法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-07-18
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N15/14 专利申请号:2023104141366 申请日:20230418
实质审查的生效
2023-06-30
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于生物化学技术领域,涉及一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法;具体的说,涉及一种基于点击化学技术表征与分离能特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的方法。
背景技术
人体肠道中生存着约10万亿个细菌,包含数百或数千个细菌分类群体,它们对人体的健康发挥至关重要的作用。肠道菌群通过初级或次级代谢途径产生许多小分子,其中一些保留在肠道中,还有一些会进入循环被宿主化学修饰或通过尿液排出。不同的肠道细菌会特异性摄取不同的营养成分,如拟杆菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属主要摄取并代谢膳食鞘氨醇,拟杆菌属,双歧杆菌属、肠球菌属和副拟杆菌属是饮食来源胆固醇的主要互作微生物。
天然产物,包括氨基酸、多糖、维生素、脂肪、生物碱、黄酮、萜类、酚类、甾体化合物等,已被证明可以通过调节肠道菌群的平衡来预防和治疗多种疾病。天然产物不仅作用于肠道菌群,通过抑制或促进部分菌属的生长,改变肠道菌群结构,进而发挥其效应,也会被肠道菌群代谢转化,包括水解、脱糖基、酶解等反应。
点击化学又称“链接化学”,是通过小单元的拼接,快速、可靠地完成各种分子的化学合成,代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应。点击化学反应快速、操作简单,且反应条件温和、副产物对细胞无毒害。除了化学合成,点击化学技术已被应用于药物靶点鉴定、新药研发、癌症追踪、分子识别与传感等多个领域。
研究肠道微生物对天然产物的摄取与代谢所面临的一个巨大挑战是肠道微生物的种类繁多,使用传统的单一菌种培养的方法去筛选成千上万的分离菌种是否能代谢某种化合物成本高、周期长。且有些菌种难以分离培养,因此,传统的方法不能囊括所有的肠道微生物。
同时,单一培养的菌种和混合培养的细菌群体之间存在基因表达和生化转化过程的差异。在单一培养的细菌中不被代谢的化合物,有可能在混合培养中被细菌摄取利用,因此,传统单一菌种培养的方法并不适用于模拟肠道菌群对化合物摄取利用的高通量筛选。
发明内容
发明目的:本发明目的在于针对现有技术的不足,提供一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法,为研究天然产物和肠道微生物互作提供新思路。
本发明是一种基于点击化学技术快速表征与分离能特异性摄取或代谢某种天然产物的细菌方法。包括了体外共培养、点击化学反应和流式细胞分选三个步骤。与单一菌种培养研究代谢与利用的方法相比,本发明的方法成本低、周期短。
本发明基于点击化学中具有代表性的炔烃-叠氮环加成反应,对特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群进行表征与分离。天然产物结构末端使用炔基修饰,荧光染料AlexaFluor 647末端使用叠氮修饰。细菌摄取炔基修饰的天然产物或仍然保留炔基的天然产物代谢物后,与后续加入的AF647叠氮化物进行点击化学反应,从而被标记上红色荧光。使用流式细胞分选仪分离出AF647
技术方案:本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明提供了一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法,包括以下步骤:
(1)体外共培养:将菌群与天然产物在培养基中共培养;
