分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用，涉及鱼类免疫学领域。所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白基因的逆转录病毒对细胞进行感染；将感染后的细胞作为抗原进行动物免疫；动物免疫后进行细胞融合，对融合细胞筛选和克隆，以获得所述杂交瘤细胞株。采用本发明制备方法制备得到的杂交瘤细胞株2C4G3、2B7F11、1C3G6、1D2E6或3C4H8，成功制备抗尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4‑1、CD4‑2或CD8α的单克隆抗体，且充分保证了该单克隆抗体的特异性，为后续研究T淋巴细胞在硬骨鱼适应性免疫应答中的作用和机制提供了重要工具。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类免疫学领域，具体涉及一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

作为适应性免疫应答中关键的效应细胞，T细胞是一类具有膜抗原结合受体(TCR)，并识别抗原递程细胞(APC)表面MHCI和MHCII类分子递呈的抗原肽、介导细胞免疫防御的一类淋巴细胞，在免疫反应、平衡状态和记忆的建立和维持中发挥着十分重要的作用。最初T细胞的发育是在胸腺中开始的。淋巴样祖细胞在胸腺微环境的刺激下首先开始重排TCR基因，分别产生由α和β链组装的αβT细胞以及由γ和δ链组装的γδT细胞。γδT细胞形成后离开胸腺进入外周环境中，而αβT细胞即前T细胞在IL-7等细胞因子的诱导下开始表达CD4和CD8，进入双阳性(DP)细胞阶段。DP细胞经历阳性选择(自身MHC限制性)后进一步分化为CD4或CD8单阳性(SP)细胞。CD4单阳性T细胞和CD8单阳性T细胞经历阴性选择(自身免疫耐受)后成为成熟T细胞，通过血液循环进入外周免疫器官中。在外周环境中遭遇抗原后，TCRαβ异二聚体和CD3受体形成TCR复合物并识别抗原递呈细胞表面的抗原肽。而作为TCR的共受体的CD4和CD8分子分别结合到MHCII或MHCI分子上并识别MHC-抗原肽，增强TCR复合物和抗原递呈细胞的结合。MHC-II限制的T细胞被称为CD4T细胞(辅助性T细胞)，并根据免疫微环境的不同可继续分化为Th1、Th2、Th17和Treg细胞等，通过直接和间接机制介导其他免疫细胞活性,分别抵抗不同类型的病原入侵，或发挥免疫抑制作用限制炎症反应的持续扩大。而MHC-I限制的T细胞被称为CD8T细胞即细胞毒性T细胞，具有直接杀伤细胞内病原体和肿瘤细胞等的细胞毒性能力。

与哺乳动物相比，鱼类适应性免疫应答的研宄还很薄弱。硬骨鱼是拥有胸腺的最原始的脊椎动物之一，并且具有和哺乳动物相似的T细胞亚群。近年来在T细胞基因的克隆方面展开迅速，包括TCRα、TCRβ、CD4、CD8等分子已陆续在多种硬骨鱼中被报道。与哺乳动物中不同的是，除了与哺乳动物一样包含4个Ig-like结构域的CD4分子即CD4-1之外，一些硬骨鱼中还发现了包含2或3个Ig-like结构域的CD4分子，并命名为CD4-2，这种差异也表明了原始T细胞的不同之处。尽管针对硬骨鱼T细胞的单克隆抗体已经陆续被研制成功，但是绝大多数是利用原核重组系统建立的制备技术，无法充分保证膜蛋白免疫原的完整性和免疫原性。此外，由于鱼类物种数目极多，进化地位差异很大，对单一物种T细胞亚群的全面认知和深入探索是十分有必要的。

近年来，罗非鱼(包括尼罗罗非鱼Oreochromisniloticus)作为重要的淡水养殖经济鱼类，在中国乃至全球水产养殖业中的重要性日益显著。然而随着养殖规模快速扩展,水体环境发生变化,罗非鱼的病害逐渐增多,特别是细菌性疾病日益严重。在目前苗种质量、养殖环境状况和饲料质量水平难以在短期内得到有效改善的情况下,养殖病害的潜在危害风险较大，严重影响我国罗非鱼养殖产业的发展。对于罗非鱼免疫机制的研究迫在眉睫。因此，制备尼罗罗非鱼T细胞单克隆抗体，探究T细胞各亚群的分化和功能机制，对于鱼病防治，疫苗开发以及填补硬骨鱼适应性免疫进化研究具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明提供的一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。通过该杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2、CD8α单克隆抗体，使其能够特异性识别到罗非鱼的T淋巴细胞各亚群，为硬骨鱼的适应性免疫机制研究提供重要的免疫学工具。

