一种骨软骨组织修复支架及其制备方法

摘要

本发明提供一种骨软骨组织修复支架及其制备方法。所述骨软骨组织修复支架由自制的光固化3D打印设备一体化制作而成，包括仿生的双层结构：软骨层和软骨下骨层，软骨层具有“莲藕状”和“辐射状”孔，软骨下骨层具有“莲藕状”的孔，且软骨层和软骨下骨层之间的纵向孔隙相互贯通，孔径精确控制，还可以在软骨下骨层中添加粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料。本发明制备的骨软骨组织修复支架针对软骨和软骨下骨两种不同组织特性和再生要求，设计具有不同物理学和生物学特性的双层支架，仿生天然骨软骨结构的各向异性，促进细胞迁移及组织长入，并达到促进软骨和软骨下骨同步再生的效果，因而具有巨大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促细胞迁移的一体化骨软骨组织修复支架及其制备方法。

背景技术

膝关节的软骨损伤主要由外伤、疾病或衰老造成，这会影响患者的正常生活并引起疼痛。关节软骨是由软骨细胞和细胞外基质(ECM)(例如Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖)组成，是一种没有血管、淋巴或神经的光滑的弹性组织，在受损时具有有限的自愈能力。根据软骨损伤深度，通常可以分为三种类型:部分软骨缺损、全层软骨缺损以及骨软骨缺损，然而，临床研究表明，软骨损伤总是深深地延伸到软骨下骨中，导致膝关节的骨软骨缺损。如果不及时加以治疗，骨软骨缺损可能会进一步加重关节软骨缺损并导致骨关节炎。并且基于骨软骨天然的复杂结构，软骨和软骨下骨是具有明显生物学特异性的两种组织，这意味着骨软骨损伤的临床治疗更具挑战性。因此，骨软骨缺损修复至关重要。但是，目前的传统治疗和手术方法只能暂时缓解患者的疼痛，不能真正实现骨软骨缺损修复和具有完整功能的透明软骨再生。因此，面对骨软骨修复的临床难题，提出新的治疗方法十分迫切。

组织工程是一个新兴领域，已经给体内移植以及组织和器官的再生带来了新的希望。近些年来，组织工程已逐渐成为一项有效而又前沿的治疗关节软骨损伤的方法。但目前组织工程中的骨软骨支架仍存在一些待解决的问题，例如非分层支架修复收效甚微、多层支架层间缺乏有效的界面结合性。而3D打印技术在组织工程支架材料的制备中有较多研究，并显现出优势。利用3D打印技术打印的支架材料具有与缺损组织相匹配的外形，还有可以提供细胞粘附、生长和增殖的内部三维多孔结构，通过材料筛选及改性可以制备3D打印“生物墨水”，利用3D生物打印机可以打印制备机械性能良好的支架材料。DLP作为光打印中新技术，目前已经展现出诸多优点。比如，打印速度快、打印精度高、有利于细胞存活等，已经在组织工程领域多个研究方向进行使用。

之前有研究证明，多孔状结构的支架有利于促进细胞迁移，并且不同的结构也会影响支架力学性能，因此为了促进组织再生，构建影响细胞和组织命运的理想支架微环境是必不可少的。CN101810885B提供了一种带有圆形孔和垂直孔的双层仿生骨软骨组织工程支架，但其支架中的圆形孔和垂直孔的形成是来自于材料本身的特性，本发明中使用的GelMA水凝胶也具有相似的多孔结构，并且孔的分布是随机的，孔径大小难以实现精准控制，严重影响软骨细胞的迁移和生长，仿生程度较低，软骨修复效果不佳。

因此，通过DLP打印技术可以一体化构建多层骨软骨支架结构，实现个性化定制，有效仿生天然骨软骨特异的物理和生物学特性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新型骨软骨组织修复支架，所述骨软骨组织修复支架为水凝胶支架，并由自制的光固化3D打印设备一体化制作而成，包括仿生的双层结构：软骨层和软骨下骨层，所述软骨层具有“莲藕状”和“辐射状”的孔隙，所述软骨下骨层具有“莲藕状”的孔隙，且所述软骨层和软骨下骨层之间的纵向孔隙相互贯通，精确控制孔径，并且还可以在软骨下骨层中添加粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料。本发明的目的在于提供一种生物相容性好、力学性能佳、仿生程度高、更利于软骨细胞和骨髓间充质干细胞迁移和促进骨软骨缺损修复的水凝胶骨软骨组织修复支架及其制备方法。

