一种通过调节肠-脑轴改善由环境污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用

摘要

本发明涉及一种通过调节肠‑脑轴改善由环境污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株。本发明创造性地发现BL21菌株具有显著地改善由环境污染引起的精神类疾病的功效，具体表现在：改善环境污染小鼠模型的肝脏氧化代谢水平、改善因环境污染导致焦虑和抑郁样小鼠症状、改善环境污染小鼠模型的血清皮质酮含量，改善机体激素水平、改善环境污染小鼠模型的血清TNF‑α、IL‑6与IL‑10细胞因子水平、改善脑神经递质5‑HT和多巴胺含量。因此，将其用于制备用于预防、缓解或治疗情绪调节相关的产品具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种通过调节肠-脑轴改善由环境污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用，尤其涉及一种通过调节肠-脑轴改善由重金属污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用。

背景技术

随着工业和科技的进步，各种环境污染物的产生大大增加。尽管污染对公众健康的影响有据可查，但人们对环境污染物、肠道菌群失调和心理健康之间的联系知之甚少。人类在日常生活中会接触到各种各样的污染物，如邻苯二甲酸盐、重金属、双酚A和空气颗粒物等，这些污染物已被确定为具有神经毒性，它们会影响我们的肠道微生物群并操纵肠道和大脑之间的双向交流，从而导致精神或神经系统疾病的易感性，影响我们整体的神经和心理健康。有研究指出，暴露于环境污染物可能是抑郁、焦虑的重要可改变风险因素，例如，对突触传递、多巴胺能系统、糖皮质激素信号和下丘脑-垂体轴的影响都可能是潜在的干扰机制。

近年来，微生物群一直是研究的重点，以发现神经健康与肠道菌群失调之间缺失的联系。人体肠道中超过98％的细菌来自四个门，拟杆菌、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门，构成了微生物组的复杂性和多样性。微生物群与中枢神经系统之间的参与主要由神经、激素和免疫途径介导，这些途径都是相互关联的。微生物可以通过迷走神经双向影响中枢神经系统，通过免疫系统调节HPA轴的活性，包括糖皮质激素的血浆水平，色氨酸代谢，神经递质和神经营养因子的产生、表达和转换，以及具有神经活性特性的代谢物的产生，例如短链脂肪酸SCFA。短链脂肪酸可调节神经营养因子的水平，促进神经发生，影响胶质细胞形态和功能，促进血清素形成并改善神经元稳态和功能，可以直接或间接地改变认知、情绪和精神障碍的病理生理学。微生物群-肠-脑轴的存在表明，通过不同的环境污染物，肠道微生物组成和数量会发生变化，影响中枢神经系统和肠神经系统。暴露于环境污染物引起的肠道菌群失调可能是影响大脑正常功能的直接因素，并导致抑郁、焦虑和情绪障碍等心理健康问题。

CN114081184A公开了一种具有预防抑郁和焦虑行为形成的益生菌剂及其应用，其提供的植物乳杆菌Lp3a、副干酪乳杆菌LPC45和短双歧杆菌BB033这3株菌可以产生神经递质或其前体物质，这些物质能使人产生愉悦情绪，并且低聚半乳糖和低聚异麦芽糖促进有益菌的增殖，使其产生使人愉悦的神经递质，同时益生菌组合物和功能性物质又都可以调节肠道健康，相辅相成，从而达到调节人体情绪的目的，进一步提高了改善抑郁、焦虑症状的作用效果。CN109310717A公开了一种包含益生菌的组合物，所述益生菌选自乳酸乳球菌以及长双歧杆菌与鼠李糖乳杆菌的组合，优选地为乳酸乳球菌菌株或鼠李糖乳杆菌LPR菌株与长双歧杆菌BL999菌株的组合，所述组合物用于预防和/或治疗哺乳动物的焦虑症及相关病症，例如长期应激、抑郁症和情绪调节。

使用益生菌控制肠道微生物群是一种有效的治疗或预防措施，可以抵消行为和认知缺陷，或许可作为一种调控肠脑轴，改善抑郁、焦虑和失眠等神经疾病的新作用靶点，是一种非常健康的治疗方案，具有广阔的市场应用前景。因此，开发出更多的益生菌产品，用以改善失眠、焦虑、抑郁等神经疾病是很有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种通过调节肠-脑轴改善由环境污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用，尤其提供一种通过调节肠-脑轴改善由重金属污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种通过调节肠-脑轴改善由环境污染引起的精神类疾病的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株。