为实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

一方面，本申请提供了一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白基因的逆转录病毒对细胞进行感染；

将感染后的细胞作为抗原进行动物免疫；

动物免疫后进行细胞融合，对融合细胞筛选和克隆，以获得所述杂交瘤细胞株。

在一些实施例中，所述逆转录病毒复制时采用BOSC细胞传代培养；所述逆转录病毒感染的细胞为NIH/3T3细胞。

具体的，所述罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白选自TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α中的任意一种。

进一步的，当膜蛋白选自TCRα时，获得杂交瘤细胞株2C4G3；当膜蛋白选自TCRβ时，获得杂交瘤细胞株2B7F11；当膜蛋白选自CD4-1时，获得杂交瘤细胞株1C3G6；当膜蛋白选自CD4-2时，获得杂交瘤细胞株1D2E6；当膜蛋白选自CD8α时，获得杂交瘤细胞株3C4H8。另一方面，本申请实施例还提供了一种如上所述的杂交瘤细胞株的制备方法制备而成的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株2C4G3于2022年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022294；所述杂交瘤细胞株2B7F11于2022年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022295；所述杂交瘤细胞株1C3G6于2022年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022296；所述杂交瘤细胞株1D2E6于2022年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022297；所述杂交瘤细胞株3C4H8于2022年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022298。

还提供了一种如上述的杂交瘤细胞株在制备抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白的单克隆抗体中的应用。

还提供了一种抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白的单克隆抗体，主要由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。

还提供了一种如上所述的单克隆抗体在硬骨鱼适应性免疫应答研究中的应用。

还提供了一种如上所述的单克隆抗体在制备鱼病防治试剂/药物中的应用。

进一步的，所述鱼病防治试剂/药物包括鱼病防治疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

采用本发明制备方法制备得到的杂交瘤细胞株2C4G3、2B7F11、1C3G6、1D2E6或3C4H8，通过采用逆转录病毒的方法将完整的尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2或CD8α基因片段插入小鼠同源细胞系NIH/3T3，使得该细胞系在细胞表面上能够表达尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2或CD8α蛋白，该蛋白最大程度的还原了天然状态下的活性尼罗罗非鱼膜蛋白，并建立起由流式细胞术、间接免疫荧光法和半定量相结合的筛选系统，由此成功制备抗尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2或CD8α的单克隆抗体，且充分保证了该单克隆抗体的特异性，为后续研究T淋巴细胞在硬骨鱼适应性免疫应答中的作用和机制提供了重要工具。

附图说明

图1为荧光显微镜、流式分析下NIH/3T3细胞的感染效果图；

图2分别为检测2C4G3、2B7F11、1C3G6、1D2E6、3C4H8孔内融合细胞培养上清与尼罗罗非鱼脾脏白细胞特异性结合的流式分析结果；

图3分别为荧光显微镜下单克隆抗体与尼罗罗非鱼淋巴细胞上的TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α蛋白特异性结合结果图；

图4分别为TCRα

图5分别为感染前后TCRα

图6分别为脾脏白细胞、头肾白细胞、外周血白细胞、肠道白细胞中TCRα

图7分别为脾脏白细胞中TCRα

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

本实施例提供了首先提供了能分别分泌抗尼罗罗非鱼膜蛋白TCRα

其中，上述各杂交瘤细胞株的制备方法包括如下步骤：

尼罗罗非鱼膜蛋白TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α基因克隆：

(1)提取尼罗罗非鱼白细胞总RNA，选取质量合格的RNA逆转录合成cDNA模板备用；

(2)设计用于PCR扩增TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α的引物对组，其序列分别如SEQ ID NO.1-10所示，该引物对组包括：正向引物以及反向引物，其中，TCRα：正向引物GAAGATCTGCCACCATGGAACATTGGCTGTGGATTAT，反向引物：CGGAATTCCTACTGACTAATCCACAGCCGCA；TCRβ正向引物：GAAGATCTGCCACCATGTTCATGAATGTAGTC，反向引物：

