一种抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法

摘要

本发明属于分析化学技术领域，具体为抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法。本发明利用固定有特定配体/受体的磁珠，对工程细胞发酵液进行一步纯化，特异性地提取与特定配体/受体亲和力较强的抗体组分，在纯化的同时摒弃亲和力差的抗体，测定不同工程细胞株对于高质量抗体的表达量；利用SEC对提取的强亲和力抗体组分进行蛋白聚集度的分析；抗体表达量高、亲和力强、聚集度低的样品直接体现为SEC色谱图上较高的单体峰，依据单体峰面积数值评估对应的工程细胞株，从大量工程细胞株中快速筛选出有开发潜力的细胞株。本发明与传统的工程细胞株筛选模式相比，显著缩短了分析时间，降低了分析成本。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法。

背景技术

近年来，抗体药物在肿瘤、自身免疫及代谢等疾病领域显示出独特的优势并取得了巨大进展，同时也是医药领域增长速度最快的发展方向。抗体药物作为大分子蛋白质，其生产过程均是由单克隆的工程细胞株表达产生，因此，获得能够大量表达高质量抗体分子的工程细胞株关乎着整个研发项目的成败。在实际研发流程中，需要首先得到稳定转染目标基因的工程细胞池，随后进行单克隆筛选获得几百甚至几千株单克隆的工程细胞株，对这些工程细胞株发酵液中抗体的关键质量属性（CQA）进行分析后排序，依据排序挑选出1~10个有开发潜力的工程细胞株开展后续的研发工作。对于大多数抗体药物而言，早期工程细胞株筛选过程主要关注三种CQA：①抗体表达量；②抗体与特定配体/受体的亲和力（抗体与相应靶点、Fc受体等的体内结合强弱，结合越强则体内药效越好）；③抗体分子的聚集程度（抗体多聚体具有免疫原性）。而这三种CQA需要使用至少三种不同的分析测试手段来完成，不仅分析成本高、耗时耗力，还因为层析纯化步骤的引入导致分析周期延长。由此可见，开发操作流程简单、成本低廉、分析周期短的工程细胞株筛选方案对于推动抗体药物研发进程至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分析周期缩短、操作流程简单的抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法。

本发明提供的抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法，利用固定有特定配体/受体的磁珠，对工程细胞发酵液进行一步纯化，特异性地提取与特定配体/受体亲和力较强的抗体组分，在纯化的同时直接摒弃了亲和力差的抗体，直接测定不同工程细胞株对于“高质量抗体”的表达量；利用分子排阻色谱（SEC）对提取到的强亲和力抗体组分进行蛋白聚集度的分析；抗体表达量高、亲和力强、聚集度低的样品将直接体现为SEC色谱图上较高的单体峰（技术原理见图3、图4），于是，依据单体峰面积数值评估对应的工程细胞株，从大量工程细胞株中快速筛选出有开发潜力的细胞株。

本发明提供的抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法，具体步骤：

（1）获得固定有特定配体/受体的磁珠：根据目标抗体的靶点、特性以及预期的质量关键属性选择固定有特定配体或受体的磁珠；所述配体或受体可与目标抗体发生结合，且二者结合亲和力影响抗体药物最终的质量或药效；放置于缓冲液中；

所述配体或受体的种类包括但不限于抗体靶点蛋白、Fc受体蛋白等；

所述固定有特定配体/受体的磁珠，可以直接购买商品化磁珠，或自行制备获得，比如采用偶联等方式在磁珠负载特定配体/受体；磁珠的粒径不限，通常为100-500微米；

（2）使用固定有特定配体/受体的磁珠对工程细胞发酵液样品进行处理：将过量的固定有特定配体/受体的磁珠加入容器中，通过施加外部磁场除去保存磁珠所使用的缓冲液；加入已离心去除细胞及细胞碎片的工程细胞发酵液，在4-37 ℃缓慢振摇的同时孵育5-240分钟；在外部磁场的作用下除去发酵液上清，以pH呈中性的缓冲液洗涤材料1-4次，并去除洗涤液；加入pH为1-5的酸性缓冲液作为目标抗体的洗脱液，在4-37 ℃缓慢振摇的同时孵育0.5-60分钟；在外部磁场作用下收集洗脱液，中和至pH呈中性；

（3）使用分子排阻色谱（SEC）对洗脱液中的抗体聚集度进行分析：将步骤（2）中得到的洗脱液经0.22-0.45 μm水相滤膜过滤，然后注入高相液相色谱系统，进行分析；色谱柱为SEC柱，流动相为pH呈中性且具有一定离子强度的缓冲液，等度洗脱至1倍柱体积及以上；以标准抗体的保留时间作为对照，对所得色谱图中抗体分子的单体峰进行积分，记录数值；

（4）工程细胞株筛选：依据各个工程细胞株经上述步骤（1）-（3）处理后所得到的单体峰面积数值从高到低的顺序，对各个工程细胞株进行排序；按照实际需求选择排序从前之后的1-20个工程细胞株作为有开发潜力的工程细胞株（抗体表达量、抗体聚集度、抗体与特定配体/受体的亲和度这三个属性的综合质量较好），展开后续的研发工作。