(2)点击化学反应:将经步骤(1)培养的细菌进行铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应;
(3)流式细胞分选:摄取天然产物或天然产物代谢物的细菌被叠氮化的荧光染料标记,通过流式细胞分选仪收集能摄取和不能摄取天然产物的细菌。
本发明一种优选地可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法,包括以下步骤:
(1)将菌群与天然产物在液体培养基中共培养,分组为:空白对照组,未修饰天然产物组和炔基修饰天然产物组;
(2)收集细菌沉淀,细菌细胞固定、通透后,与叠氮荧光染料进行点击化学反应;
(3)采用流式细胞分选仪,根据空白对照组和未修饰天然产物组圈出荧光信号阴性细菌群体所在区域,根据炔基修饰天然产物组圈出荧光信号阳性细菌群体所在区域;调节细胞分选参数,收集阴性和阳性的细菌群体。
进一步优选地,所述菌群为粪便菌群;所述天然产物选自姜黄素、麦角甾醇、肉豆蔻酸、牛磺酸、白藜芦醇、葛根素、雷公藤内酯酮、高黄芩素、柚皮素或槲皮苷中的任意一种。
进一步地,步骤(1)中,所述培养时间为6~48h,所述天然产物浓度为20~500μM,所述培养基组分以每升计,包括:5.0~10.0g蛋白胨,1.0~3.5g大豆胨,4.0~6.0g示胨,8.0~11.0g血清消化粉,2.0~3.0g牛肉浸粉,2.0~3.0g酵母浸粉,1.0~2.0g肝浸粉,5.0~6.0g可溶性淀粉,0.5~1.0g葡萄糖,1.0~3.0g氯化钠,2.5~3.0g磷酸二氢钾,0.2~1.0g L-色氨酸,0.2~1.0g L-精氨酸,0.3~1.0g L-半胱氨酸盐酸盐,0.3~1.0g硫乙醇酸钠,0.001~0.01g氯化血红素,0.001~0.01g维生素K
进一步地,步骤(2)中,所述收集细菌沉淀的方法为:以18000g离心5~10min收集细菌沉淀,加入1mL 1% BSA/PBS,洗涤三次。
进一步地,步骤(2)中,所述细胞细菌固定方法为:细菌沉淀加入0.5~1mL 4%多聚甲醛固定液,室温下固定10~20min,然后洗涤一次。
进一步地,步骤(2)中,所述通透方法为:加入0.5~1mL免疫染色通透液Triton X-100,室温下孵育20~30min,洗涤后重悬于100~300μL 1% BSA/PBS备用。
进一步地,步骤(2)中,所述叠氮荧光染料为Alexa Fluor 647叠氮化物。
进一步地,步骤(2)中,所述点击化学反应方法为:使用点击化学反应缓冲试剂盒(Click Chemistry Reaction Buffer Kit),50μL菌液加入109μL反应缓冲液(ReactionBuffer A)和1μL叠氮荧光染料,叠氮荧光染料终浓度为1~10μM,短暂涡旋混合均匀;加入20μL添加剂(Additive 1),短暂涡旋混合均匀;加入20μL硫酸铜(Copper(II)Sulfate),短暂涡旋混合均匀;加入10μL还原剂(Reducing Agent),短暂涡旋混合均匀,开始点击化学反应,室温避光孵育30~60min;用1mL 1% BSA/PBS洗涤3~5次,细菌沉淀重悬于1~1.5mL无菌PBS中备用。
进一步地,步骤(3)中,所述细胞分选参数为喷嘴:70μm,频率:85~90kHz,振幅:5.0~5.5V,液滴延迟:47.0~47.5,鞘液压力:65~75psi。
有益效果:
本发明将点击化学技术应用在研究肠道菌群对天然产物的摄取与利用上,基于点击化学反应中AF647荧光染料的流式分选可以将摄取或代谢天然产物的菌群分离出来。本发明首先证明了炔基修饰前后的天然产物对粪便菌群及培养液的状态没有显著性影响,然后将与炔基修饰的天然产物共培养后的细菌进行铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应,所有摄取天然产物或天然产物代谢物的细菌被叠氮化的荧光染料标记,通过流式细胞分选仪收集能摄取和不能摄取天然产物的细菌。本发明与单一菌种培养研究代谢与利用的方法相比,成本低、周期短,为广泛、深入研究肠道菌群和天然产物的互作提供了新的思路。
附图说明