本发明创造性地发现保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21菌株具有显著地改善由环境污染引起的精神类疾病的功效，具体表现在：(1)显著改善环境污染小鼠模型的肝脏氧化代谢水平；(2)显著改善因环境污染导致焦虑和抑郁样小鼠症状；(3)显著改善环境污染小鼠模型的血清皮质酮含量，改善机体激素水平；(4)显著改善环境污染小鼠模型的血清TNF-α、IL-6与IL-10细胞因子水平；(5)参与机体肠脑轴调控，改善脑神经递质5-HT和多巴胺含量。因此，将其用于制备用于预防、缓解或治疗情绪调节相关的产品具有很好的应用前景。

另外，长双歧杆菌是益生菌，因此其在用于制备预防、缓解或治疗情绪调节相关的产品时，安全性高，且不易产生抗药性。

优选地，所述精神类疾病包括焦虑症、抑郁症、失眠。

优选地，所述环境污染包括重金属污染。

优选地，在益生菌剂中，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株的活菌数不低于5×10

优选地，所述益生菌剂中的菌株还包括保藏编号为CGMCC No.24411的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC24菌株。

本发明还创造地发现将保藏编号为CGMCC No.24411的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC24菌株与前述保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株进行复配，两者能够相互配合、相互促进，在改善由环境污染引起的精神类疾病的功效上协同增效。相较于单菌使用，两种的组合方式在上述功效上更加显著，获得了本领域技术人员难以预见的技术效果，为改善由环境污染引起的精神类疾病提供了新的策略。

另外，副干酪乳杆菌是益生菌，因此其在用于制备预防、缓解或治疗情绪调节相关的产品时，安全性高，且不易产生抗药性。

优选地，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC24菌株的活菌数之比为1:5-5:1，例如1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

当两种菌株以上述特定的配比方式进行复合时，其在改善由环境污染引起的精神类疾病的功效上更加显著，即在下述功效上的效果更加显著：(1)改善环境污染小鼠模型的肝脏氧化代谢水平；(2)改善因环境污染导致焦虑和抑郁样小鼠症状；(3)改善环境污染小鼠模型的血清皮质酮含量，改善机体激素水平；(4)改善环境污染小鼠模型的血清TNF-α、IL-6与IL-10细胞因子水平；(5)改善脑神经递质5-HT和多巴胺含量。

优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：

将长双歧杆菌BL21菌株或副干酪乳杆菌LC24菌株接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，即得；或者再按比例将二者复配得到。

优选地，所述培养基包括MRS培养基。

优选地，所述MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏8-12g/L、葡萄糖15-25g/L、乙酸钠1-3g/L、酵母粉3-7g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、K

优选地，所述冻干采用真空冷冻法。

优选地，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或功能助剂。

优选地，所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

上述功能助剂即益生元能够配合菌株发挥作用，从而进一步地提高益生菌剂在改善由环境污染引起的精神类疾病上的效果。

第二方面，本发明提供根据第一方面所述的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗由环境污染引起的精神类疾病的药物中的应用。

第三方面，本发明提供根据第一方面所述的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗由重金属污染引起的焦虑症或抑郁症的药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地发现保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21菌株具有显著地改善由环境污染引起的精神类疾病的功效，具体表现在：(1)显著改善环境污染小鼠模型的肝脏氧化代谢水平；(2)显著改善因环境污染导致焦虑和抑郁样小鼠症状；(3)显著改善环境污染小鼠模型的血清皮质酮含量，改善机体激素水平；(4)显著改善环境污染小鼠模型的血清TNF-α、IL-6与IL-10细胞因子水平；(5)参与机体肠脑轴调控，改善脑神经递质5-HT和多巴胺含量。因此，将其用于制备用于预防、缓解或治疗情绪调节相关的产品具有很好的应用前景。

本发明还创造地发现将保藏编号为CGMCC No.24411的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC24菌株与前述保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株进行复配，两者能够相互配合、相互促进，在改善由环境污染引起的精神类疾病的功效上协同增效。相较于单菌使用，两种的组合方式在上述功效上更加显著，获得了本领域技术人员难以预见的技术效果，为改善由环境污染引起的精神类疾病提供了新的策略。