CGGAATTCGTACTTCTGCTTTCCAC；CD4-1正向引物：GAAGATCTGCCACCATGAAGAACTTTCAGTCCCTTCT，反向引物：CGGAATTCTCATGTTCTGTAAAATCCTTTTGGT；CD4-2正向引物：GAAGATCTGCCACCATGAAGGTGATTGTGTTGTTTGTGT，反向引物：CGGAATTCTTAGGCGGGGTGCAGAGGGA；CD8α正向引物：GAGGCGCCGCCACCATGGACCAAAAATGGCTTCTGAT，反向引物：ATATAGATCTTTAAACATATCTGTCGGCCATCTGT，配制扩增反应体系，按程序扩增得到扩增产物，并对扩增产物进行胶回收，所得回收产物即为分离的尼罗罗非鱼各基因；本步骤中，扩增反应体系为50μL(2μL正向引物，2μL反向引物，25μL2×PrimerSTARDNAPolymerase，2μLcDNA模板，19μLdH2O)；扩增程序：95℃、10s，50℃、15s，72℃、8s，35个循环；再加入1μLrTaq后72℃下保温20min；扩增得到的尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α的各基因片段序列分别如SEQ ID NO.11-15所示。

尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α基因表达载体构建：

(1)取4.5μL回收产物与载体连接体系(0.5μLPMD19Tvector，5μLsolutionⅠ)混合，16℃下连接过夜，以获得第一连接体系；

(2)将10μL的第一连接体系加入到50μLDH5α感受态细胞中，冰上转化30min后，42℃水浴45s并置于冰上2min；

(3)加入200-400μL新鲜的LB液体培养基，37℃恒温震荡培养1h；取100μL悬液涂布培养在含有氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃恒温培养过夜；

(4)挑选阳性单克隆菌测序后，分别提取包含TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2或CD8α基因的PMD19T质粒(PMD19T-TCRα、PMD19T-TCRβ、PMD19T-CD4-1、PMD19T-CD4-2和PMD19T-CD8α)，同时将包含各基因片段的PMD19T质粒和pMIGR1空质粒各取1μg分别加入双酶切体系(包含1μLBglⅡ，1μLEcoRⅠ，4μL3.1buffer，dH2O补齐至40μL)，37℃酶切4h，对应获得两种酶切产物；两种酶切产物各取4.5μL与DNA连接体系(1μLT4DNALigase，1μLT4DNALigaseBuffer)混合，15-18℃下连接10-12h，以获得第二连接体系；

(5)将第二连接体系加入50-100μLDH5α感受态细胞中，冰上转化30min，在42℃水浴热激40-45s，冰上放置2min，加入300-500μL新鲜的LB培养基，振荡培养1h；

(6)取50-200μL菌液涂布培养到含有氨苄抗性的LB固体培养基中，培养过夜，次日挑取阳性单克隆菌株；

(7)对阳性单克隆菌株进行扩大培养，再进行质粒提取，以分别获得包含TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α基因的逆转录病毒表达载体(即pMIGR1-TCRα、pMIGR1-TCRβ、pMIGR1-CD4-1、pMIGR1-CD4-2和pMIGR1-CD8α质粒)。

逆转录病毒制备：

(1)从液氮中取出冻存的BOSC细胞，解冻后进行细胞复苏和细胞传代，以获得BOSC传代细胞；BOSC细胞传代次数为1-3次；

(2)当细胞汇合度达到90％时传代，将上清吸出，用5mLPBS清洗一遍，加入1mL胰酶，轻晃使胰酶浸润所有细胞，37℃培养箱消化30s，取出后加入3mLDMEM培养基(1％双抗，10％FBS)轻轻悬起细胞，1000rpm离心3min收集细胞，将细胞分为2～3份重新种板；

(3)待培养板(dish)上培养的BOSC细胞汇合度达到75-85％左右时，弃掉培养上清，缓慢加入3mL含有25μM氯喹的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)，放入37℃培养箱中；

