E3连接酶RNF99在负向调控TLR介导的炎症免疫反应中的应用

摘要

本发明提供E3连接酶RNF99在负向调控TLR介导的炎症免疫反应中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现，E3泛素连接酶RNF99作为反馈调控因子，可以负向调控TLRs介导的巨噬细胞炎症免疫反应，进而参与小鼠内毒素血症和结肠炎的进展。在机制上，研究发现RNF99可以特异性结合TAB2，促进K611位点赖氨酸的K48位的泛素化修饰，从而通过蛋白酶体途径介导其降解。具体的，E3连接酶RNF99通过泛素‑蛋白酶体途径调节TAB2降解，从而影响蛋白激酶TAK1‑TAB1‑TAB2复合体的形成和炎症反应，因此具有潜在实际应用之价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及E3连接酶RNF99在负向调控TLR介导的炎症免疫反应中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

先天免疫系统的激活需要模式识别受体(PRPs)识别病原体相关分子模式(PAMPs)，而巨噬细胞是主要的效应细胞。Toll样受体(TLRs)是最早发现和研究最多的模式识别受体，是一种细菌传感器，充当外部环境和细胞反应之间的接口。一旦TLRs识别出保守的微生物相关基序，巨噬细胞就会分泌促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，反过来，这些促炎因子会进一步激活炎症信号。TLRs信号转导异常可导致炎症反应异常和许多相关的免疫疾病，包括败血症和炎症性肠病(IBD)。它是一种以持续过度炎症和免疫抑制为特征的病理综合征，发病率和死亡率较高。TLR激动剂已显示出作为抗菌药物和疫苗佐剂的巨大潜力，而TLR拮抗剂正被开发为抑制免疫反应的试剂和药物。既往研究表明TLR4可作为脓毒症的治疗靶点。尽管人们对TLR介导的人类疾病的关键发病机制有了很大的了解，但仍缺乏完全有效的临床治疗方法。因此，探讨TLR信号的调控机制，避免TLR信号的异常激活至关重要。

当TLRs受到脂多糖(LPS)(TLR4配体)、R848(TLR7配体)和LTA(TLR2配体)等配体的刺激时，它们通过募集MyD88或TRIF启动信号级联。MyD88触发TAK1-TABs复合体的形成和激活，导致核因子NF-κB和MAPKs的磷酸化。最终引发免疫和炎症反应、发烧、内毒素血症和休克。研究表明TAK1在肿瘤坏死因子受体、白细胞介素-1受体I以及TLR介导的NF-κB和MAPKs激活中发挥重要作用。TAK1的激活需要与TAK1结合的蛋白(TAB1、TAB2和TAB3)，而TAK1-tabs复合体在先天免疫和炎症反应中起着重要作用。尽管TAK1-TAB复合物已被广泛研究，但单个蛋白的作用及其在不同细胞类型中的激活分子机制仍有待阐明。

细胞内信号通过不同泛素共价连接蛋白底物，参与众多细胞分子过程。近年来，越来越多的证据表明E3连接酶通过修饰TLRs信号通路相关蛋白参与先天免疫和炎症的调节。例如，E3连接酶Nrdp1可以通过泛素化修饰MyD88和TBK1，从而负调控TLR介导的促炎细胞因子的表达。E3连接酶TRIM38促进TRIF的k48链接泛素化，负调控TLR3介导的IFN-β表达。TRIM38还可以促进k48链接的泛素化、NAP1的降解和IRF3激活的抑制，从而负调控TLR/RLR介导的信号通路。RNF99是E3连接酶TRIM家族的新成员，目前研究较少。研究表明，RNF99可通过其E3连接酶活性，泛素化修饰和稳定p53，在大脑中发挥肿瘤抑制因子的作用。同时，有研究表明RNF99可负向调节NF-κb介导的HeLa或NIH3T3细胞的转录活性和增殖，但缺乏泛素化修饰的详细机制和靶点。目前，RNF99在不同疾病中的功能和作用机制还有待进一步研究。

大量证据表明，TAK1和TAB的翻译后修饰在调节TAK1激活方面具有重要作用。到目前为止，除了磷酸化外，泛素化是研究最广泛的翻译后修饰。研究表明，泛素-蛋白酶体系统在TAK1-TAB复合体组装和TAK1活化中起着至关重要的作用。但对TAB2降解的研究主要集中在溶酶体途径上。有报道称E3连接酶TRIM38，TRIM30α，TRIM22和RNF4可以靶向TAB2并通过溶酶体途径降解TAB2。但蛋白酶体途径是否参与了TAB2的降解尚不清楚。因此，进一步探索蛋白酶体途径中促进TAB2降解的特异性E3泛素连接酶，并研究其影响TAB2泛素化及相关TAK1激酶活性的分子机制，明确其在内毒素血症、结肠炎等炎症性疾病中的生理意义至关重要。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供E3连接酶RNF99在负向调控TLR介导的炎症免疫反应中的应用。本发明通过研究发现，E3泛素连接酶RNF99作为反馈调控因子，可以负向调控TLRs介导的巨噬细胞炎症免疫反应，进而参与小鼠内毒素血症和结肠炎的进展。在机制上，研究发现RNF99可以特异性结合TAB2，促进K611位点赖氨酸的K48位的泛素化修饰，从而通过蛋白酶体途径介导其降解。具体的，E3连接酶RNF99通过泛素-蛋白酶体途径调节TAB2降解，从而影响蛋白激酶TAK1-TAB1-TAB2复合体的形成和炎症反应。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供检测E3泛素连接酶RNF99编码基因和/或RNF99编码基因表达产物表达水平的物质在制备筛查、诊断(辅助诊断)、检测、监测或预测炎症疾病进展产品中的应用。

