分泌抗四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备和初步应用

摘要

本研究利用Mannich反应分别合成了四环素(Tc)与载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)、HSA(人血清白蛋白)的连接物，并运用紫外分光光度法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对抗原进行了鉴定，制备了两种人工抗原。用此人工抗原免疫小鼠，成功获得针对四环素的抗体。用紫外分光光度法进行了鉴定，并计算连接比率，结果分别是23∶1(Tc-BSA)、22∶1(Tc-HSA)。 本研究成功建立了检测抗四环素抗体的间接ELISA方法，其主要条件如下：pH9.6、0.05mol·L-1的碳酸盐缓冲溶液(CBS)为包被液，4μg·mL-1的连接抗原Tc-HSA(四环素-人血清白蛋白)为包被抗原，0.5％明胶为封闭液，1∶1000稀释的HRP酶标记的羊抗小鼠抗体作为二抗，TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)作为底物。试验证明本法特异性强，有较好的重复性。用该法对Tc免疫小鼠的血清抗体及其杂交瘤细胞单抗上清进行检测，获得满意的效果。 间接ELISA检测结果显示，Tc-BSA、Tc-HSA两种连接物在四免后抗体效价均达到1∶3200以上。通过细胞融合，获得一株能稳定分泌抗四环素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为C4。其细胞培养上清效价达1∶12800.用该细胞株注入小鼠腹腔制作单抗腹水，腹水效价为1∶409600。该单抗与其他抗生素的交叉反应率均低于0.01％。该杂交瘤细胞株连续传代20代，3个月内冻存、复苏3次，仍能稳定分泌抗Tc的单抗。 本文建立了检测Tc残留的间接竞争酶联免疫吸附方法。理想的包被抗原浓度为4ug／ml，单抗腹水稀释倍数为1∶5×104，酶标二抗稀释倍数为1∶1000，最适检测范围为1～1000ug／ml,最小检测量为lug／ml，得到回归方程为y=1.273-0.674x，r2=0.977，并且绘制了标准曲线，从而建立了快速定量测定Tc含量的间接竞争酶联免疫吸附试验(ciELISA)。

目录

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致谢

1文献综述

2引言

3材料与方法

4结果与分析

5结论与讨论

参考文献

附录