虽然用于制备修复支架的水凝胶本身材质中也可能带有随机分布的垂直孔和圆形孔，但其软骨修复效果依然较差。本发明提供的骨软骨组织修复支架，由自制的光固化3D打印设备一体化制作而成，能精准控制骨软骨组织修复支架的水凝胶微孔的排布和孔径，从而实现更好的骨软骨缺损修复效果。

一方面本发明提供了一种骨软骨组织修复支架，从上到下依次包括软骨层和软骨下骨层，所述软骨层具备“莲藕状”和“辐射状”分布的孔；所述软骨下骨层具备和软骨层贯通的“莲藕状”孔。

本发明所述“莲藕状”和“辐射状”孔都为条状的贯穿孔。

本发明经过大量研究证实，骨软骨修复支架中的孔的形状和孔径大小对支架的力学特性和细胞迁移具有显著影响，必须精准控制孔的形状、分布及孔径大小，才能获得合适的力学特性，以及具有更好的细胞迁移效果，从而才能具有更好的软骨修复效果。

本发明所述的“莲藕状”孔是指垂直于支架的纵向贯通排列孔(详见图1和图2)；“辐射状”孔是指以横向贯穿支架的横向孔，并以横截面圆心为中心，向外辐射的孔，呈横向排列(详见图1和图2)。

所述软骨层具备“莲藕状”和“辐射状”分布的孔，以有利于软骨细胞迁移和分布；所述软骨下骨层具有“莲藕状”的孔，以引导骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移到上部空间。

进一步地，所述软骨层和软骨下骨层都为圆柱形，且软骨层和软骨下骨层的圆柱形底面直径一致。

进一步地，所述“莲藕状”孔纵向贯穿了软骨层和软骨下骨层的圆柱形底面，软骨下骨层和软骨层的“莲藕状”孔连通成一体。

进一步地，所述“辐射状”孔横向贯穿了软骨层，且经过了软骨层的横截面圆心。

进一步地，所述软骨层和软骨下层的孔隙直径为100～400μm。

支架中相互连接的孔隙结构可形成强大的三维组织，有利于细胞增殖分化和营养物质/废物转移，从而实现高效的组织再生。并且孔隙大小可调节细胞命运，足够大的孔隙为骨形成提供足够的成骨生态位，而足够小的孔隙将维持干细胞性并防止分化。

软骨下骨层支架垂直的孔洞，有利于骨髓间充质干细胞向上层进行迁移，并且“莲藕状”的支架力学性能强于上层，有利于骨的修复。

软骨层水凝胶支架具备“莲藕状”和“辐射状”分布的孔，不仅有利于骨髓间充质干细胞的迁移，也有利于周围正常的软骨细胞向受损区域迁移，加强软骨层的修复。

包含软骨层和软骨下骨层的支架是有利于细胞迁入、营养物质运输和血管长入的多孔支架，其机械强度和生物学性能都适用于骨软骨的再生和修复。

进一步地，所述“辐射状”孔可设有一层或一层以上，每层之间的间隔大于100μm，均匀分布于软骨层。

进一步地，所述每层设有2～10条横向贯穿软骨层且经过横截面圆心的“辐射状”孔。

进一步地，在同一层的相邻两条“辐射状”孔之间夹角都保持一致。

进一步地，所述“莲藕状”孔可设置多条，每条之间的间距大于100μm，纵向均匀分布于软骨层和软骨下骨层的横截面。

进一步地，所述骨软骨组织修复支架的尺寸大小根据实际需移植的人体或动物骨软骨尺寸进行匹配设计。

在一些方式中，本发明提供的软骨修复支架的尺寸为所述多层骨软骨组织修复支架的厚度为4mm，所述软骨层的厚度为1mm，所述软骨下骨层的厚度为3mm，孔径为200μm的微孔。该尺寸规格的软骨修复支架主要用于匹配动物实验兔子骨软骨造模。

进一步地，所述软骨层包括GelMA、LAP和生长因子。

进一步地，所述软骨下骨层包括GelMA和LAP。

进一步地，所述软骨下骨层还包括粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料。

本发明所述粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料是根据CN109718249A中的磷酸钙纳米簇制得。