本发明的第二个方面，提供一种用于筛查、诊断(辅助诊断)、检测、监测或预测炎症疾病进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测受试者RNF99编码基因的转录；或基于免疫检测方法检测受试者E3泛素连接酶RNF99表达情况的物质。

所述产品可以为试剂盒。

本发明的第三个方面，提供促进RNF99编码基因及其表达产物表达和/或活性提高的物质在如下a1)-a4)至少一种中的应用：

a1)促进TAB2蛋白的K611位点的K48位泛素化修饰和蛋白酶体降解，进而抑制TAK1/TABs复合体的形成和TAK1激酶的激活或制备促进TAB2蛋白的K611位点的K48位泛素化修饰和蛋白酶体降解，进而抑制TAK1/TABs复合体的形成和TAK1激酶的激活的产品；

a2)抑制NF-κB和MAPKs信号通路的激活或抑制NF-κB和MAPKs信号通路激活的产品；

a3)抑制由TLRs配体诱导的巨噬细胞中炎症细胞因子的产生或制备由TLRs配体诱导的巨噬细胞中炎症细胞因子的产生的产品；

a4)制备预防和/或治疗炎症疾病的产品。

其中，

所述a1)中，所述TAK1/TABs复合体具体为TAK1-TAB1-TAB2复合体。

所述a3)中，所述炎症细胞因子包括但不限于TNF-α、IL-6和IL-1β。

所述a4)中，所述炎症疾病包括TLR相关炎症疾病，包括但不限于细菌(G

所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。诸如该产品用于构建炎症相关细胞、组织或动物模型，通过调控RNF99的表达研究TLR介导的炎症相关反应等，具有良好的实际应用价值。

同时，如上所述，该产品也可以开发为药物，其可能是未来改善内毒素血症和难治性结肠炎等TLR相关炎症疾病的重要策略。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案发现革兰氏阴性菌(G

总之，上述技术方案表明巨噬细胞中RNF99在调节TLR介导的炎症反应方面具有重要的生理意义。它为TLRs信号转导提供了新的见解，并为防治细菌感染、内毒素休克和其他炎症疾病提供了一种新的方法，因此具有良好的潜在实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中革兰氏阴性菌(G-)感染和TLRs刺激降低巨噬细胞RNF99的表达。(A)LPS(n＝5-6)、R848(n＝7)或LTA(n＝6)刺激PMs不同时间点后RNF99 mRNA的相对水平。(B)经过LPS、R848或LTA刺激不同时间后，PMs中RNF99的代表性WB图像。(C)健康者和G-感染患者外周血单核细胞中tnf-α、il-6和il-1βmRNA的相对水平(n＝15)。(D)健康和G-感染患者外周血单核细胞RNF99 mRNA相对水平(n＝15)。

图2为本发明实施例中RNF99敲除显著加重TLR介导的内毒素血症和急性结肠炎，将性别和年龄匹配的RNF99+/+和RNF99-/-小鼠腹腔注射LPS或PBS。(A)小鼠肺切片的H&E染色和组织病理学分析。比例尺＝50μm。(B)四组肺代表性CD68染色及定量分析。(C)LPS刺激的RNF99+/+和RNF99-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的ELISA分析(n＝8)。(D)LPS腹腔注射后RNF99+/+和RNF99-/-小鼠的存活率。性别和年龄匹配的RNF99+/+和RNF99-/-小鼠给予DSS饮用水7天，或作为对照(n＝8-10)。(E)每日测量体重，(F)大便柔软度，(G)出血变化。(H,I)第7天拍照测量RNF99+/+和RNF99-/-小鼠结肠长度。(J,K)观察结肠组织H&E染色后的组织病理学变化。比例尺＝50μm。(L)ELISA分析DSS处理小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平(n＝8)。