进一步地：

步骤（1）中，所述固定有特定配体/受体的磁珠，其表面涂覆有亲水性外表层，以避免使用过程中的非特异性吸附。

步骤（2）中，所述固定有特定配体/受体的磁珠对工程细胞发酵液样品进行处理，对于体积为

（1）依据固定有特定配体/受体的磁珠的产品信息（例如，商售的固定有特定配体/受体的磁珠，由供应商提供的产品信息数据，或自行制备产品的信息数据）计算磁珠表面配体/受体的蛋白载量

（2）取5~20个发酵液样品，混匀后等分成多份，每份体积为

步骤（2）中，使用的酸性洗脱液体积应小于等于原工程细胞发酵液的体积，以避免提取抗体的过程引入额外的稀释。

本发明设计的抗体药物研发流程中工程细胞株的筛选方法，其技术原理为：利用固定有特定配体/受体的磁珠作为磁固相吸附剂直接加入到工程细胞发酵液中，由于不同的抗体异质体对于同一受体/配体的亲和力相差极大（不同异质体之间相差2~10

本发明的技术特点和优势如下：

利用固定有特定配体/受体的磁珠一步同时实现抗体与特定配体/受体的亲和力分析与抗体的提取纯化，结合后续的多聚体分析结果直观获知不同工程细胞所表达抗体药物的综合质量。不仅实验结果更加直观，也摒弃了传统复杂繁琐的层析纯化操作，将分析流程缩短至0.5天以内，仅为传统方法的1/8~1/4，可大幅度缩短抗体药物研发周期。

附图说明

图1为工程细胞株筛选的传统方法。

图2为本发明方法的工程细胞株筛选流程。

图3为本发明中使用固定有特定配体/受体的磁珠直接对工程细胞发酵液样品进行处理的操作流程图示。

图4为本发明方法的技术原理图示。

图5为本发明实施例1中快速筛选高表达与FcγRIIIa亲和力强（ADCC作用强，且聚集度低的抗体的工程细胞株的分析方法的代表性色谱图（HCCF：细胞发酵液）。其中，a为使用固定有特定配体/受体的磁珠处理空白磷酸盐缓冲液所得的SEC色谱图，证明固定有特定配体/受体的磁珠在使用过程中磁珠表面固定的特定配体/受体不会产生可检出的浸出；b为使用固定有特定配体/受体的磁珠处理空白细胞发酵液所得的SEC色谱图；c为使用固定有特定配体/受体的磁珠处理含有目标抗体的细胞发酵液所得的SEC色谱图；d为纯的标准抗体溶液直接进样所得的SEC色谱图，综合比较b、c、d，可证明处理后的细胞发酵液相关杂峰不影响目标抗体的检测。

实施方式

下面通过实施例是对本发明作进一步说明，但不是限制本发明的范围。

实施例

一种快速筛选高表达与FcγRIIIa亲和力强（ADCC作用强）且聚集度低的抗体的工程细胞株的分析方法。

（1）验室内自行合成固定有FcγRIIIa蛋白的磁珠，该磁珠在中性条件下可以与IgG1型抗体的Fc结构域发生特异性结合，在酸性条件下解离。

（2）使用固定化FcγRIIIa磁珠对工程细胞发酵液中与FcγRIIIa亲和力强的抗体组分进行提取：将含有20 mg FcγRIIIa磁珠的混悬液加入EP管中，施加外部磁场分离磁珠并除去混悬液上清；加入1 mL 单克隆工程细胞株的发酵液（已离心去除沉淀），在37℃孵育20分钟并保持500 rpm的振摇强度使发酵液中FcγRIIIa-亲和力强的抗体与磁珠充分结合；孵育结束后在外部磁场的作用下除去发酵液上清，以含有0.02% 吐温-20的20 mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗涤材料后除去洗涤液；加入0.1 mL含有100 mM 氯化钠的10 mM甘氨酸-盐酸缓冲液（pH=3.5），在25 ℃孵育5分钟并保持500 rpm的振摇强度，将抗体分子从磁珠上洗脱下来；施加外部磁场收集洗脱液，以0.22 μm水相滤膜过滤。

（3）进行抗体聚集程度分析：将过滤后的洗脱液进行SEC分析，记录抗体单体峰面积；色谱条件如下：

色谱仪：安捷伦1260高效液相色谱仪；

色谱柱：Welch Xtimate® SEC-300 column (4.6*250 mm, 3 μm)；

流动相：20 mM 磷酸盐与200 mM 氯化钠的水溶液，pH 7.0；

柱温： 30℃；

分析时间：12.5 分钟；

流速：0.6 mL/min；

检测波长：280 nm；

进样量：80 μL。

（4）比较所有待测样品经过上述步骤处理后所得的SEC单体峰面积的数值，对其进行排序；其中SEC单体峰面积值最高的样品即对应着原所有待测细胞发酵液样品中高表达与FcγRIIIa亲和力强（ADCC作用强）且聚集度低的抗体的工程细胞株，参见图5所示；其中，a为使用固定有特定配体/受体的磁珠处理空白磷酸盐缓冲液所得的SEC色谱图，证明固定有特定配体/受体的磁珠在使用过程中磁珠表面固定的特定配体/受体不会产生可检出的浸出；b为使用固定有特定配体/受体的磁珠处理空白细胞发酵液所得的SEC色谱图；c为使用固定有特定配体/受体的磁珠处理含有目标抗体的细胞发酵液所得的SEC色谱图；d为纯的标准抗体溶液直接进样所得的SEC色谱图，综合比较b、c、d，可证明处理后的细胞发酵液相关杂峰不影响目标抗体的检测。