图1为天然产物结构式;其中图1A为姜黄素,图1B为姜黄素炔,图1C为肉豆蔻酸,图1D为肉豆蔻酸炔;
图2为天然产物与粪便菌群共培养后培养液pH变化图;其中图2A为姜黄素和姜黄素炔组,图2B为肉豆蔻酸和肉豆蔻酸炔组;
图3为天然产物与粪便菌群共培养后短链脂肪酸含量变化图;图3A为姜黄素与姜黄素炔组乙酸含量变化;图3B为姜黄素与姜黄素炔组丙酸含量变化;图3C为肉豆蔻酸与肉豆蔻酸炔组乙酸含量变化;图3D为肉豆蔻酸与肉豆蔻酸炔组丙酸含量变化;
图4为流式细胞分选圈门图;图4A为无菌PBS,图4B为对照组,图4C为姜黄素组,图4D为肉豆蔻酸组,图4E为姜黄素炔组,图4F为肉豆蔻酸炔组。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明,但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1可特异性摄取或代谢姜黄素的肠道菌群的表征与分离
(1)姜黄素和姜黄素炔对粪便菌群培养液pH值的影响
姜黄素和姜黄素炔结构式见图1。
取三位健康志愿者的新鲜粪便,志愿者三个月内没有服用过抗生素类药品,粪便收集后保存在无菌离心管中并立即处理。三个粪便样品按质量比1:1:1混合并用粪便稀释液(每升含0.24g KH
向10mL离心管中加入8.99mL培养基(每升含5.0g蛋白胨,3.0g大豆胨,5.0g示胨,10.0g血清消化粉,2.2g牛肉浸粉,2.5g酵母浸粉,1.2g肝浸粉,5.0g可溶性淀粉,0.5g葡萄糖,3.0g氯化钠,2.5g磷酸二氢钾,0.2g L-色氨酸,1.0g L-精氨酸,0.3g L-半胱氨酸盐酸盐,0.3g硫乙醇酸钠,0.005g氯化血红素,0.001g维生素K
(2)Cur和CurA对粪便菌群产生短链脂肪酸含量的影响
6、12、24、48h收集的Control组、Cur组、CurA组培养液,分别取4mL加入0.6mL 50%H
色谱条件为,色谱柱:SH-Rtx-5(30cm×0.25mm×0.25μm),载气:N
由图3A和图3B可知,Cur和CurA对粪便菌群短链脂肪酸的产生无显著性差异,表明CurA不会因炔基修饰而对粪便菌群短链脂肪酸的产生造成影响。
(3)铜催化的叠氮化物-炔烃环加成染色
Control组、Cur组、CurA组24h培养液,分别以18000g离心10min收集细菌沉淀,加入1mL 1%BSA/PBS,洗涤三次。细菌沉淀加入1mL 4%多聚甲醛固定液,室温下固定10min,然后用1mL 1%BSA/PBS轻轻洗涤一次。加入1mL免疫染色通透液(Triton X-100,Beyotime),室温下孵育30min,使用1mL 1%BSA/PBS洗涤后重悬于300μL 1%BSA/PBS中备用(即为菌液)。
根据点击化学反应缓冲试剂盒(Click Chemistry Reaction Buffer Kit,ClickChemistry Tools)的说明,50μL菌液加入109μL Reaction Buffer A(试剂盒中包含:Reaction Buffer、Additive 1、Reducing Agent、Copper(II)Sulfate)和1μL AF647-叠氮化物(Invitrogen),AF647-叠氮化物终浓度为5μM,短暂涡旋混合均匀;加入20μL Additive1,短暂涡旋混合均匀;加入20μL硫酸铜(Copper(II)Sulfate),短暂涡旋混合均匀;加入10μL还原剂(Reducing Agent),短暂涡旋混合均匀,开始点击化学反应,室温避光孵育45min。用1mL 1%BSA/PBS洗涤五次,细菌沉淀重悬于1mL无菌PBS中备用(即为细菌悬液样品)。
(4)基于AF647的细菌分选
流式细胞分选仪(FACSAriaⅢ,BD Biosciences)鞘液使用无菌1×PBS,细菌悬液样品使用400目尼龙细胞过滤网过滤后上机检测。使用633nm红色激光激发AF647-叠氮化物荧光染料,并用660nm/20nm滤光片捕获荧光信号。
首先检测溶剂PBS中的信号,以确保溶剂背景中没有碎片干扰结果,如图4A所示。