图3为本发明实施例中RNF99在巨噬细胞中调节TLRs介导的炎症性疾病，与性别和年龄相匹配的RNF99+/+小鼠骨髓细胞在辐照后被耗尽。分别从RNF99+/+或RNF99-/-小鼠供体中移植。腹腔注射LPS建立小鼠骨髓重建后内毒素血症模型。(A)骨髓移植示意图(RNF99+/+→RNF99+/+)。(B)用RNF99+/+或RNF99-/-小鼠的骨髓细胞重建的RNF99+/+小鼠在LPS诱导后的肺切片H&E染色。比例尺＝50μm。(C)ELISA分析LPS处理后小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平(n＝8)。采用DSS构建小鼠骨髓重建后急性结肠炎模型。(D)RNF99+/+小鼠移植RNF99+/+或RNF99-/-后DSS诱导的临床和病理变化。(E)DSS诱导的结肠炎小鼠结肠长度的变化。(F)DSS诱导小鼠结肠组织病理学变化。(G)DSS处理小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的ELISA分析(n＝8)。

图4为本发明实施例中RNF99缺失正向调节TLRs介导的巨噬细胞炎症细胞因子的产生和信号通路的激活。其中，(A)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠pms中LPS诱导后的TNF-α、IL-6和IL-1β的ELISA分析(n＝6)。(B)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PMs在R848诱导后的TNF-α、IL-6和IL-1β的RT-PCR和ELISA分析(n＝6)。(C)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PM中LTA诱导后的TNF-α、IL-6的RT-PCR和ELISA分析(D,E)LPS,R848或LTA刺激后的RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PMs中IκB-α、P65、ERK、JNK和P38磷酸化水平的WB分析。

图5为本发明实施例中RNF99过表达负向调节TLRs介导的巨噬细胞炎症细胞因子的产生和信号通路的激活。(A)ELISA分析(空载体、RNF99-WT或RNF99-△Ring)过表达和LPS刺激后PMs中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。(B-D)免疫印迹分析(空载体、RNF99-wt或RNF99-△Ring)过表达后IκB-α,P65,ERK,JNK和P38在LPS，R848或LTA刺激后的磷酸化水平改变。

图6为本发明实施例中RNF99通过促进TAB2降解影响TAK1-TAB1-TAB2复合体的形成。(A)293-TLR4细胞中IKK-α、IKK-β、IKK-γ、TAB1、TAB2、TBK1、IRAK-1、IRAK-4、TRAF6、TAK1与空载体或RNF99共转染后WB检测的代表性图像。(B)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PMs中TAK1、TRAF6、TAB1、TAB2、IRAK-1和IRAK-4的WB检测的代表性图像。(C)293-TLR4细胞中不同类型Myc-RNF99(WT，△Ring和C94/97A)对HA-TAB2表达影响。(D)293-TLR4细胞中Myc-RNF99在DMSO、MG132、Bortezomib,、NH4Cl或chloroquine预处理下对HA-TAB2的表达影响。(E)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PMs中经LPS刺激后pTAK1的表达。(F)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PMs中经LPS刺激后与TAK1结合的中TAB1的变化。

图7为本发明实施例中RNF99与TAB2相互作用。(A)LPS处理的293-TLR4细胞中Flag-TAB2和GFP-RNF99相互作用的CO-IP分析。(B)LPS处理的PMs中TAB2和RNF99相互作用的CO-IP分析。(C)在LPS处理的293-TLR4细胞中GFP-TAB2和Flag-RNF99共定位。(D)RNF99(WT)及其截断突变体构建的示意图。(E)293-TLR4细胞中RNF99截断突变体与GFP-TAB2相互作用的CO-IP分析。

图8为本发明实施例中RNF99对TAB2的K611位点进行k48位的泛素化修饰。(A)293-TLR4细胞中在不同类型UB(WT,K48，或K63)表达下Myc-RNF99对Flag-TAB2泛素化修饰的CO-IP分析。(B)用HA-UB-K48和Flag-RNF99(WT)、Flag-RNF99-ΔRing或Flag-RNF99(C53A/C56A)质粒转染的293-TLR4细胞中GFP-TAB2泛素化修饰的CO-IP分析。(C)RNF99+/+或RNF99-/-小鼠PMs中LPS刺激后TAB2泛素化修饰的TUBE分析。(D)293-TLR4细胞中Myc-RNF99对Flag-RNF99点突变体(K522R、K611R、K653R和K656R)泛素化修饰的CO-IP分析。(E)293-TLR4细胞中Myc-RNF99对Flag-RNF99点突变体(K522R,K611R,K653R,K656R,K653/656R)的降解分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如前所述，RNF99是E3连接酶TRIM家族的新成员，其在不同疾病中的功能和作用机制还有待进一步研究。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供检测E3泛素连接酶RNF99编码基因和/或RNF99编码基因表达产物表达水平的物质在制备筛查、诊断(辅助诊断)、检测、监测或预测炎症疾病进展产品中的应用。

