一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型及其构建方法

摘要

本发明涉及一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型的构建方法，步骤包括：分别收集结直肠癌类器官与肝脏类器官，离心后弃去上清，并尽量吸去基质胶；分别加入消化液，于室温消化完成后，离心并弃去上清，进行细胞计数；按1:1的细胞数目比例将所述结直肠癌类器官与所述肝脏类器官混合，采用基质胶重悬后，滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；将所述24孔板置于培养箱内孵育，完成后每孔加入结直肠癌类器官培养基以及肝脏类器官培养基，再置于培养箱内培养。本发明的结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型可在体外模拟体内3D生长环境，能够更加真实反映机体功能，从而研究肠癌肝转移的病理过程及发生机制。

说明书

技术领域

本发明涉及类器官技术领域，尤其涉及一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型及其构建方法。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球排名第三位的常见癌种，全球每年约100万人被诊断为结直肠癌。其中，50％以上患者会发生结直肠癌肝转移(celorectalliver metastases，CLM)。目前，手术切除转移灶是CLM的主要治疗手段，术后化疗能够延长几个月的生存期，不接受任何治疗的生存期仅为6-9个月。研究肠癌肝转移的病理过程及发生机制是本领域的研究热点，然而传统基于肠癌肿瘤细胞系研究其肝转移的发生发展过程，并不能如实反映机体内环境。类器官技术可在体外模拟体内3D生长环境，与传统二维培养系统相比，能够更加真实反映机体功能，并且与原发肿瘤灶基因突变类型高度一致。

因此，亟需一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型及其构建方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型的构建方法，步骤包括：

S1、分别收集结直肠癌类器官与肝脏类器官，离心后弃去上清，并尽量吸去基质胶；分别加入消化液，于室温消化完成后，离心并弃去上清，进行细胞计数；

S2、按1:1的细胞数目比例将所述结直肠癌类器官与所述肝脏类器官混合，采用基质胶重悬后，滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；

S3、将所述24孔板置于培养箱内孵育，完成后每孔加入结直肠癌类器官培养基以及肝脏类器官培养基，再置于培养箱内培养。

优选地，所述结直肠癌类器官的构建步骤包括：

A1、将结直肠癌组织置于含有青霉素或/和链霉素的PBS缓冲液中清洗后，采用无菌器械将所述结直肠癌组织切成碎块，并置于含冰PBS缓冲液的离心管内，离心后弃去上清；

A2、加入组织消化液重悬，剧烈震荡并置于冰上孵育后，将其中的上清液经滤网过滤至离心管以获得滤液，同时富集腺体碎块；

A3、取所述滤液，离心后弃去上清，并采用结直肠癌类器官培养基重悬后细胞计数；

A4、将细胞悬液转移至EP管内，离心后弃去上清，并将所述EP管置于冰上；采用已预冷的枪头吸取适量的液态温敏型基质胶至所述EP管中，并吹吸十次，此过程中应避免气泡的产生；

A5、将细胞与基质胶的混合液滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；

A6、将所述24孔板置于培养箱孵育后，每孔分别加入结直肠癌类器官培养基，再置于培养箱培养。

优选地，所述肝脏类器官的构建步骤包括：

B1、将肝脏组织置于含有青霉素或/和链霉素的PBS缓冲液中清洗后，采用无菌器械将所述肝脏组织切成碎块，并置于含冰PBS缓冲液的离心管内，离心后弃去上清；

B2、加入组织消化液重悬，剧烈震荡并置于冰上孵育后，将其中的上清液经滤网过滤至离心管以获得滤液；

B3、取所述滤液，离心后弃去上清，并采用肝脏类器官培养基重悬后细胞计数；

B4、将细胞悬液转移至EP管内，离心后弃去上清，并将所述EP管置于冰上；采用已预冷的枪头吸取适量的液态温敏型基质胶至所述EP管中，并吹吸十次，此过程中应避免气泡的产生；

B5、将细胞与基质胶的混合液滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；

B6、将所述24孔板置于培养箱孵育后，每孔分别加入肝脏类器官培养基，再置于培养箱培养。

优选地，每孔分别加入350μL结直肠癌类器官培养基以及350μL肝脏类器官培养基。

优选地，所述碎块为2-4mm

优选地，所述碎块为0.5-1mm

优选地，所述滤网为100μm的滤网。

优选地所述液态温敏型基质胶加入的比例为每20000个细胞需加入50μL所述液态温敏型基质胶。

本发明的第二方面是提供一种采用如上所述构建方法所得到的结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型可在体外模拟体内3D生长环境，能够更加真实反映机体功能，从而研究肠癌肝转移的病理过程及发生机制。

