评价酒体中不同微量成分对细胞自噬水平影响程度的方法

摘要

本申请用于食品领域，公开了一种评价酒体微量成分对细胞自噬水平影响程度的方法，包括以下步骤：步骤一、配制稳定表达GFP‑RFP‑LC3蛋白的人肝细胞(LO2)单细胞悬液；步骤二、将1.5×10

说明书

发明领域：

本发明涉及食品领域，具体涉及一种评价酒体中不同微量成分对细胞自噬水平影响程度的方法。

背景技术：

相较于其它蒸馏酒，白酒除主要成分乙醇外，含有更为丰富的风味物质，包括2000多种微量化合物，风味成分占总质量的2％-3％，其中有多种功能组分，包括多酚类、萜烯类、吡嗪类、多肽等活性成分。乙醇不具备缓解心脏类疾病的功能，这种功能可能更多的受到其它微量成分的影响，如白藜芦醇具有抗氧化、预防心血管疾病、延长人体器官寿命的功能；4-乙基愈创木酚可通过调控促炎信号通路、减少炎性细胞因子；叶基丙酮、β-石竹烯能够提高机体内非酶系统抗氧化剂GSH的浓度，同时提高细胞的抗氧化能力；脂肽类化合物具有一定的抗癌、抗病毒的能力。

细胞自噬是一种基本的细胞代谢过程，可以促进细胞稳态平衡、分化、发育和生存过程。它通过溶酶体来降解包括核酸、蛋白质、脂质和细胞器等分子和亚细胞组分进而维持细胞存活。自噬是一种与维持细胞组织稳态相关的高度选择性细胞清除途径，与健康密切相关，尤其体现在衰老、疾病等方面。自噬受损被认为是衰老的标志之一，同时对长寿突变体动物的研究表明，衰老延缓与自噬增加有关，利用遗传或药理学手段上调自噬水平可延长动物寿命。过量酒精摄入可以引起酒精性肝损伤甚至肝细胞癌，进而破坏体内蛋白质，导致疾病与衰老等负面影响出现。脂质代谢中的自噬功能受损是脂质过氧化和细胞损伤的病理基础。酒精性脂肪肝是由于过度饮酒而导致肝脏氧化应激，肝细胞中积累过多的脂滴(脂肪变性)，线粒体损伤和细胞死亡的损害。自噬作为一种防御机制能够防止脂质过氧化，从而保护肝细胞。中国白酒或可通过影响细胞自噬活性而作用于肝细胞，减缓损伤。

目前对饮酒健康标准没有统一，实验流程没有确立，通过动物实验对饮酒健康展开除需要考虑个体差异外，还应考虑较高的实验成本，较为漫长的实验过程，不利于企业和消费者对酒体及成分进行快速便捷的健康评价。因此，本申请提供一种有效且快速的评价酒精饮料中酒体中不同微量成分对细胞自噬水平影响程度的方法，用于快速便捷推进酒体健康设计，迎合饮酒健康消费需求。

发明内容

针对以上需求，发明人制备了可稳定表达GFP-RFP-LC3蛋白的人正常肝细胞，使用含有酒体中不同微量成分的不同酒样分别完成对该细胞的处理。使用激光共聚焦显微镜观测细胞形貌，分析对表达GFP-RFP-LC3蛋白的人正常肝细胞细胞自噬水平的影响程度，能够快速且简单有效的初步评价酒体中不同微量成分水平对健康的影响程度。

一方面，本申请提供了一种评价酒体中不同微量成分对细胞自噬水平影响程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将对数生长期能够稳定表达GFP-RFP-LC3蛋白的人肝细胞L02用胰蛋白酶消化，配制成单细胞悬液；

步骤二、在6孔板中每个孔均匀放置3个盖玻片Micro Cover Glass，在6孔板孔中先加少量培养基(以使玻片与培养皿紧密接触)，使玻片紧密贴合，按1.5×10