试验证明，利用TLR4配体-脂多糖LPS刺激后，RNF99的mRNA和蛋白水平均显著下调。同时在TLR7/8配体-R848和TLR6配体脂磷壁酸LTA处理下得到了类似的结果。表明RNF99可能是TLR介导的先天免疫反应的反馈调节因子。同时，检测发现与健康受试者相比，G

所述RNF99编码基因及其表达产物可以为人源和非人哺乳动物(如小鼠等)源；RNF99编码基因的表达产物显然可以是E3泛素连接酶RNF99。

所述炎症疾病具体可以为TLR相关炎症疾病，包括但不限于细菌(G

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于筛查、诊断(辅助诊断)、检测、监测或预测炎症疾病进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测受试者RNF99编码基因的转录；或基于免疫检测方法检测受试者E3泛素连接酶RNF99表达情况的物质。

本发明的又一具体实施方式中，可以采用包括但不限于液相杂交、Northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测受试者RNF99编码基因的转录；采用包括但不限于ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片检测受试者E3泛素连接酶RNF99表达情况。

所述受试者可以为人和非人哺乳动物(如小鼠)。

所述产品可以为试剂盒。

本发明的又一具体实施方式中，提供促进RNF99编码基因及其表达产物表达和/或活性提高的物质在如下a1)-a4)至少一种中的应用：

a1)促进TAB2蛋白的K611位点的K48位泛素化修饰和蛋白酶体降解，进而抑制TAK1/TABs复合体的形成和TAK1激酶的激活或制备促进TAB2蛋白的K611位点的K48位泛素化修饰和蛋白酶体降解，进而抑制TAK1/TABs复合体的形成和TAK1激酶的激活的产品；

a2)抑制NF-κB和MAPKs信号通路的激活或抑制NF-κB和MAPKs信号通路激活的产品；

a3)抑制由TLRs配体诱导的巨噬细胞中炎症细胞因子的产生或制备由TLRs配体诱导的巨噬细胞中炎症细胞因子的产生的产品；

a4)制备预防和/或治疗炎症疾病的产品。

其中，促进RNF99编码基因及其表达产物表达和/或活性提高的物质包括但不限于采用基于基因特异性Mimics技术上调RNF99编码基因表达和/或促进其活性的物质；如人工合成RNF99的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，或上调RNF99表达的启动子或者慢病毒等；同时也可包括化合物类促进剂。

其中，

所述a1)中，所述TAK1/TABs复合体具体为TAK1-TAB1-TAB2复合体。

所述a3)中，所述炎症细胞因子包括但不限于TNF-α、IL-6和IL-1β。

所述a4)中，所述炎症疾病包括TLR相关炎症疾病，包括但不限于细菌(G

所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。诸如该产品用于构建炎症相关细胞、组织或动物模型，通过调控RNF99的表达研究TLR介导的炎症相关反应等，具有良好的实际应用价值。

当然，抑制RNF99编码基因及其表达产物表达和/或降低的物质可加剧TLRs介导的炎症性疾病(如内毒素血症和结肠炎)的发生。因此，抑制RNF99编码基因及其表达产物表达和/或降低的物质(如基于CRISPR/Case9技术敲除RNF99编码基因的物质)可用于内毒素血症和结肠炎动物(如小鼠等)模型的构建，从而进行相关科学研究。

同时，如上所述，该产品也可以开发为药物，其可能是未来改善内毒素血症和难治性结肠炎等TLR相关炎症疾病的重要策略。

根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。

所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可以为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂具体可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由口、静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用；特别的，本发明所述药物可以采用骨髓移植的方式进行施用，这在本发明具体实施例中已经有详细示例，这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

1.材料方法

动物和细胞

以C57BL/6J为背景的RNF99-/-小鼠由北京唯尚立德生物技术公司使用CRISPR/Cas9技术生产。利用以下引物对尾巴末端基因组DNA扩增的PCR片段进行测序，确定缺陷小鼠的基因分型:Forward 5'-tgcctacaacttccagaatgc-3'和Reverse 5'-CATCTAAGTGCCTCGCTTCC-3'。实验前，小鼠与C57BL/6J小鼠回交>10代。动物采用随机数字表随机分组，实验中使用RNF99-/-小鼠的同窝对照，以避免潜在的冲突结果。根据我们的初步实验，我们设置显著性水平(α)为0.05，1-β为80％来确定样本量。每组的确切数量包含在各自的图图例中。

PMs从RNF99-/-小鼠和它们的对照鼠(RNF99+/+)中获得。HEK293TLR4细胞购自InvivoGen。细胞在DMEM(Gibco,USA)中培养，DMEM中添加10％胎牛血清(Gibco,USA)和1％青霉素-链霉素(Gibco,USA)。

人类血液样本的采集

采集经血培养证实为革兰氏阴性(G-)菌感染的患者的血液样本。病原菌包括以下15株:5株铜绿假单胞菌、4株鲍曼不动杆菌、3株大肠埃希菌、1株脆弱拟杆菌、1株阴沟肠杆菌和1株洋葱伯克霍尔德菌。同时在身体健康的对照个体中采集血液样本，血液培养细菌感染阴性。分别采集全血和血清样本。全血样本的外周血单核细胞采用Fitc标记的抗cd14