羟基磷灰石是人体和动物骨骼的主要无机成分，普通羟基磷灰石主要用于制备功能化复合材料。现有的纳米羟基磷灰石，其粒径普遍在10纳米以上，多用于骨组织工程支架材料。

本发明采用的粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料由研究团队自主研发，其制备方法已申请专利CN109718249A，主要用于制备修复骨质疏松的药物，并能有效促进牙釉质的再生。

本发明经大量研究发现，采用所述的粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料用于制备软骨组织修复支架时，因其粒径更小，不仅具有更好的生物相容性，还具备更好的仿生效果，能有效促进间充质干细胞的成骨分化，软骨组织修复效果更好。

进一步地，所述软骨层和软骨下骨层的GelMA和LAP浓度相同。

进一步地，所述GelMA含量为15％，所述LAP含量为0.2％。

进一步地，所述生长因子为KGN，所述KGN的浓度为200μM。

另一方面，本发明提供了一种骨软骨组织修复支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)配制第一料液，将GelMA、LAP及KGN，在避光的条件下加入到单蒸水中，搅拌均匀后，得到第一料液。所述第一料液包括GelMA、LAP和生长因子，用于制备软骨层；

(2)配制第二料液，将GelMA、LAP，或GelMA、LAP、粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料，在避光的条件下加入到单蒸水中，搅拌均匀后，得到第二料液。所述第二料液中包括GelMA、LAP和1纳米羟基磷灰石，用于制备软骨下骨层；

(3)将所述第一料液倒入光固化3D打印设备液体槽，进行打印，待上层软骨层支架全部打印完毕，得到上层软骨层水凝胶支架；

(4)清理打印机液体槽后，将所述第二料液倒入打印机液体槽，继续进行打印，待下层软骨下骨层支架全部打印完毕，得到双层骨软骨组织修复支架。

依据仿生学的原理以及正常骨软骨缺损的大小及结构，应用计算机辅助设计软件建立具有特定外形和仿生空间结构的双层骨软骨组织一体化修复支架CAD模型；将设计好的双层骨软骨组织修复支架CAD模型通过软件转化成适用于自主设计研发的基于紫外光照投影的光固化3D打印设备的Task Scheduler Task Object(.job)文件格式，并导入到所述的3D打印设备中，使用紫外光固化打印系统，按照预先设定的参数，对所述第一料液和所述第二料液通过自制光固化3D打印设备进行打印，即可得到具备精准孔排列和孔径的骨软骨组织修复支架结构。该支架结构从上到下分为软骨层和软骨下骨层，所述软骨层具备“莲藕状”和“辐射状”分布的孔，即其中的孔隙结构横向和纵向排列，以有利于软骨细胞迁移和分布；而所述软骨下骨层则具有“莲藕状”的孔，即孔隙结构纵向排列，以引导骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移到上部空间；且所述软骨层和软骨下骨层之间的纵向“莲藕状”孔隙相互贯通。

本发明采用的自制光固化3D打印设备，该打印设备按照已申请专利CN110228193A的方法制备，可以实现边光固化边打印，并能精准控制骨软骨组织修复支架的孔径和孔的排布方式，从而能实现更好的软骨组织修复效果。

本发明涉及的双层骨软骨组织修复支架是通过模拟天然骨软骨的生理结构与组成构建，其中上、下层均可在原组分的基础上添加不同的生长因子、无机离子或有机成分，例如KGN、BMP、TGF-β1等。

虽然GelMA水凝胶本身也带有随机分布的垂直孔和圆形孔，但其细胞迁移效果仍然较差，难以实现足够的缺损修复效果；本发明通过光固化3D打印设备打印特定的200μm孔径的“莲藕状”和“辐射状”孔结构的凝胶，能明显提升促进细胞迁移的效果，从而大幅提升缺损修复的效果。

本发明提供的骨软骨组织修复支架具有以下有益效果：

(1)通过自制光固化3D打印设备精确打印，制得的骨软骨组织修复支架具备精确的孔径和孔的排布方式，对细胞迁移有很好的效果；

(2)将粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料用于骨软骨修复支架的制备，具有比普通羟基磷灰石具有更好的成骨诱导性能；

