E3泛素连接酶RNF170负向调控TLR3介导的天然免疫反应及其机制研究

摘要

天然免疫反应是机体抵抗外来病原微生物入侵的第一道防线，天然免疫反应的不足或过强会导致一系列相关疾病的发生，因此对天然免疫反应的精确调控研究具有重要的临床意义。当外来病原微生物入侵机体时，模式识别受体（PRRs）能够与相应配体结合，激活下游的NF-κB、MAPK、IRF3信号通路，产生Ⅰ型干扰素和炎症因子。模式识别受体(PRRs)主要包括RIG-Ⅰ样受体、Toll样受体、NOD样受体及部分DNA病毒识别受体。其中，在Toll样受体中，TLR3受体能够识别病毒的dsRNA，dsRNA是RNA、DNA病毒在复制过程中产生的中间产物，且坏死细胞也能够释放dsRNA。因此，对TLR3信号通路的调控机制研究具有重要的临床意义。 翻译后修饰(Post-translational modification，PTM)在天然免疫反应中扮演重要角色。已有文献报道，TLR3在激活过程中存在其第759位与第858位酪氨酸的磷酸化修饰，且这两个位点的磷酸化修饰对TLR3与下游信号分子TRIF的结合必不可少。然而，想问TLR3是否存在其他形式的翻译后修饰呢？ 为了寻找参与TLR3天然免疫反应中新的调控分子，在poly(I∶C)处理1.5小时的小鼠细胞中免疫沉淀TLR3，通过质谱方法寻找与TLR3相互作用的蛋白质，发现了一个新的E3泛素连接酶ring finger protein170(RNF170)。随后对RNF170进行了详细的功能和机制研究。通过细胞和小鼠水平的基因敲除，以及细胞水平过表达等实验，发现RNF170能够负向调控TLR3介导的天然免疫信号通路，从而抑制Ⅰ型干扰素和炎症因子的产生。体内实验发现，腹腔注射poly(I∶C)后，RNF170敲除小鼠与野生型小鼠相比，炎症性死亡的概率显着升高。 RNF170有两个功能性结构域RING和TM结构域，TLR3有三个功能性结构域LRR、TM和TIR结构域，发现RNF170能与TLR3的TIR结构域相互作用。在机制研究中，RNF170作为E3泛素连接酶对TLR3进行K48位连接的多聚泛素化修饰从而经蛋白酶体途径降解TLR3蛋白，并抑制下游信号通路中NF-κB和IRF3的转录活性。TLR3的TIR结构域有11个赖氨酸位点，随后对每个赖氨酸位点进行点突变，构建突变体。通过免疫共沉淀及双荧光素酶报告实验，确定了K766是RNF170对TLR3进行K48位多聚泛素化修饰的位点。 综上所述，RNF170具有重要的天然免疫负向调控作用。因此，我们的研究结果具有临床指导和转化价值，且为新药开发奠定理论基础。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1实验小鼠

1．2细胞系与病原体

1．3主要试剂和抗体

1．4分子克隆

1．5主要设备及软件

2．实验方法

2．1载体构建

2．2小鼠原代腹腔巨噬细胞分离培养

2．3小鼠骨髓来源的树突状细胞分离培养

2．4 RNA的抽提，反转录及荧光定量PCR(qRT-PCR)

2．5流式细胞分析

2．6 ELISA

2．7免疫印迹及免疫沉淀实验

2．8体外蛋白纯化及GST-pull down实验

2．9免疫荧光

2．10 双荧光素酶报告基因检测

2．11 质谱兼容的硝酸银染色

2．12 RNF170 KO小鼠的制备及鉴定

2．13 细胞质粒转染

2．14 数据统计学分析

实验结果

1．2 RNF170与TLR3直接相互作用

1．3 RNF170与TLR3在poly(I:C)刺激前后存在细胞内共定位

2．RNF170负向调控TLR3信号通路

2．1在RAW264．7细胞中，RNF170能负向调控TLR3信号通路

2．2在树突状细胞和腹腔巨噬细胞中，RNF170能负向调控TLR3信号通路

3．Rnf170缺失的小鼠更易发生poly(I:C)诱导的炎症性死亡

4．RNF170对TLR3信号通路的抑制作用依赖于其E3泛素连接酶活性

4．2 RNF170能够介导TLR3的TIR结构域发生泛素化修饰

4．3 RNF170对TLR3的泛素化修饰依赖于其E3泛素连接酶活性

5．RNF170能够介导TLR3发生K48位多聚泛素化修饰

5．2放线菌酮(CHX)实验进一步验证了RNF170能够降低TLR3的蛋白水平

5．3 RNF170介导TLR3发生K48位连接的多聚泛素化修饰

6．RNF170对TLR3 K766泛素化修饰负向调控TLR3介导的天然免疫反应

6．1 RNF170不能介导TLR3的K766R突变体发生泛素化修饰

6．2 RNF170失去对TLR3K766R突变体下游信号通路的抑制能力

讨论

结论

参考文献

缩略词表

TLR3在天然免疫抗病毒反应中的功能及研究机制进展

攻读硕士期间发表的文章

致谢

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