LPS诱导的小鼠内毒素

内毒素研究采用年龄匹配(8周龄)的RNF99+/+和RNF99-/-雌雄小鼠腹腔注射LPS(40μg/g)或PBS作为对照组。每12h监测一部分小鼠存活情况，4h后处死其余小鼠观察肺组织变化，采血后采用相应的ELISA试剂盒测定血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

DSS诱导的小鼠结肠炎

在炎症性结肠炎研究中，年龄匹配(8周龄)的RNF99+/+和RNF99-/-雌雄小鼠分别饲喂3.5％(w/v)DSS饮用水6～7天，建立结肠炎模型。每24小时监测体重、粪便硬度和粪便隐血的存在情况并进行评分。最后一天处死小鼠后采集外周血，测量全结肠长度，收集直肠附近结肠组织进行苏木精和伊红(H&E)染色，观察病理变化。

骨髓移植

每只受体小鼠(8周龄)在移植前1周和移植后4周分别接受2次(间隔4小时)5Gy(共10Gy)的辐射，并接受含有抗生素的饮用水(多粘菌素B硫酸酯，6000U/ml和新霉素，100μg/ml,)。取8周龄RNF99+/+和RNF99-/-小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，经尾静脉分别移植5×10

组织学检查

取RNF99+/+和RNF99-/-小鼠结肠和肺，4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，5μm切片。根据制造商的说明，使用染色试剂盒(Solarbio，北京，中国)进行H&E染色。然后，用光学显微镜进行组织学检查。根据肺泡间隔增厚、出血和炎症情况对肺损伤进行评分。结肠炎的严重程度根据既往研究的病变程度进行分析。

试剂和抗体

LPS(Escherichia coli,055:B5)购自Sigma-Aldrich(MO,USA)。R848和LTA采购自InvivoGen。使用的激动剂浓度为:LPS 100ng/ml,R848 10μg/ml,LTA 10μg/ml。葡聚糖硫酸钠(DSS,36-50kDa)购自MP生物医药公司。MG132(T2154)和Bortezomib(T2399)购自Topscience，氯喹(HY-17589A)和ATP(HY-B2176)购自MCE。Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen,USA)用于短暂转染293-TLR细胞。针对p-P65(Ser536)(3033)、p65(8242)、phospho-JNK(Thr183/Tyr185)(4668)、JNK(9252)、p-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(4370)、p44/42MAPK(Erk1/2)(4695)、p-p38 MAPK(Erk1/2)(4695)、p-p38 MAPK(4511)、p-IkBα(Ser32)(2859)、IkBα(4814)、TAB1(3226)、TAB2(3745)、TAK1(5206)、pTAK1(Thr184/Tyr187)(4508)、IRAK1(4504)、IRAK4(4363)、GFP(2956)和GAPDH(2118)的抗体来自CST。抗IgG抗体(AB172730)、抗泛素抗体(Ab134953)、抗k48-泛素抗体(Ab140601)和抗k63泛素抗体(Ab179434)的抗体均来自Abcam。靶向RNF99(SAB2102558)和Flag(F1804)的抗体来自Sigma-Aldrich。Myc(TA150121)和HA tag(TA180128)抗体均来自Origene。ProteinA/G PLUS(sc-2003)来自Santa Cruz Biotechnology(CA,USA)，Anti-FLAG(M2)亲和凝胶(A2220)和3xFLAG肽(F4799)来自Sigma-Aldrich。E1、UbcH5a、泛素(WT)、泛素(K48)和泛素(K63)购自Boston Biochem(美国)。

RT-PCR分析

使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,74106,Germany)按照制造商说明从PMs或BMDMs中提取总RNA，用Prime Script RT试剂试剂盒(047a,TaKaRa,Japan)进行反转录。采用LightCycler480仪器(瑞士罗氏LightCycler480)和SYBR Green PCR Master Mix(瑞士罗氏)进行逆转录产物扩增，循环条件为:95℃10min变性，40个循环扩增(95℃15s,55℃15s,72℃20s)。结果以β-actin水平归一化，用2

ELISA

使用从R&D Systems购买的ELISA试剂盒检测从小鼠血液或细胞孵育上清中收集的样本中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平。从健康和G-感染个体收集的人血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，使用从DAKEWE生物技术(中国深圳)购买的ELISA试剂盒进行测定。