(3)具有可调节的机械性能和良好的生物相容性；

(4)具有更好的促软骨细胞和骨髓间充质干细胞迁移的能力；

(5)具有营养物质运输/废物转移的能力；

(6)具有可使新生血管长入和更好的促进骨软骨缺损修复能力。

附图说明

图1为实施例1中的骨软骨组织修复支架的结构示意图。

图2为实施例1中的骨软骨组织修复支架的剖面图。

图3为实施例1中的骨软骨组织修复支架的设计图。

图4为实施例1中的骨软骨组织修复支架的3D模型及制备示意图。

图5为实施例1中的骨软骨组织修复支架的大体图。

图6为实施例1中的骨软骨组织修复支架中孔隙的荧光图和电镜图。

图7为实施例2中的骨软骨组织修复支架中不同孔径的上层软骨层支架微观结构图。

图8为实施例2中的骨软骨组织修复支架的15％GelMA时不同孔径的力学性能。

图9为实施例2中的骨软骨组织修复支架的10％GelMA时不同孔径的力学性能。

图10为实施例2中的骨软骨组织修复支架的15％GelMA和10％GelMA的扫描电镜图。

图11为实施例3中的骨软骨组织修复支架中上下层水凝胶支架的力学性能。

图12为实施例4中的骨软骨组织修复支架的GelMA水凝胶的生物相容性实验结果。

图13为实施例5中的骨软骨组织修复支架的GelMA水凝胶的成骨诱导性能实验碱性磷酸酶染色结果。

图14为实施例5中的骨软骨组织修复支架的GelMA水凝胶的成骨诱导性能实验碱性磷酸酶活性定量结果。

图15为实施例6中骨软骨组织修复支架的体外促细胞迁移结果。

图16为实施例7中的骨软骨组织修复支架的体内细胞浸润结果。

图17、18、19为实施案例8中不同微孔分布的骨软骨组织修复支架的体内细胞浸润结果。

图20为实施例9中植入支架后8、16周关节样本大体图。

图21为实施例9中植入支架后关节样本的HE染色结果。

图22为实施例9中植入支架后关节样本的SO染色结果。

图23为实施例9中的植入支架后16周关节样本修复后的力学测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

实施例1本发明提供的骨软骨组织修复支架

本实施例提供的骨软骨组织修复支架结构如图1-图3所示，其中图1为骨软骨组织修复支架的结构示意图，图2为骨软骨组织修复支架的剖面图，图3为骨软骨组织修复支架的设计图。

由图1、图2和图3可见，本实施例提供的骨软骨组织修复支架包括上层的软骨层1和下层的软骨下骨层2，所述软骨层1具备“莲藕状”孔3和“辐射状”孔4，所述软骨下骨层2具备与软骨层贯通的“莲藕状”的孔3；所述软骨层1和软骨下骨层2之间的“莲藕状”孔隙相互贯通。“莲藕状”孔3是指垂直于支架的纵向贯通排列孔，“辐射状”孔4是指横向贯穿支架的横向孔，并以横截面圆心为中心，向外辐射，呈横向排列。本实施例中，软骨层1和软骨下骨层2都为圆柱形，且软骨层1和软骨下骨层2的圆柱形底面直径一致；“莲藕状”孔3贯穿了软骨层1和软骨下骨层2的圆柱形底面；“辐射状”孔4位于软骨层1的圆柱形侧壁上，横向贯穿了软骨层1。

优选的，所述软骨层1和软骨下骨层2的“莲藕状”和“辐射状”孔的孔隙直径为200μm。

优选的，“辐射状”孔3可设有一层或一层以上，每层之间的间隔大于100μm，均匀分布于软骨层1。本实施例中，“辐射状”孔3共设有三层，由上至下均匀排列，若需要制备尺寸较大的骨软骨组织修复支架，或是软骨层1较厚时，可以设置更多层的“辐射状”孔3。

优选的，每层设有2～10条横向贯穿软骨层1且经过横截面圆心的“辐射状”孔3。本实施例中每层共设有5条“辐射状”孔3。若需要制备尺寸较大的骨软骨组织修复支架，或是软骨层1横截面直径较大时时，可以在每一层设置更多条“辐射状”孔3。

优选的，在同一层的相邻两条“辐射状”孔3之间夹角都保持一致。在本实施例中，由于设置了5条“辐射状”孔3，因此每两条相邻的“辐射状”孔3之间的夹角为36度角。

优选的，所述“莲藕状”孔4可设置多条，每条之间的间距大于100μm，纵向均匀分布于软骨层1和软骨下骨层2的横截面。本实施例中，共设有30条“莲藕状”孔4，均匀分布。

优选的，软骨层1包括GelMA、LAP和生长因子，软骨下骨层2含有GelMA和LAP，以及粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料。粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料的制备方法见CN201910068395.1。