附图说明

图1为结直肠癌类器官与正常肝脏类器官共培养，其中a为单独肝脏类器官光镜下形态；b为肝脏类器官与结直肠癌类器官共培养光镜下形态；c为单独肝脏类器官HE染色；d为肝脏类器官与结直肠癌类器官共培养HE染色；e为单独肝脏类器官Ki-67染色；f为肝脏类器官与结直肠癌类器官共培养Ki-67染色；

图2为结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养一周后CDX-2表达情况，其中左侧箭头所指为正常肝脏类器官，右侧箭头所指为结直肠癌类器官，颗粒代表CDX-2蛋白表达量；

图3为单独肝脏类器官、单独结直肠癌类器官、共培养后肝脏类器官及共培养后结直肠癌类器官CDX-2蛋白表达情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

本实施例提供一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型，其构建方法包括：

(1)构建结直肠癌类器官：

A1、将结直肠癌组织置于含有1％青霉素或/和链霉素的5mL PBS缓冲液中清洗2次后，采用无菌器械将所述结直肠癌组织切成2-4mm

A2、加入5mL组织消化液(stemcell，cat：07174)重悬，剧烈震荡并置于冰上孵育30min后，将其中的上清液经100μm滤网过滤至50mL离心管以获得滤液，同时富集腺体碎块；

A3、取1mL所述滤液，190g离心5min后弃去上清，并采用1mL人结直肠癌类器官培养基(Stemcell，06010)重悬后细胞计数；

A4、将细胞悬液转移至EP管内，190g离心5min后弃去上清，并将所述EP管置于冰上；采用已预冷的枪头吸取适量(即50μL液态温敏型Matrigel基质胶/20000个细胞)4℃液态温敏型Matrigel基质胶至所述EP管中，并吹吸十次，此过程中应避免气泡的产生；

A5、将细胞与基质胶的混合液以每孔50μL滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；

A6、将所述24孔板置于37℃，5％CO

(2)构建肝脏类器官：

B1、将肝脏组织置于含有1％青霉素或/和链霉素的5mL PBS缓冲液中清洗2次后，采用无菌器械将所述肝脏组织切成0.5-1mm

B2、加入5mL组织消化液(stemcell，cat：07174)重悬，剧烈震荡并置于冰上孵育30min后，将其中的上清液经100μm滤网过滤至50mL离心管以获得滤液；

B3、取1mL所述滤液，190g离心5min后弃去上清，并采用1mL人肝脏类器官培养基(创芯国际生物科技公司，M201)重悬后细胞计数；

B4、将细胞悬液转移至EP管内，190g离心5min后弃去上清，并将所述EP管置于冰上；采用已预冷的枪头吸取适量(即50μL液态温敏型Matrigel基质胶/20000个细胞)4℃液态温敏型Matrigel基质胶至所述EP管中，并吹吸十次，此过程中应避免气泡的产生；

B5、将细胞与基质胶的混合液以每孔50μL滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；

B6、将所述24孔板置于37℃，5％CO

(3)构建结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型

S1、分别收集培养好的结直肠癌类器官与肝脏类器官，离心后弃去上清，并尽量吸去基质胶；分别加入2mL TrypLE

S2、按1:1的细胞数目比例将所述结直肠癌类器官与所述肝脏类器官混合，采用基质胶重悬后，以每孔50μL滴加至已预热的24孔板上，凝胶在遇热后迅速转变为果冻状；

S3、将所述24孔板置于37℃，5％CO

如图1所示，正常肝脏类器官在与结直肠癌类器官共培养1周后，体积增大，且标记细胞增殖的Ki-67表达水平增强；如图2所示，结直肠癌类器官高表达CDX-2蛋白，正常肝脏类器官在与结直肠癌类器官共培养1周后，也开始显著表达CDX-2，提示肝脏类器官受结直肠癌类器官影响；如图3所示，单独的正常肝脏类器官并不表达CDX-2，与结直肠癌类器官共培养1周后，受肠癌类器官的影响，亦高表达CDX-2，进一步验证图2的结果。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。