免疫共沉淀(CO-IP)，免疫印迹(Western blot，WB)分析和泛素化分析

用于免疫印迹分析的细胞在含有蛋白酶抑制剂的Cell Lysis(Sigma-Aldrich,USA)中裂解，并在12 000x g的条件下离心10分钟。使用BCA蛋白检测试剂盒(ThermoFisher Scientific,USA)测定上清蛋白浓度，并使其在所有样品中相等。进行Co-IP时，使用含有蛋白抑制剂的IP缓冲液中裂解细胞总提取物，在12 000x g离心10分钟。收集上清，与protein A/G plus agarose及相应抗体或抗flag(M2)亲和凝胶孵育过夜。然后用IP缓冲液洗涤五次，并用3xFlag肽洗脱。然后将样本在蛋白上样缓冲液(DL101-02,Tans Gene,Beijing)中煮沸，进行SDS-PAGE。使用全细胞裂解物和IP样品进行WB。蛋白质在10％ SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，由BSA阻断。然后与适当的抗体孵育过夜，然后与二级酶标抗体孵育1h。使用ECL试剂盒(Merck Millipore,USA)检测条带。

泛素化实验中，细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，并立即在2％(vol/vol)SDS存在下煮沸10分钟。然后用裂解缓冲液稀释裂解产物，直到SDS浓度降低到0.1％，用于进一步的免疫沉淀检查。

TUBE检测

LPS刺激后，PMs在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解并离心。上清液加入TUBE磁珠(WT,K48或K63)，4℃孵育2h。TBST洗涤4次后，洗脱内源性泛素，用免疫印迹法进行分析。

激光共聚焦检测

用GFP-TAB2和Flag-RNF99过表达质粒转染293-TLR4细胞。24h后，用4％多聚甲醛固定细胞，用5％牛血清白蛋白封闭细胞30分钟。然后用指示的一抗孵育细胞一夜，然后用荧光染料偶联二抗孵育细胞。同时建立IgG阴性对照作为一抗对照和溶剂PBS对照，验证抗体，排除假阳性结果。细胞核用DAPI染色(Sigma-Aldrich,USA)，用Leica激光扫描共聚焦显微镜观察细胞。

腺病毒感染

RNF99-△Ring和RNF99-C94/97A的腺病毒在博尚生物科技公司(中国上海)构建后进行转染，在MOI＝600的条件下用5μg/ml polybrene转染PMs 48h。

统计分析

每个实验至少重复三次。所有数据均使用GraphPad Prism 8软件(GraphPad,SanDiego,CA,USA)进行分析，并以均数±标准误差(SEM)表示。首先，采用Shapiro–Wilk检验数据是否服从正态分布。对于属于正态分布的单变量数据，采用unpaired two-tailedStudent’s t-tests分析两组间的统计差异。单变量多组间的统计差异采用单因素方差分析，然后采用Dunnett's或Tukey's事后检验。两变量多组间的统计分析采用Two-way ANOVA分析并进行Tukey或Sidak事后检验。对于不属于正态分布的单变量数据，采用Kruskal-Wallis检验和Dunnett’s事后检验进行多次比较。在所有的统计比较中，p值<0.05被认为有统计学意义，不显著的p值未显示。

2.实验结果

TLRs刺激和革兰氏阴性杆菌(G-)感染明显降低巨噬细胞中RNF99的表达

从野生型(WT)C57BL/6J小鼠中提取腹腔原代巨噬细胞(PMs)，利用TLR4配体-LPS刺激后，RNF99的mRNA(图1A)和蛋白(图1B)水平均显著下调。同时在TLR7/8配体-R848和TLR6配体LTA处理下得到了类似的结果。这进一步提示RNF99可能是TLR介导的先天免疫反应的反馈调节因子。

LPS是一种TLR4配体，是G-细菌细胞壁的关键成分。我们收集G-感染患者和健康人的外周血，流式细胞仪对CD14+单核细胞进行分选，检测发现与健康受试者相比，G-感染患者的TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA水平显著升高(图1C)。然而，RNF99水平降低(图1D)，提示其在单核细胞中的表达可能与细菌感染密切相关。

RNF99敲除对TLRs介导的内毒素血症和急性结肠炎的影响

为了明确RNF99在TLR介导的先天炎症反应中的作用，我们使用CRISPR/Case9技术构建了RNF99敲除小鼠(RNF99-/-)，用TLR配体处理小鼠，建立LPS诱导内毒素血症和肺损伤的体内模型，研究TLR相关分子机制和炎症相关肺损伤的潜在治疗方法。与WT同窝对照(RNF99+/+)相比，在LPS刺激后，RNF99-/-小鼠肺内炎症细胞浸润和间质性肺炎显著加剧(图2A,B)，RNF99-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌也显著上调(图2C)。在LPS致死性刺激下，RNF99-/-小鼠出现更早的死亡并表现出更高的死亡率(图2D)。这些均数据表明，RNF99在体内负向调节内毒素介导的炎症性疾病。