优选的，所述软骨层1和软骨下骨层2的GelMA和LAP浓度相同，所述GelMA浓度为10～15％，所述LAP浓度为0.2％。

优选的，所述软骨层1的生长因子为KGN，所述KGN的浓度为200μM。

上层的软骨层1和下层的软骨下骨层2利用自制的光固化3D打印设备打印预先设计好模型结构的双层骨软骨组织修复支架。

本实施例提供的骨软骨组织修复支架的制备方法具体包括：

(1)配制第一料液，第一料液包括GelMA、LAP及KGN。具体的，将GelMA、LAP及KGN在避光的条件下加入到42℃水浴的单蒸水中，搅拌均匀后，得到第一料液。其中，GelMA的浓度为15％，LAP的浓度为0.2％，KGN的浓度为200μM。

(2)配制第二料液，第二料液包括GelMA、LAP和1纳米磷酸钙纳米簇材料。具体的，将GelMA、LAP和1纳米磷酸钙纳米簇材料加入到42℃水浴的单蒸水中，搅拌均匀后，得到第二料液。其中，GelMA的浓度为15％，LAP的浓度为0.2％。

(3)将6mL第一料液倒入自制的光固化3D打印设备的42℃加热的液体槽中，在打印后得到上层软骨层支架；将液体槽中剩余的第一料液转移，并用单蒸水将液体槽清洗干净后，将6mL的第二料液倒入42℃加热的液体槽中，继续进行打印，得到一体化双层骨软骨组织修复支架。

(4)根据设计的CAD模型，打印完的双层骨软骨组织修复支架由两部分组成。上层软骨层，具有横向贯通的孔径为200μm的微孔，用于诱导促进软骨细胞迁移和分布；以及具有纵向贯通的孔径为200μm的微孔，用于诱导软骨细胞及骨髓间充质干细胞迁移。下层软骨下骨层，具有与上层软骨层纵向相互贯通的孔径为200μm的微孔，用于引导骨髓间充质干细胞迁移到上部空间。且双层骨软骨组织修复支架的厚度为4mm，上层软骨层的厚度为1mm，下层软骨下骨层的厚度为3mm。

图4为本发明提供的双层骨软骨组织修复支架的3D模型及制备示意图。图5为本发明提供的双层骨软骨组织修复支架的大体图。(a)支架顶视图；(b)上层支架侧视图；(c)下层支架侧视图。图6为本发明提供的双层骨软骨组织修复支架中孔隙的荧光图和电镜图。从电镜图也可以看出，凝胶本身存在多孔结构。(a)上层支架“莲藕状”和“辐射状”结构的荧光图；(b)上层支架侧面的扫描电镜图。图4-6表明本发明的双层骨软骨组织修复支架通过DLP可以打印直径为4mm，上层支架为1mm厚度，下层支架为3mm厚度，且孔径为200μm的精确双层结构。

实施例2不同GelMA浓度，不同孔径支架对双层骨软骨组织修复支架力学性能的影响

本实施例为使用拉伸-压缩力学测试仪(具有1kN传感器的Instron-5543)对10％和15％两种GelMA浓度形成的不同孔径的水凝胶支架分别进行力学测试，具体实施步骤如下：

(1)使用DLP打印机打印莲藕状的10％和15％两种浓度的下层软骨下骨层GelMA水凝胶支架，支架孔洞直径分别为0μm、100μm、200μm和400μm。

(2)将打印后的GelMA水凝胶支架在1xPBS中孵育4小时；

(3)将待测试的水凝胶支架置于力学测试仪的载物台上，设置探头按照1mm/min的速度向下压支架，直到支架高度变为初始高度的65％。电脑自动记录压缩形变和压力数据。

(4)按照应变在40％-60％范围进行线性拟合计算压缩模量。

图7为本发明的上层软骨层GelMA水凝胶支架微观结构图，支架孔洞直径分别为0μm、100μm、200μm和400μm(a、b和c)。图8-10为本发明的双层骨软骨组织修复支架的最佳GelMA浓度和结构筛选。图8和图9为浓度分别为15％和10％的打印支架在支架孔洞直径分别为0μm、100μm、200μm和400μm时的载荷-压缩形变曲线和压缩模量，图10为浓度分别为15％和10％的GelMA水凝胶的扫描电镜图像。通过分别测量10％、15％两种GelMA浓度在不同孔径的力学测试的载荷和压缩形变的关系，说明不同孔径大小的支架会影响支架的力学，并且在相同情况下，孔径越大，整体力学性能相对较差。另外，15％GelMA水凝胶支架整体力学性质优于10％GelMA水凝胶力学性质。我们同样对10％GelMA和15％GelMA用扫描电镜观察水凝胶的微结构，显示水凝胶微结构均是具有多孔结构。此外计算了不同孔径的水凝胶支架的比表面积，如表1所示。