附图说明

图1是各组小鼠在张开臂和闭合臂中花费的时间统计结果图；

图2是各组小鼠游泳过程的不动时间统计结果图；

图3是各组小鼠荧光染料DHE检测肝脏中活性氧ROS水平结果图；

图4是各组小鼠血清皮质酮浓度统计结果图；

图5是各组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平统计结果图；

图6是各组小鼠大脑前额皮质组织中血清素5-HT和多巴胺含量统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖25g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K

下述实施例所涉及的长双歧杆菌命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longumBL21菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述实施例所涉及的副干酪乳杆菌命名为副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei LC24菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年02月21日，保藏编号为CGMCC No.24411，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述实施例中涉及的菌悬液：将各菌株分别接种于脱脂乳中，37℃下培养18h进行活化，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h，得到菌液；稀释即得。

实施例

本实施例研究益生菌剂对重金属砷污染小鼠模型的肝脏活性氧ROS水平、血清皮质酮含量、血清细胞因子、血清素5-HT和多巴胺含量、焦虑样行为、抑郁样行为的调节作用：

(1)动物分组、建立重金属砷污染小鼠模型、给药方式：

健康C57BL/6雄性小鼠(约6周龄)由上海实验动物中心提供，并给予小鼠常规颗粒状啮齿动物饮食和纯净水。所有涉及小鼠的程序均符合上海市实验动物护理与动物实验中心提供的指导原则(许可证号2022122004)。

总共50只小鼠(10只小鼠/组，体重20±3g)，温度23-25℃，湿度50-70％环境下被安置在经过热处理的硬木床上用品的静态微隔离器笼子中，12h光照/黑暗循环。每周一和周四将亚砷酸钠(Fisher Scientific，MA，As 10ppm)在饮用水中给予小鼠4周(约8周龄)，建立模型组；对照组(CTL组)小鼠只接受纯净水；益生菌BL21干预组(BL21组)小鼠在给予含砷水的基础上还每天给予BL21菌液(1×10

(2)给药四周后，采用高架十字迷宫测试小鼠焦虑行为：高架十字迷宫由两条闭合臂和两条张开臂组成(高45cm；全臂长66cm；臂宽10cm；闭合臂壁高30cm)。小鼠被放置在中心臂交叉区域(10×10cm

统计结果如图1所示，由图可知：与CTL组相比，MC组小鼠在闭合臂中停留的时间显著延长，即MC组小鼠出现了焦虑情绪，经过益生菌BL21干预后，焦虑小鼠的症状有所缓解，且复合菌干预的缓解程度更加显著，表现在小鼠进入闭合臂中停留的时间显著缩短了；相反MC组小鼠在张开臂中停留的时间显著缩短了，说明重金属污染小鼠出现了焦虑样神经问题，但在益生菌BL21干预后焦虑情绪显著缓解，且复合菌干预的缓解程度更加显著(图中数据使用R语言(R 4.2.2)ggplot2函数进行统计分析，与模型组MC组相比，***代表p<0.0001，**代表p<0.001，*代表p<0.05)。

(3)给药四周后，采用强迫游泳测试(FST)评估小鼠抑郁样行为：第一天将小鼠放入盛有深15cm水(25℃)的透明亚克力圆筒(高30cm；内径10cm)中游泳6min；游泳后，用纸巾擦干小鼠并放回它们的笼子里；第二天，小鼠进行了第二次游泳5min；游泳过程由摄像机记录，行为由EthoVision视频跟踪软件分析。记录小鼠游泳过程的不动时间。

统计结果如图2所示，由图可知：与CTL组比较，MC组小鼠游泳过程的不动时间延长，出现了抑郁症状，即重金属砷污染会引起小鼠出现抑郁样精神疾病，但经益生菌BL21干预后，抑郁小鼠不动的时间有所缩短，即疾病小鼠的抑郁症状有所改善，且复合菌干预的改善程度更加显著(图中数据使用R语言(R 4.2.2)ggplot2函数进行统计分析，与模型组MC组相比，***代表p<0.0001，**代表p<0.001，*代表p<0.05)。

(4)小鼠肝脏指标检测：实验结束后麻醉处死小鼠。将OCT(最佳切割温度化合物)包埋的肝组织切成4μm厚的切片。肝组织切片与5μM二氢乙锭DHE在37℃避光孵育30min，观察红色的氧化乙锭荧光，应用荧光染料DHE检测肝脏中活性氧ROS水平，红色越深活性氧ROS水平越高，结果如图3所示。