(4)准备转染体系：在2mLEP管中分别加入10μgpMIGR1-TCRα或pMIGR1-TCRβ或pMIGR1-CD4-1或pMIGR1-CD4-2或pMIGR1-CD8α质粒，并加入5μgpCL-ECO质粒，50μL2.5MCaCl2，用灭菌水将体积补至500μL，一边用玻璃移液管缓慢向EP管的混合液中吹打气泡，一边缓慢滴加500μL2×HeBS缓冲液；

(5)将1mL的转染体系混匀后逐滴均匀加入细胞培养皿中，轻轻晃匀。

(6)转染8h后弃去上清，缓慢加入3mLDMEM培养基(1％双抗，10％FBS)。次日再次换成3mL新鲜的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)。

(7)最后一次更换DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)的16h后收集上清，将该上清于1200rpm下离心5-10min，收集含有逆转录病毒的上清(即逆转录病毒悬液)，并分装保存于-80℃。

NIH/3T3细胞感染：

(1)从液氮中取出冻存的NIH/3T3细胞，解冻后进行细胞复苏和细胞传代，以获得NIH/3T3传代细胞；NIH/3T3细胞传代次数为1-3次；

(2)取1mL胰酶，于37℃下消化NIH/3T3传代细胞，再用5mLDMEM培养基重悬细胞，1000rpm下离心3min，弃上清，得消化后的NIH/3T3细胞沉淀，再将所得到的消化后的NIH/3T3细胞沉淀用DMEM培养基重悬并计数，并在每个100mm培养板(dish)上接种5.5×105-6×105个消化后的NIH/3T3细胞，以完成细胞种板；

(3)待培养板(dish)上培养的NIH/3T3细胞汇合度达到45-55％左右时，弃掉培养上清，并缓慢加入5-8mL含有5μM聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)；

(4)每个培养板中加入550-650μL各基因逆转录病毒悬液，轻轻混匀，放入37℃培养箱中培养，以完成NIH/3T3细胞感染；

(5)逆转录病毒感染5h后加入1-2mL不含聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)，混匀，以终止聚凝胺的作用，次日更换成不含聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)1-2次；

(6)最后一次换液的48h后离心，收集细胞沉淀，用1mL胰酶37℃消化所述细胞沉淀30s；再用5mLDMEM培养基重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清，将所得细胞沉淀用10mLPBS重悬，1000rpm离心3min，重复洗一次，最后用300μLPBS重悬细胞，以获得转染后的NIH/3T3细胞。

如图1所示，分别通过流式细胞仪、荧光显微镜检测细胞感染后的感染效果，流式分析结果显示TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α逆转录病毒感染效率分别能达到87.5％、58.2％、85.4％、87.8％、86％，其中逆转录病毒感染的NIH3T3细胞在荧光显微镜下呈现绿色的阳性反应；

动物免疫：

将转染后的各个相应基因的GFP+NIH/3T3细胞作为抗原，采用腹腔注射的方式分别对6周龄的BALB/c小鼠进行免疫，每只小鼠每次的免疫剂量为10

细胞融合

(1)最后一次免疫的三天后进行细胞融合，融合前一周复苏SP2细胞，并在融合前一天将生长旺盛的SP2细胞转移至75cm培养瓶培养。

(2)脱颈椎处死供胸腺小鼠，无菌条件下取出位于心脏上方的胸腺；RPMI-1640(-)清洗后研磨并过200目网筛，用RPMI-1640(-)吹下形成单细胞悬液，弃掉大块组织；1000rpm离心5min，弃上清，加入10mL预热的HAT-GIT；

(3)脱颈椎处死免疫供脾脏小鼠，无菌条件下取出脾脏，10mLRPMI-1640(-)清洗，研磨过200目网筛，1000rpm离心5min，弃上清，脾细胞沉淀用RPMI-1640(-)重悬；

(4)用力并快速吹下培养瓶内所有的SP2细胞，按照脾细胞悬液与瘤细胞悬液比例为1：10进行混合，1200rpm离心8min，弃去上清，摊开左手手掌，右手握紧离心管，用离心管管底轻击左手掌拇指下方肌肉，先垂直击打，然后再倾斜一定角度缓慢旋转击打，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状，最后垂直击打集中细胞；