肠道菌群异常诱导巨噬细胞TLRs信号的激活并介导炎症反应，是IBD发生发展的重要事件。DSS诱导的结肠炎是研究IBD机制的经典炎症模型。因此，我们进一步研究了RNF99缺失对DSS介导的炎症反应的影响。结果显示，与RNF99+/+小鼠相比，RNF99-/-小鼠结肠炎的临床表现明显加重，主要表现为体重减轻(图2E)，软便(图2F)，便血加重(图2G)，同时小鼠结肠缩短(图2H，I)。结肠切片的H&E染色显示黏膜破坏加重，炎症细胞浸润增多(图2J,K)。此外，小鼠外周血促炎因子表达明显上调(图2L)。总的来说，RNF99缺乏显著加重了TLR介导的内毒素血症和急性结肠炎的严重程度。

巨噬细胞中的RNF99参与调节TLRs介导的炎症性疾病

为了进一步证明巨噬细胞中的RNF99在TLR介导的炎症疾病中发挥关键作用，我们将RNF99+/+或RNF99-/-小鼠供体的骨髓细胞移植到辐照的RNF99+/+小鼠(RNF99+/+→RNF99+/+或RNF99-/-→RNF99+/+)(图3A)。然后用LPS刺激嵌合小鼠诱导内毒素血症或利DSS诱导急性结肠炎。与RNF99+/+→RNF99+/+小鼠相比，RNF99-/-→RNF99+/+小鼠在H&E染色的肺切片上显示严重的肺损伤(图3B)，LPS刺激后促炎因子产生增加(图3C)。与LPS刺激后的RNF99+/+→RNF99-/-小鼠相比，RNF99-/-→RNF99-/-小鼠也表现出肺炎症加重和促炎因子产生增加。DSS诱导结肠炎后，小鼠的临床和病理变化显示，与RNF99+/+→RNF99+/+小鼠相比，RNF99-/-→RNF99+/+小鼠表现为体重减轻加重、大便软软、便血(图3D)、结肠缩短(图3E)、黏膜破坏、炎症细胞浸润增多(图3F)和促炎因子产生增多(图3G)。这些结果表明，带有RNF99-/-骨髓细胞的小鼠对LPS诱导的内毒素和DSS诱导的结肠炎更敏感。综上所述，巨噬细胞中RNF99在对抗TLR引发的炎症性疾病中发挥重要作用。RNF99缺失加重巨噬细胞中TLRs介导的炎性细胞因子的产生

RNF99作为巨噬细胞中重要的E3泛素连接酶，在TLRs介导的免疫应答中的作用尚不清楚。为了阐明这一点，我们分别从RNF99+/+和RNF99-/-小鼠中提取PMs，并用LPS、R848和LTA等不同TLR配体处理后显示，与RNF99+/+小鼠相比，RNF99-/-小鼠在LPS(图4A)、R848(图4B)和LTA(图4C)刺激后，TNF-α、IL-6和IL-1β显著上调。

TLR介导的炎症因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的产生主要依赖于NF-κB和MAPKs的激活和转导。提取RNF99+/+和RNF99-/-小鼠的PMs和BMDMs，用LPS、R848或LTA处理。与RNF99+/+小鼠相比，RNF99-/-小鼠PMs(图4D,E)中IκB-α、P65的磷酸化水平以及MAPK激活标志ERK、JNK、P38的磷酸化水平均显著升高。结果证实，巨噬细胞RNF99缺失增强了TLRs诱导的NF-κB和MAPK信号通路的激活。

RNF99过表达负向调控TLRs介导的巨噬细胞炎症细胞因子的产生和信号通路的激活

RNF99作为TRIM家族的一员，具有Ring、coil-coil、B-box和Filamin结构域，其中Ring结构域是其发挥E3泛素连接酶功能的关键。为了进一步阐明RNF99在TLR介导的炎症细胞因子产生中的作用，我们构建了表达野生型RNF99(RNF99-WT)、Ring缺失突变体(△-Ring)和点突变体(C94/97A)的腺病毒质粒。△-Ring和C94/97A突变体都失去了E3泛素连接酶的功能。在LPS处理小鼠PMs中发现，RNF99过表达可显著缓解TLR介导的炎症因子分泌(图5A)，以及NF-κB和MAPKs信号激活(图5B-D)。△-Ring和C94/97A的过表达则没有这种作用，提示RNF99的E3泛素连接酶活性的重要作用。这些结果进一步表明，RNF99可以负向调节TLR介导的炎症细胞因子的产生，并且这种作用与其E3泛素连接酶功能密切相关。