表1不同孔径的水凝胶支架的比表面积

最终，通过材料结构的力学筛选以及支架整体表面积比较，孔径越大，软骨修复支架的比表面积越大，但孔径增大后，容易造成力学支撑性能的降低。本发明决定选择15％GelMA水凝胶的200μm孔径作为使用的支架，该水凝胶支架既具有较好的力学性质，又具有较大的支架比表面积。(*p<0.05，**p<0.01)

实施例3上下层水凝胶支架的力学测试

本实施例为使用拉伸-压缩力学测试仪(具有1kN传感器的Instron-5543)对上下层水凝胶支架分别进行力学测试，具体实施步骤如下：

(1)将打印后的上下层水凝胶支架在1xPBS中孵育4小时；

(2)将待测试的水凝胶支架置于力学测试仪的载物台上，设置探头按照1mm/min的速度向下压支架，直到支架高度变为初始高度的45％。电脑自动记录压缩形变和压力数据。

(3)按照应变在20％-40％范围进行线性拟合计算压缩模量。

图11为双层骨软骨组织修复支架上下层水凝胶支架的力学性质，说明下层软骨下骨层力学性能明显强于上层软骨层，符合天然骨软骨中软骨与软骨下骨之间的生物学差异，表明本发明的双层骨软骨组织修复支架具有优异的仿生力学性能。

实施例4用CCK-8测定细胞在GelMA水凝胶的细胞活性测试

本实施例使用CCK-8测定细胞在GelMA水凝胶的细胞活性测试，所述GelMA水凝胶分为两组，第一组仅含有GelMA和LAP，第二组为空白对照，具体实施步骤如下：

(1)配制第二料液，第二料液中GelMA的浓度为15％、LAP的浓度为0.2％。

(2)将配制的第二料液加入到96孔板中，其中每孔加入50μL，用紫外光进行交联后，浸泡在低糖培养基中。

(3)在浸泡24h后，将细胞按照1000cells/孔进行接种，待24h贴壁后，弃去原培养基，加入新的培养基，每孔100μL；空白对照组加入新鲜培养基；阳性对照组只加入细胞悬液。每个实验组6个重复。

(4)检测1、3、5天的细胞增殖率。检测前，向每个孔中加入10μL CCK-8试剂，并将96孔板放置在37℃，5％CO

图12为骨软骨组织修复支架的GelMA水凝胶的生物相容性，说明细胞呈明显增殖状态，GelMA具有良好的生物相容性，有利于细胞增殖，表明本发明的骨软骨组织修复支架具有良好的生物相容性。

实施例5用ALP定性和定量测定GelMA水凝胶的成骨诱导能力

本实施例使用碱性磷酸酶(ALP)定性和定量测定GelMA水凝胶的成骨诱导能力，所述GelMA水凝胶分为三组，第一组仅含有GelMA和LAP，第二组含有GelMA、LAP和粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料(图中简称为CaP)，第三组含有GelMA、LAP和粒径为20纳米的商业羟基磷灰石(图中简称为HANP)，具体实施步骤如下：

(1)配制第二料液，第二料液中GelMA的浓度为15％、LAP的浓度为0.2％，其中第二、三组还需添加1纳米的磷酸钙纳米簇材料或粒径为20纳米的商业羟基磷灰石。

(2)将配制的第二料液加入到48孔板中，其中每孔加入150μL，用紫外光进行交联后，浸泡在低糖培养基中。

(3)在浸泡24h后，将细胞按照1×10

(4)在细胞开始成骨诱导后的第七天对其进行碱性磷酸酶显色实验和碱性磷酸酶定量实验，进行样本的碱性磷酸酶数据记录和处理。

图13-14为第7天样本的碱性磷酸酶活性定性染色和定量结果，说明GelMA与粒径为1纳米的磷酸钙纳米簇材料组合，具有比GelMA与粒径为20纳米的商业羟基磷灰石更加良好的成骨诱导性能，有利于细胞成骨分化，表明本发明的骨软骨组织修复支架具有良好的成骨诱导性。

