维持前列腺癌类器官的活性。

通过流式细胞仪检测实施例3、对比例5的子宫内膜癌类器官活性和子宫内膜癌成纤维细胞活性。实施例3中子宫内膜癌细胞活性为89％，成纤维细胞活性81％，而对比例5中子宫内膜癌细胞活性为68％，成纤维细胞活性57％。说明本发明共培养模型中加入的血液白细胞有利于维持子宫内膜癌类器官的活性。

通过流式细胞仪检测实施例4、对比例6的胃癌类器官活性和胃癌成纤维细胞活性。实施例4中胃癌细胞活性为78％，成纤维细胞活性75％，而对比例6中胃癌细胞活性为51％，成纤维细胞活性43％。说明本发明共培养模型中加入的血液白细胞有利于维持胃癌类器官的活性。

通过流式细胞仪检测实施例5、对比例7的肝癌类器官活性和肝癌成纤维细胞活性。实施例5中肝癌细胞活性为92％，成纤维细胞活性81％，而对比例7中肝癌细胞活性为77％，成纤维细胞活性58％。说明本发明共培养模型中加入的血液白细胞有利于维持肝癌类器官的活性。

通过流式细胞仪检测实施例6、对比例8的肠癌类器官活性和肠癌成纤维细胞活性。实施例6中肠癌细胞活性为78％，成纤维细胞活性64％，而对比例8中肠癌细胞活性为53％，成纤维细胞活性42％。说明本发明共培养模型中加入的血液白细胞有利于维持肠癌类器官的活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。