(5)将离心管管底置于37℃水浴预温的盛水烧杯中保温，吸取预热到37℃的PEG液lmL，在90s内均匀分散并缓缓滴加完1mLPEG,然后在水浴中静置90s；

(6)继续滴加已经预热到37℃的RPMI-1640(-)液10mL，使PEG稀释而失去作用。加的方法是：第1min、1mL，第2min、1mL，第3min、1.5mL，第4min、1.5mL，第5min、5mL，共计10mL；补加RPMI1640(-)液至40mL，800rpm离心6min，弃去上清液；

(7)3mlGIT细胞培养液重悬上一步中所得细胞沉淀，得细胞重悬液，并冻存部分；且在剩余细胞重悬液中加入胸腺细胞悬液，混合均匀后获得融合细胞体系，再按照100μL/孔将融合细胞体系滴加到细胞培养孔板中；

(8)将所述孔板放入37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养，培养过程中，在倒置显微镜下观察细胞生长状况，且待融合细胞长满1/3孔板时，离心收集融合细胞上清备用；在倒置显微镜下观察发现，融合细胞生长状态良好、分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好，且具备无限分裂增生能力。

融合细胞筛选和克隆：

采用流式细胞术对融合细胞进行检测筛选，具体包括如下步骤：

(1)2mLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬白细胞，每孔加入100μL细胞悬液，2500rpm离心3min，弃去上清；

(2)加入100μL收集的融合细胞上清作为一抗，冰上孵育30min，对照孔加入SP2细胞培养上清；

(3)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer重悬细胞，再次离心，并重复清洗一次；

(4)每孔加入50μLAlexaFluor647(1:1000)荧光二抗，冰上避光孵育30min；

(5)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer重悬细胞，再次离心，并重复清洗一次；

(6)200μLFACSBuffer/孔将细胞重悬，进行流式检测；

如图2所示，流式分析结果表明：检测到2C4G3、2B7F11、1C3G6、1D2E6、3C4H8各孔细胞分群明显，表明这些融合细胞能够分泌抗体，并且这些抗体分别能够识别某一类群细胞表面的蛋白；

对阳性孔内融合细胞进行克隆，其具体包括如下步骤：

(1)脱颈椎处死小鼠，无菌条件下取出胸腺，在200目网筛上研磨，并用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；

(2)1000rpm，5min离心，去上清，用10mL37℃预热的GIT重悬；

(3)将阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；

(4)细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100μl，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；再放入37℃的CO

(5)待克隆后的融合细胞长至1/3孔满，收集上清，通过流式细胞术检测各孔细胞培养上清，检测出的阳性孔内的细胞即为杂交瘤细胞株3C4H8，且如图2所示，检测得知CD8α阳性细胞群占脾脏淋巴细胞群总数的11.6％左右，说明该杂交瘤细胞株3C4H8分泌的单克隆抗体能够识别并结合到尼罗罗非鱼的CD8α阳性细胞群；再对所述杂交瘤细胞株3C4H8冻存备用。

实施例2：

本实施例提供了一种实施例1中所得的各杂交瘤细胞株2C4G3、2B7F11、1C3G6、1D2E6、3C4H8分泌的分别抗罗非鱼膜蛋白TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α单克隆抗体，即杂交瘤细胞株2C4G3能分泌TCRα单克隆抗体；杂交瘤细胞株2B7F11能分泌TCRβ单克隆抗体；杂交瘤细胞株1C3G6能分泌CD4-1单克隆抗体；杂交瘤细胞株1D2E6能分泌CD4-2单克隆抗体；杂交瘤细胞株3C4H8能分泌CD8α单克隆抗体。

任一所述单克隆抗体的制备过程相同，包括如下步骤：

腹水制备：取10周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500μL无菌石蜡油；10天后，取生长状态良好的杂交瘤细胞株3C4H8，PBS洗2遍，300μL无菌PBS重悬细胞，每只小鼠腹腔注射2×10