进样收集10000个颗粒,使用前向散射-面积(FSC-A)和侧向散射-面积SSC-A排除碎片,使用FSC-A和前向散射-高度(FSC-H)排除黏连的细菌细胞,然后根据阴性对照组Control组和Cur组确定了AF647信号强度在0-10
并将此门应用于CurA组,圈出AF647信号强度大于10
CurA-AF647
实施例2可特异性摄取或代谢肉豆蔻酸的肠道菌群的表征与分离
(1)肉豆蔻酸和肉豆蔻酸炔对粪便菌群培养液pH值的影响
肉豆蔻酸和肉豆蔻酸炔结构式见图1。
取三位健康志愿者的新鲜粪便,志愿者三个月内没有服用过抗生素类药品,粪便收集后保存在无菌离心管中并立即处理。三个粪便样品按质量比1:1:1混合并用粪便稀释液(每升含0.24g KH
向10mL离心管中加入8.99mL培养基(每升含5.0g蛋白胨,3.0g大豆胨,5.0g示胨,10.0g血清消化粉,2.2g牛肉浸粉,2.5g酵母浸粉,1.2g肝浸粉,5.0g可溶性淀粉,0.5g葡萄糖,3.0g氯化钠,2.5g磷酸二氢钾,0.2g L-色氨酸,1.0g L-精氨酸,0.3g L-半胱氨酸盐酸盐,0.3g硫乙醇酸钠,0.005g氯化血红素,0.001g维生素K
(2)MA和MAA对粪便菌群产生短链脂肪酸含量的影响
6、12、24、48h收集的Control组、MA组、MAA组培养液,分别取4mL加入0.6mL 50%H
色谱条件为,色谱柱:SH-Rtx-5(30cm×0.25mm×0.25μm),载气:N
由图3C和图3D可知,MA和MAA对粪便菌群短链脂肪酸的产生无显著性差异,表明MAA不会因炔基修饰而对粪便菌群短链脂肪酸的产生造成影响。
(3)铜催化的叠氮化物-炔烃环加成染色
Control组、MA组、MAA组24h培养液,分别以18000g离心10min收集细菌沉淀,加入1mL 1%BSA/PBS,洗涤三次。细菌沉淀加入1mL 4%多聚甲醛固定液,室温下固定10min,然后用1mL 1%BSA/PBS轻轻洗涤一次。加入1mL免疫染色通透液(Triton X-100,Beyotime),室温下孵育30min,使用1mL 1%BSA/PBS洗涤后重悬于300μL 1%BSA/PBS中备用(即为菌液)。
根据点击化学反应缓冲试剂盒(Click Chemistry Reaction Buffer Kit,ClickChemistry Tools)的说明,50μL菌液加入109μL Reaction Buffer A和1μL AF647-叠氮化物(Invitrogen),AF647-叠氮化物终浓度为5μM,短暂涡旋混合均匀;加入20μL Additive1,短暂涡旋混合均匀;加入20μL硫酸铜(Copper(II)Sulfate),短暂涡旋混合均匀;加入10μL还原剂(Reducing Agent),短暂涡旋混合均匀,开始点击化学反应,室温避光孵育45min。用1mL 1%BSA/PBS洗涤五次,细菌沉淀重悬于1mL无菌PBS中备用(即为细菌悬液样品)。
(4)基于AF647的细菌分选
流式细胞分选仪(FACSAriaⅢ,BD Biosciences)鞘液使用无菌1×PBS,细菌悬液样品使用400目尼龙细胞过滤网过滤后上机检测。使用633nm红色激光激发AF647-叠氮化物荧光染料,并用660nm/20nm滤光片捕获荧光信号。
进样收集10000个颗粒,使用FCS-A和SSC-A排除碎片,使用FSC-A和FSC-H排除黏连的细菌细胞,然后根据阴性对照组Control组和MA组确定了AF647信号强度在0-10
并将此门应用于MAA组,圈出AF647信号强度大于10
MAA-AF647
如上所述,尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明,但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下,可对其在形式上和细节上作出各种变化。
机译: 用于治疗或预防腹泻和维持天然肠道菌群的组合物包括对肠道菌群有积极影响的微生物和益生元的组合
机译: 菊粉用于减少菌群实际上具有恒定菌群的结肠中菌群产生的有害健康的代谢反应产物的水平的用途
机译: 减轻胆汁酸代谢,氨基酸代谢和/或肠道菌群代谢紊乱的方法