砷及其化合物进入机体后，大量积蓄于血液中，且砷随着血液循环逐渐分布到全身各组织器官，肝脏是砷在体内蓄积的主要靶器官，由图3可知：砷污染小鼠肝脏有不同程度的病理组织学改变，益生菌BL21干预能够改善砷污染小鼠肝脏损伤，氧化应激水平下降，且复合菌的干预使氧化应激水平下降更加显著。

(5)小鼠血清皮质酮含量测试：在FST试验中，开始游泳前，对小鼠进行眶窦采血以获得基础状态样本。然后，小鼠进行6min的强迫游泳，再放回笼子里。30min后再次采集血样，得到应激状态样本。首先稀释血清，使用商业CORT EIA试剂盒(武汉纯度生物技术有限公司)分析皮质酮浓度。按照制造商的说明，使用试剂盒中提供的标准对皮质酮浓度进行分析。

统计结果如图4所示：对比CTL组，MC组疾病小鼠在基础和应激状态下的血液皮质酮水平显著提高，但经益生菌BL21或复合菌干预后，有效地将焦虑小鼠的皮质酮水平降低到CTL组小鼠接近的正常水平。皮质酮属于肾上腺分泌的肾上腺皮质激素之中的糖皮质激素，在应付压力中扮演重要角色，又被称为压力荷尔蒙。焦虑症紧张可能会导致皮质酮增高，而益生菌给药可以有效改善因环境污染引起焦虑症小鼠的精神状态，通过改善焦虑症小鼠体内激素分泌或者代谢功能紊乱来调节皮质酮水平(图中数据使用R语言(R 4.2.2)ggplot2函数进行统计分析，与模型组MC组相比，***代表p<0.0001，**代表p<0.001，*代表p<0.05)。

(6)小鼠血清细胞因子检测：试验结束后解剖小鼠，首先稀释血清，根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒(武汉纯度生物技术有限公司)测量各组的肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-6和IL-10含量。

统计结果如图5所示，对比CTL组，在MC小鼠中，我们发现血清TNF-α、IL-6水平显著增加，同时血清IL-10水平降低。结合已有研究，患有抑郁症的患者通常血清TNF-α、IL-6水平会升高，与没有重度抑郁症的患者相比，重度抑郁症患者血清TNF-α、IL-6与IL-10比率更高，血清IL-10水平更低。我们的研究显示了相似的结果，即重金属污染的抑郁小鼠有诱导免疫系统病理倾向，经益生菌BL21和复合菌干预后，逆转了疾病小鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6水平的升高和抗炎因子IL-10水平的降低，且复合菌的逆转作用更加突出(图中数据使用R语言(R 4.2.2)ggplot2函数进行统计分析，与模型组MC组相比，***代表p<0.0001，**代表p<0.001，*代表p<0.05)。

(7)小鼠血清素5-HT和多巴胺含量测定：小鼠解剖后，取其大脑前额皮质组织用微型超声仪(Q125超声仪；Qsonica，USA)均质化。然后将均质化的样品在4℃下以12,000g离心10min。上清液使用0.22mm聚偏二氟乙烯膜(4mm注射器式滤器；Millex-GV)进行过滤。适当稀释后，取20μL样品，通过高效液相色谱-电化学检测系统HPLC-ECD测量血清素5-HT和多巴胺浓度。在室温下，相对于Ag/AgCl参比电极，玻璃碳工作电极的电位设置为±650mV。含有0.1M NaH

统计结果如图6所示，对比CTL组，我们检测到MC组小鼠体内多巴胺和5-HT含量显著降低，即小鼠抑郁，情绪低落伴随着神经递质含量的降低，而补充益生菌后，小鼠体内的神经递质多巴胺和5-HT活性显著提高，可以推测，益生菌通过口服补充进入小鼠胃肠道，能够作用到小鼠的大脑神经系统，提高机体重要的神经传导物质多巴胺和5-HT含量，从而调节情绪、睡眠、认知、食欲、性欲等功能，即本发明所涉及的益生菌剂能够通过调控肠-脑轴改善抑郁、焦虑等情绪问题。且相较于单菌使用，BL21菌株与LC24菌株的组合方式在上述功效上更加显著(图中数据使用R语言(R 4.2.2)ggplot2函数进行统计分析，与模型组MC组相比，***代表p<0.0001，**代表p<0.001，*代表p<0.05)。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种通过调节肠-脑轴改善由环境污染引起的精神类疾病的益生菌剂及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。