抗体纯化：取200μLrProteinGAgarose于15mL离心管中，PBS洗三遍，再加入500μL分装保存的腹水并用PBS稀释至8mL，4℃孵育过夜；10倍体积的PBS清洗珠子6遍后，1mL0.1Mglycine-HCl(pH2.8)洗脱，以分别获得所述抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α单克隆抗体，并在加入1/10体积的1MTris-HCl(pH8.5)中和pH值后分装保存于-80℃。

抗体标记：

(1)FITC抗体标记：用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH9.8)将纯化好的抗体调整成1mg/mL并放入透析袋中，于碳酸氢钠缓冲液(pH9.8)中充分透析12h；将透析袋放入100ml含0.1mg/mL FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液(新配制)的烧杯中，于4℃避光透析12h；将透析袋放于PBS中4℃避光透析12h，更换新的PBS重复透析四次；标记好的抗体加入0.5g/L的叠氮钠并避光保存于4℃。

(2)生物素标记抗体：用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)将纯化好的抗体调整成1mg/mL并放入透析袋中，于0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)中充分透析12h；向1ml蛋白质溶液(即含蛋白质1mg)加入120μL120mg/mLNHSB溶液,在室温下持续搅拌，保温2-4小时；加入9.6μL1mol/LNHCl(每25μgNHSB加1μl)，在室温下搅拌10分钟；将透析袋放于PBS中4℃避光透析12h，更换新的PBS重复透析四次；标记好的抗体加入0.5g/L的叠氮钠并避光保存于4℃。

实施例3：

本实施例提供了一种实施例2中所述单克隆抗体的间接免疫荧光法鉴定，其包括如下步骤：

(3)如上述步骤，取健康尼罗罗非鱼的脾脏，分离得到白细胞，用5mLPBS重悬细胞；

(4)取适宜密度的细胞用细胞涂片机制成细胞滴片，并经过甲醇固定5min并晾干；

(5)细胞周围画疏水圈，每孔加入100μL含1％BSA的PBS，37℃封闭1h；

(6)PBST洗两遍，PBS洗一遍，每次5min；

(7)分别加入100μL相应的纯化抗体(1：10000稀释)，对照空用mouseIgG蛋白，37℃孵育1h；

(8)PBST洗两遍，PBS洗一遍，每次5min；

(9)每孔加入100μLAlexaFluor488(1：800)荧光二抗，37℃孵育1h；

(10)PBST洗两遍，PBS洗一遍，每次5min；

(11)加一滴Hoechst33342染料色封片剂，荧光显微镜下镜检。

结果表明，如图3所示，细胞在荧光显微镜下呈现绿色的阳性反应，表明各个杂交瘤细胞均能分泌单克隆抗体，且各单克隆抗体均能与尼罗罗非鱼淋巴细胞上的相应蛋白特异性结合。

实施例4：

本实施例提供了一种实施例2中所述各单克隆抗体的半定量法鉴定，其包括如下步骤：

(1)如上述步骤，取健康尼罗罗非鱼的脾脏，分离得到白细胞，用5mLL15培养基重悬细胞；

(2)取100μL细胞悬液加入到96U型孔板，2500rpm离心3min；

(3)去上清，分别加入100μL相应的纯化抗体(1：10000稀释)，对照空用mouseIgG蛋白，冰上孵育30min；

(4)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，并重复清洗一次；

(5)分别分选阳性细胞群和阴性细胞群，2500rpm离心5min分别得到阳性细胞和阴性细胞，并分别提取总RNA并反转录成cDNA；

(6)取定量的模板进行PCR反应，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，调整阳性和阴性细胞的β-actin一致，在检测其他基因。

如图4电泳结果所示，阳性群(即TCRα

实施例5：

本实施例提供一种为实施例2中所述单克隆抗体CD28检测硬骨鱼中CD28

(1)取一尾健康的尼罗罗非鱼，分别取外周血、脾脏、头肾和肠的白细胞。对于外周血，先取2mL抗凝剂(15mM柠檬酸钠,450mMNaCl,0.1M葡萄糖,10mMEDTA,pH7.0)加入抽取的外周血中，2000rpm离心5min，弃上清，所得沉淀用3mLL15培养基重悬，得到白细胞；对于脾脏和头肾组织，按照实施例1中方法分离脾脏白细胞；对于肠道组织，首先充分研磨，过200目筛绢收集细胞组分，将未研磨的组织块用5mLPBS(0.37mg/mLEDTA，0.14mg、mLDTT)冰上处理30min，PBS清洗后于10mLD-PBS(0.2mg/mlCollagenase,5％FBS)室温连续震荡消化2h，收集细胞组分，将所有细胞组分汇集，于percoll密度梯度离心分离白细胞；