实施例6支架的微孔对体外细胞迁移实验的影响

本实施例为水凝胶支架体外细胞迁移实验，具体实施步骤如下：

(1)将细胞进行DiI染色，即用PBS或无血清培养基稀释DiI储存液到2μM/mL工作液，用胰酶消化细胞，离心后，用工作液重悬细胞，放置到37℃，5％CO

(2)将DiI染好的C3H细胞按照5×10

(3)将打印好的有孔径为200μm的“莲藕状”和“辐射状”孔的下层软骨下骨层支架，和打印的无微孔(但凝胶中本身存在随机的多孔结构)的支架轻轻放置在培养皿中间，确保培养基液体浸没支架。

(4)实验后第一天收两组的支架样品，第3、5天收有微孔的支架样品。收获的支架样品用奥林巴斯正置双光子共聚焦显微镜进行观察、拍摄，并用Imaris进行三维图像重建和数据处理。

图15为细胞在有微孔和无微孔的支架样本上迁移后细胞数量的定量分析。表明本发明的双层骨软骨组织修复支架中的200μm孔径的“莲藕状”和“辐射状”孔结构能有效促进细胞迁移进入支架，从而在体内修复实验中达到促进缺损修复的效果，而如果未通过光固化3D打印设备打印特定的200μm孔径的“莲藕状”和“辐射状”孔结构的凝胶，虽然其本身也带有垂直孔和圆形孔，其细胞迁移效果仍然较差，难以实现足够的缺损修复效果。

实施例7支架的微孔对体内细胞迁移实验的影响

本实施例为水凝胶支架体内细胞迁移实验，具体实施步骤如下：

(1)在无菌环境下，打印有孔径为200μm的“莲藕状”和“辐射状”孔的下层软骨下骨层支架和无微孔(但凝胶中本身存在随机的多孔结构)的支架。

(2)使用戊巴比妥对SPF级SD大鼠(250g左右，雄鼠)进行麻醉，即将戊巴比妥注射入大鼠腹腔，注射剂量为50mg/kg。

(3)在无菌环境下，在大鼠背部内侧皮肤切开约2cm长度切口，将两种GelMA水凝胶支架分别放置到其中，然后进行缝合。

(4)在术后第3、5天进行取样，4％甲醛固定24h以上。待组织固定完成后，将组织在4℃冰箱用20％、30％的蔗糖梯度脱水，待组织块沉底后取出进行冰冻切片。

(5)DAPI按照1:1000比例染色切片15分钟后，PBS洗3遍；

(6)奥林巴斯正置双光子共聚焦显微镜进行观察，并用Imaris进行三维图像重建和数据处理。

图16为将打印和未打印的GelMA水凝胶支架皮下植入大鼠体内以评估体内细胞浸润情况，在植入第5天，打印的有200μm孔径的“莲藕状”和“辐射状”孔的下层软骨下骨层支架浸入细胞数量极显著高于无微孔的支架。表明本发明的双层骨软骨组织修复支架中的微孔结构能有效促进细胞迁移进入支架，从而在体内修复实验中达到促进缺损修复的效果。

实施例8不同的微孔分布的水凝胶支架对体内细胞迁移实验的影响

本实施例为水凝胶支架体内细胞迁移实验，分别采用四种不同微孔分布的支架进行实验，其中第一种为：打印的有200μm孔径的“莲藕状”和“辐射状”孔的骨软骨组织修复支架；第二种为：打印的有200μm孔径的“莲藕状”的骨软骨组织修复支架；第三种为：打印的有200μm孔径的“辐射状”孔的骨软骨组织修复支架；第四种为：无打印微孔的骨软骨组织修复支架。

具体实施步骤如下：

(1)在无菌环境下，打印有孔径为200μm的“莲藕状”和“辐射状”孔的水凝胶支架和无微孔(但凝胶中本身存在随机的多孔结构)的支架。

(2)使用戊巴比妥对SPF级SD大鼠(250g左右，雄鼠)进行麻醉，即将戊巴比妥注射入大鼠腹腔，注射剂量为50mg/kg。

(3)在无菌环境下，在大鼠背部内侧皮肤切开约2cm长度切口，分别将四种GelMA水凝胶支架放置到其中，然后进行缝合。

(4)在术后第5天进行取样，4％甲醛固定24h以上。待组织固定完成后，将组织在4℃冰箱用20％、30％的蔗糖梯度脱水，待组织块沉底后取出进行冰冻切片。

(5)DAPI按照1:1000比例染色切片15分钟后，PBS洗3遍；

(6)奥林巴斯正置双光子共聚焦显微镜进行观察，并用Imaris进行三维图像重建和数据处理。结果如表2、图17、图18所示。

(7)将切片进行HE染色，即苏木精避光染色10分钟后，1％盐酸酒精快速分色，伊红染色20秒，然后梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树脂封片。用奥林巴斯VS200数字切片扫描仪扫描染色结果。结果如图19所示。