步骤三、移去细胞培养液，用PBS清洗2遍，之后贴壁加入2mL细胞培养混合液，其中包含80μL样品，在37℃,5％ CO

步骤四、移去上清液，用PBS清洗2遍，然后在4％多聚甲醛中固定15min；

步骤五、用PBS清洗2遍，用镊子将玻片夹起，将玻片置于滤纸上晾干，并在载玻片上滴加含DAPI的防淬灭剂，将爬满细胞的一面置于防淬灭剂上；

步骤六、使用激光共聚焦显微镜观察荧光。

进一步地，所述GFP-RFP-LC3蛋白的序列氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述能够稳定表达GFP-RFP-LC3蛋白的人肝细胞L02的制备方法包括：克隆或合成GFP、RFP、LC3基因，组装GFP-RFP-LC3质粒；将制备的GFP-RFP-LC3质粒与pMD2G和PSApX2包装质粒共转染至293T细胞，制备携带有GFP-RFP-LC3基因的慢病毒；使用包装好的慢病毒感染肝组织细胞。

进一步地，所述酒体微量成分的浓度范围为0ug/mL～400ug/mL。

进一步地，所述酒体微量成分包括但不限于乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、异丁酸、正丁酸、丙酮酸异戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、氯离子、己酸、硝酸根、苹果酸、酒石酸、硫酸根、草酸、富马酸、磷酸、柠檬酸、正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、戊醇、异戊醇、β-苯乙醇、有丙三醇、2，3-丁二醇、赤藓醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、乙醛、乙缩醛、1,1-二乙氧基异丁烷、1,1-二乙氧基异戊烷、丙醛、异丁醛、异戊醛、糠醛、丁二酮、己酮、2,3-丁二酮、3-羟基丁酮、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、丙酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、苯甲醛、β-苯乙醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯酚、愈创苯酚、苯甲酸、香草酚、糠酸、四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、谷氨酸、丙氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、甘氨酸。

进一步地，所述样品可选食用酒精标准溶液和/或酒样。

进一步地，所述酒样均为50％alc/vol。

进一步地，所述食用酒精标准溶液的制备方法为用精馏和活性炭去除俄罗斯伏特加原酒中所有微量成分，只保留乙醇和水，再与超纯水配制成各种酒精度的溶液。

进一步地，使用激光共聚焦显微镜观察荧光，待显微成像后，红绿荧光混合形成的黄色斑点即为自噬体，绿色荧光减少即为自噬流水平上调。

另一方面，本申请提供了上述快速评价酒体中不同微量成分水平对细胞自噬水平影响程度的方法在于评价酒精饮料对健康影响的应用。

附图说明

图1为营养条件处理细胞2h后激光共聚焦显微镜下的LC3红绿荧光蛋白表达结果示意图；

图2为食用酒精与含50μg/mL丁香酚酒样处理细胞24h后激光共聚焦显微镜下的LC3红绿荧光蛋白表达结果示意图；

图3为食用酒精、酒样1#与酒样2#处理细胞24h后激光共聚焦显微镜下的LC3红绿荧光蛋白表达结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

稳定表达GFP-RFP-LC3蛋白的人肝细胞LO2购自XX，或者由XX制备；其表达的GFP-RFP-LC3蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例1

步骤一、LO2细胞，293T细胞购自国家实验细胞资源共享平台。

步骤二、基于pCDH质粒，完成质粒结构设计；提取肝细胞细胞RNA，制备cDNA文库；在NCBI中查找LC3序列号，Gene ID:66734，自cDNA文库制备LC3基因；基于Clontech的EGFP-C1质粒，制备EGFP基因；基于Addgene的pcDNA3-mRFP质粒，制备mRFP基因；经多次组装，完成pCDH-GFP-RFP-LC3-puro质粒的制备。

步骤三、转染前一天，于培养皿中接种适量的293T细胞。至转染时细胞密度为70-90％。

步骤四、取20μg质粒(病毒为3质粒系统，pMD2G：PSApX2：目的质粒＝4：6：10ug)加入到400μl的生理盐水中，吹打混匀。

步骤五、取8μl Vigofect转染试剂，加入400μl的生理盐水中轻轻混匀，室温放置5min。

步骤六、将步骤四稀释的质粒加入到步骤五稀释的转染试剂中，轻轻吹打混匀，室温放置15min。

步骤七、将转染工作液逐滴加入到细胞培养基中，轻轻混匀培养基，放入细胞培养箱中。4-6小时之后换成新鲜培养基。转染24-48小时后观察细胞状态，24小时后换成新鲜培养基，收取48-72小时的病毒上清即可。