(2)分别取1mLFACSbuffer(PBS,2％FBS)重悬各个组织的白细胞，并取适宜密度的白细胞分别加入96V型孔板，2500rpm离心3min，弃上清；

(3)对应孔内分别加入100μL相应的纯化抗体(1：10000稀释)，对照空用mouseIgG蛋白，冰上孵育30min；2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，重复洗一次；加入50μLGoatAnti-MouseIgGH&L(AlexaFluor647)(1：2000)荧光二抗/孔，冰上避光孵育30min；2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，并重复洗一次；200μLFACSBuffer/孔将细胞重悬，进行流式检测。

如图5所示，脾脏白细胞、头肾白细胞、外周血白细胞、肠道白细胞中TCRα

实施例6：

本实施例提供一种为实施例2中所述单克隆抗体CD28检测检测尼罗罗非鱼在杀鱼爱德华氏菌感染后T细胞群变化实验，步骤如下：

(1)取健康的尼罗罗非鱼腹腔注射2×10

(2)在感染第8天后分别分离感染组和对照组脾脏的白细胞；分别取2mLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬感染组和对照组脾脏的白细胞，得到感染组和对照组的白细胞悬液；

(3)孔板的孔内分别加入100μL感染组和对照组的白细胞悬液，2500rpm离心3min；弃上清；

(3)每孔分别加入100μL相应的纯化抗体(1：10000稀释)，冰上孵育30min；

(7)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得细胞沉淀重复清洗一次；

(8)加入50μLanti-mouseIgGGoatAnti-MouseIgGH&L(AlexaFluor647)(1：2000)荧光二抗，冰上避光孵育30min；

(9)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；

(10)每孔200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)将各个细胞重悬，进行流式检测。

如图6所示，经流式分析，在杀鱼爱德华氏菌感染D4天后，TCRα

实施例7：

本实施例提供一种为实施例2中所述各单克隆抗体在检测尼罗罗非鱼在TCRα

(1)如上述步骤，取健康尼罗罗非鱼的脾脏，分离得到白细胞，用5mLL15培养基重悬细胞；

(2)孔板的孔内分别加入100μL白细胞悬液，共六孔，2500rpm离心3min，弃上清；

(3)每孔按照1:400分别加入50μL相应的抗体，即biotin-TCRβ、biotin-CD4-2、biotin-CD4-1、biotin-CD4-2、biotin-CD8α或biotin-CD4-1，冰上孵育30min；

(4)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得细胞沉淀重复清洗一次；

(5)每孔加入50μLAPC-Streptavidin(1：400)，并分别按照1：400加入50μLFITC标记的抗体，即FITC-TCRα、FITC-CD4-1、FITC-CD4-2、FITC-TCRβ或FITC-CD8α，冰上避光孵育30min；

(6)2500rpm离心3min，弃去上清，200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；

(7)每孔200μLFACSBuffer(PBS,2％FBS)将各个细胞重悬，进行流式检测。

如图7所示，经流式分析，TCRα

综上所述，本发明采用逆转录病毒的方法将完整的尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α基因片段插入小鼠同源细胞系NIH/3T3，使得该细胞系在细胞表面上分别能够表达尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α蛋白，这些蛋白最大程度的还原和保持了天然状态下的尼罗罗非鱼各个蛋白，并建立起由流式细胞术、间接免疫荧光法和半定量相结合的筛选系统，由此分别成功制备了抗尼罗罗非鱼T细胞表面TCRα、TCRβ、CD4-1、CD4-2和CD8α的单克隆抗体，且充分保证了该单克隆抗体的特异性，为后续研究T淋巴细胞在硬骨鱼适应性免疫应答中的作用和机制提供了重要工具。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。