表2 5天后不同的微孔分布的水凝胶支架对体内细胞迁移实验的影响

图17为植入支架后，第5天时，荧光染色灰度图；图18为荧光染色分析结果；图19为支架切片HE染色结果，其中a为“辐射状”，b为“莲藕状”孔。

由图19可以看出，参照示意图指示，在第5天时，没有200μm微孔的支架处，细胞只能黏附于支架表面，向支架内部迁移的能力有限。但在有打印的微孔处，细胞可以通过孔向内部迁移，无论是“莲藕状”孔还是“辐射状”孔，都对其迁移和分布起到了巨大的作用。

由表2和图17、18可以看出，同时含有200μm的“莲藕状”和“辐射状”孔的骨软骨组织修复支架，相比不含有微孔，或是只含有“莲藕状”或“辐射状”孔的骨软骨组织修复支架相比，其第5天时的细胞迁移数都明显提高；这是由于当骨软骨组织修复支架同时具备“莲藕状”和“辐射状”分布的孔时，非常有利于软骨细胞迁移和分布，并且还能引导骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移到上部空间，从而大幅提升细胞迁移数。

本实施例还进一步比较了“辐射状”孔位于软骨层、或是位于软骨下骨层、或是同时分布在软骨层和软骨下骨层的情况，实验证明，当“辐射状”孔仅位于软骨下骨层时，细胞迁移效果与第二种“莲藕状”的骨软骨组织修复支架类似；当“辐射状”同时分布在软骨层和软骨下骨层时，细胞迁移效果依然不佳；只有当“辐射状”孔位于软骨层，软骨下骨层不含有“辐射状”时，才能获得细胞迁移个数达到354.5±12.19个，细胞迁移深度达到279.0±56.90微米的效果。

实施例9骨软骨支架在兔子软骨缺损部位的修复再生实验

本实施例为水凝胶支架在兔子骨软骨缺损部位的修复再生实验，具体实施步骤如下：

(1)在无菌环境下，打印有200μm孔径的“莲藕状”和“辐射状”孔的双层骨软骨组织修复支架(B)、无微孔的双层骨软骨组织修复支架(NB)和上层含有生长因子KGN的有微孔的双层骨软骨GelMA水凝胶支架(B+KGN)。

(2)使用1％戊巴比妥钠对新西兰大白兔进行耳缘静脉麻醉，注射剂量为40mg/kg。

(3)在无菌环境下，用碘伏消毒皮肤，沿髌韧带内侧切开大致1cm切口，继续切开直到暴露膝关节，用有刻度的手动钻孔器在股骨滑车处取4mm直径4mm深度的孔洞，完成骨软骨软缺损造模。48只新西兰大白兔全部进行造模，造模完成后，随机分为4组：空白组，未打印组，打印双层支架组，打印上层含有生长因子KGN的双层支架组，共8周(n＝4)和16周(n＝8，其中4个样本用于力学测试)两个时间点。将支架按照方向放入缺损部位后，立即碘伏消毒，缝合。空白组造模后，不需要填充支架，直接消毒缝合。

图20为植入支架后，8、16周关节样本大体图；图21为关节样本的HE染色结果；图22为关节样本的SO染色结果；图23为16周关节样本修复后的力学测试结果。

图21-23显示，8周、16周收样评估证实，本发明的骨软骨组织修复支架不论是软骨层还是软骨下骨层，都有更好的修复效果。在SO染色中，能够观察到空白对照组的修复效果不好，有大部分骨层还未完全长成，并且有纤维组织填充物，软骨缺损部分面积减小较少。而对于含有KGN的本发明骨软骨组织修复组，修复表面光滑，基本已经完全修复，软骨层厚度正常并且软骨细胞排列整齐，与周围组织连接紧密。表明本发明的双层骨软骨组织修复支架具备可以在促进软骨下骨再生的同时促进软骨再生的能力，能有效促进骨软骨组织损伤修复。

本发明未尽事宜为公知技术。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。