步骤八、转染前一天接种LO2细胞于6孔板中，每孔60％。

步骤九、将步骤九中病毒上清每孔1ml处理细胞，培养36h。加入嘌呤霉素(2μL，1-1.5μg/mL)，培养24h。观察细胞状态，进行细胞传代和单细胞分选。

步骤十、通过激光共聚焦对细胞进行分选，确定荧光发光程度。

实施例2

步骤一、将对数生长期能够稳定表达GFP-RFP-LC3蛋白的人肝细胞LO2用胰蛋白酶消化，配制成单细胞悬液。

步骤二、在6孔板中每个孔均匀放置3个盖玻片Micro Cover Glass，在6孔板孔中先加少量培养基(以使玻片与培养皿紧密接触)，使玻片紧密贴合，按1.5×10

步骤三、移去细胞培养液，用PBS清洗2遍，之后贴壁加入2mL细胞培养混合液，按照每个组别的不同，每组的细胞培养混合液分别为：80μL 50％alc/vol的食用酒精标准溶液、80μL含有50ug/mL丁香酚与50％alc/vol的食用酒精标准溶液。在37℃,5％ CO

步骤四、移去上清液，用PBS清洗2遍，然后在4％多聚甲醛中固定15min。

步骤五、用PBS清洗2遍，用镊子将玻片夹起，将玻片置于滤纸上晾干，并在载玻片上滴加含DAPI的防淬灭剂，将爬满细胞的一面置于防淬灭剂上。

步骤六、使用荧光共聚焦显微镜观察荧光。

结果表明：通过激光共聚焦显微镜观察发现，终浓度50ug/mL的丁香酚处理细胞24小时后，细胞内形成一定量自噬体，LC3蛋白被招聘至自噬体表面。红色LC3蛋白略多于绿色LC3蛋白，提示自噬被诱导并完成了自噬体成熟并与溶酶体融合成为自噬溶酶体的整个过程。食用酒精对细胞自噬没有明显作用，但酒体成分丁香酚能够诱导细胞自噬发生、发展并成熟。

实施例3

步骤一、将对数生长期能够稳定表达GFP-RFP-LC3蛋白的人肝细胞LO2用胰蛋白酶消化，配制成单细胞悬液。

步骤二、在6孔板中每个孔均匀放置3个盖玻片Micro Cover Glass，在6孔板孔中先加少量培养基(以使玻片与培养皿紧密接触)，使玻片紧密贴合，按1.5×10

步骤三、移去细胞培养液，用PBS清洗2遍，之后贴壁加入2mL细胞培养混合液，按照每个组别的不同，每组的细胞培养混合液分别为：80μL 50％alc/vol的食用酒精标准溶、80μL酒样1#、80μL酒样2#。在37℃,5％ CO

步骤四、移去上清液，用PBS清洗2遍，然后在4％多聚甲醛中固定15min。

步骤五、用PBS清洗2遍，用镊子将玻片夹起，将玻片置于滤纸上晾干，并在载玻片上滴加含DAPI的防淬灭剂，将爬满细胞的一面置于防淬灭剂上。

步骤六、使用荧光共聚焦显微镜观察荧光。

结果表明：食用酒精对细胞自噬没有明显影响，不同酒样对细胞自噬的影响不同。酒样1#处理细胞24小时后，细胞内形成一定量自噬体，LC3蛋白被招聘至自噬体表面。红色LC3蛋白略多于绿色LC3蛋白，提示自噬被诱导并完成了自噬体成熟并与溶酶体融合成为自噬溶酶体的整个过程。而酒样2#中红绿荧光没有明显的变化，其相对来说对自噬没有明显影响。