RNF99通过促进TAB2降解影响TAK1-TAB1-TAB2复合体的形成

为了阐明RNF99对TLRs诱导的促炎细胞因子产生和NF-κB-MAPK信号通路激活的调控机制，我们探索了TLRs介导的信号通路中RNF99的靶分子。我们将IKK-α、IKK-β、IKK-γ、IRAK-1、IRAK-4、TRAF6、TAK1、TAB1、TAB2与RNF99共转染293-TLR4细胞株，并用LPS处理显示RNF99过表达显著降低了TAB2的蛋白水平，但对其他通路蛋白的表达没有影响(图6A)。同样，LPS刺激RNF99+/+和RNF99-/-小鼠PMs后，只有TAB2表达增加，而其他通路蛋白的表达没有变化(图6B)。这些结果表明，TAB2可能是RNF99在TLRs通路中的靶点。为了进一步阐明RNF99对TAB2表达的影响，我们在293-TLR4细胞中将TAB2与RNF99过表达。结果发现，随着RNF99的过表达，TAB2的表达量出现相应的下降，而当RNF99的△-Ring和C94/97A突变体与TAB2共转染时，其降解作用消失，说明RNF99降解TAB2依赖于其E3泛素连接酶功能(图6C)。为了进一步研究RNF99如何下调TAB2，我们使用了蛋白酶体抑制剂(MG132和bortezomib)和溶酶体途径抑制剂(chloroquine和NH

TAK1-TABs复合体对TLR介导的信号转导至关重要，而TAB2在这一过程中起着至关重要的作用。我们进一步探索了RNF99对TAK-TABs复合物的影响，发现在RNF99-/-小鼠PMs中，TAB2的增加，LPS诱导的TAK磷酸化显著增强(图6E)。同时，敲除RNF99后，TAK1与TAB1的结合显著增加(图6F)。这些结果证实了RNF99影响TAK1-TABs复合体的形成。RNF99与TAB2相互作用

我们前面的研究结果显示RNF99特异性地介导了TAB2的降解，这表明TAB2可能是RNF99的直接靶点。为了完善调控机制，我们进一步在293-TLR4细胞中证实了RNF99和TAB2(图7A)的结合。此外，通过PMs中内源性CO-IP也证实了RNF99和TAB2之间的相互作用(图7B)。在293-TLR4细胞中过表达RNF99和TAB2后，进行细胞免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜显示RNF99和TAB2在细胞中有明显的共定位(图7C)。以上数据均表明RNF99与TAB2之间存在密切的相互作用。

为了确定RNF99中负责相互作用的片段，我们根据蛋白质结构生成了一系列截断突变体(图7D)。我们发现RNF99中的coil-coil是与TAB2结合的结构域(图7E)。综上所述，我们的研究结果表明TAB2是RNF99在TLRs信号通路中的靶分子。

RNF99介导TAB2的K611位点的k48位泛素化修饰

蛋白质泛素化修饰与泛素-蛋白酶体降解途径密切相关。在证明了RNF99通过蛋白酶体途径介导TAB2的降解，并且这种降解依赖于E3泛素连接酶的活性后，我们进一步探索了RNF99是否可以介导TAB2的泛素修饰。泛素分子包含7个赖氨酸位点(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)。K48和k63位的泛素化是研究最多的两种泛素化类型，K48位的泛素化常被报道参与蛋白酶体降解。我们将Myc-RNF99和Flag-TAB2与不同类型的泛素(WT、K48和K63)在细胞中过表达。结果表明，RNF99可以显著促进TAB2的野生型(WT)和K48位的泛素化修饰，但对K63位的泛素化水平没有影响(图8A)，没有E3泛素连接酶功能的RNF99则不会影响TAB2的K48位的泛素化修饰水平(图8B)。在LPS处理RNF99+/+和RNF99-/-小鼠的PMs后，RNF99-/-小鼠的内源性的TAB2 K48位的泛素化修饰水平显著降低(图8C)。

既往TAB2泛素化组学研究预测TAB2的522、611、653和656位赖氨酸可被泛素化修饰。然而，调控这些位点泛素化修饰的E3连接酶尚未被发现。为了阐明TAB2上哪个赖氨酸位点可被RNF99泛素化修饰，我们构建了TAB2不同赖氨酸位点(K522R、K611R、K653R和K656R)的突变过表达质粒并将其在293-TLR4细胞中与Myc-RNF99和泛素共转染，CO-IP实验发现，RNF99对K611R突变体失去了泛素化修饰功能，说明K611是RNF99对TAB2泛素化修饰的位点(图8D)。另外，TAB2中的K611发生突变后，RNF99对TAB2的降解作用消失(图8E)。泛素化修饰的赖氨酸位点与的降解位点一致。这些结果表明RNF99通过泛素化修饰TAB2的611位赖氨酸进而促进其蛋白酶体途径的降解，从而通过抑制NF-κB和MAPK信号通路，进而在先天免疫应答中发挥重要作用。

综上，我们证明了RNF99是TLR信号通路的关键调控因子。RNF99通过促进TAB2K611位点的K48位泛素化修饰和蛋白酶体降解，抑制了TAK-TABs复合体的形成和下游NF-κB和MAPKs信号通路的激活，从而下调促炎因子的产生。我们的研究首次证明，RNF99可能是一种有前景的诊断生物标志物和治疗靶点，可用于TLR相关炎症疾病的治疗。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。