基于铜死亡相关lncRNA的子宫内膜癌预后模型及在免疫治疗中的应用

摘要

本发明公开了一种基于铜死亡相关lncRNA的子宫内膜癌预后模型及在免疫治疗中的应用，属于生物医药领域。本发明公开了一种可用于子宫内膜癌预后评估的产品，该产品包括检测生物标志物表达水平的试剂，该生物标志物为铜死亡相关lncRNA，包括AC103563.2，LINC01629，AL603832.1，AC080013.4，AC244517.7，AC025580.2，AC004596.1，AC243772.2，AC100861.1，AC083799.1和AC013731.1。本发明构建和验证了基于上述11个铜死亡相关的lncRNA组成的预后模型，为子宫内膜癌患者的预后以及免疫治疗提供强有力的理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种基于铜死亡相关lncRNA的子宫内膜癌预后模型及在免疫治疗中的应用。

背景技术

子宫内膜癌(UCEC)是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，约占妇科恶性肿瘤的20％～30％。近年来，子宫内膜癌的发病率逐年升高，严重威胁女性健康。由于子宫内膜癌早期症状不明显，且临床上缺乏有效的筛查手段和预测模型，多数患者确诊时即达到了晚期，而进展期病人在治疗后发生远处转移率较高，患者5年生存率低。因此，明确子宫内膜癌发病相关分子生物学机制，对探索新治疗靶点、改善患者预后有重要意义。

铜是人体内重要的微量元素，游离铜有很强的毒性，正常情况下游离铜在细胞内几乎无法检测到。稳定的铜浓度可以保证细胞代谢、能量获取和信号转导等关键生物过程的完成，如果铜含量提高，会危及生命。最近的一项研究表明，过量铜会导致线粒体蛋白聚集，导致独特的细胞死亡-铜死亡。Tsvetkov P等发现铜与线粒体活性的关系密切，尽管铜不会对线粒体呼吸产生大的影响，但铜毒性在呼吸活跃的细胞中增强很多，因此会产生更多的脂酰化酶，一方面会改变许多代谢产物的浓度，导致急性致死性休克。另一方面，产生更多的聚集体，破坏代谢途径的平稳运行，促进细胞死亡。由此将铜坏死作为一种新型癌症的疗法。

长非编码RNA(lncRNA)作为一种非编码RNA，越来越多的证据表明lncRNA参与人类各种癌症的发生和转移，其良好的分子稳定性可以做为预测、诊断和预后肿瘤的标志物。在子宫内膜癌中已有数据证明lncRNA的重要性。Xu等人认为六个lncRNA(KIAA0087、RP11-501O2、FAM212B-AS1、LOC102723552、RP11-140I24和RP11-600K151)是子宫内膜癌发生的主要调节剂，在调节子宫内膜癌细胞的恶性表型和重塑肿瘤微环境方面发挥着关键作用。然而，目前尚未报告UCEC预后和肿瘤免疫微环境(TME)中与铜死亡相关的lncRNAs的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于铜死亡相关lncRNA的子宫内膜癌预后模型及在免疫治疗中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该预后模型对UCEC患者的预后具有良好的区分性能，可以准确预测UCEC患者的预后。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种可用于子宫内膜癌预后评估的产品，所述产品包括检测生物标志物表达水平的试剂，所述生物标志物为铜死亡相关lncRNA，包括AC103563.2，LINC01629，AL603832.1，AC080013.4，AC244517.7，AC025580.2，AC004596.1，AC243772.2，AC100861.1，AC083799.1和AC013731.1。

进一步地，所述试剂包括检测所述铜死亡相关lncRNA的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-22所示。

本发明还提供一种子宫内膜癌预后模型，所述子宫内膜癌预后模型以上述生物标志物的表达水平为输入变量，按以下公式计算风险评分：

风险评分＝(0.39436×AC103563.2表达水平)+(0.10874×LINC01629表达水平)+(0.5615×AL603832.1表达水平)+(0.10148×AC080013.4表达水平)+(0.31082×AC002116.2表达水平)+(0.38386×AC002306.1表达水平)-(1.45378×AC004596.1表达水平)+(1.3714×AC243772.2表达水平)+(0.58447×AC100861.1表达水平)-(0.05297×AC083799.1表达水平)-(0.62657×AC013731.1表达水平)。

本发明还提供一种子宫内膜癌预后风险评估系统，其包括计算单元，所述计算单元利用上述的子宫内膜癌预后模型计算风险得分。

进一步地，还包括检测单元，所述检测单元用于检测上述生物标志物的表达水平。

进一步地，还包括信息获取单元，所述信息获取单元用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括所述生物标志物的表达水平。

进一步地，还包括评估单元，所述评估单元用于执行根据所述计算单元的计算结果判断受试者子宫内膜癌预后的风险高低，给出合理化治疗建议。

进一步地，还包括结果显示单元，所述结果显示单元用于显示所述评估单元得出的结论。

本发明还提供根据上述的产品或上述的子宫内膜癌预后模型或上述的子宫内膜癌预后风险评估系统在筛选子宫内膜癌免疫治疗药物中的应用。

进一步地，所述子宫内膜癌的高风险组患者适用于ABT888、顺铂、阿霉素、足叶乙甙、紫杉醇、PD.173074、索拉非尼和/或吉西他滨药物进行治疗；所述子宫内膜癌的低风险组患者适用于多西紫杉醇、拉帕替尼和/或二甲双胍进行治疗。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过单因素回归、LASSO回归和多因素回归分析，构建和验证了一个由11个铜死亡相关的lncRNA组成的预后模型(AC103563.2，LINC01629，AL603832.1，AC080013.4，AC244517.7，AC025580.2，AC004596.1，AC243772.2，AC100861.1，AC083799.1，AC013731.1)。风险评分1、2、3年AUC分别为0.826、0.816和0.786，证明本发明基于11个预后相关基因构建的预后模型对UCEC患者的预后具有良好的区分性能，可以准确预测UCEC患者的预后。

另外，根据临床病理特征将患者进行风险分层，发现低风险组的总体生存率高于高风险组患者。GSEA结果显示，低风险组中的Notch信号通路、Wnt信号通路、VEGF信号通路和mTOR信号通路显著丰富。再者，更多的免疫细胞与低风险组密切相关。几乎所有的免疫检查点在低风险组中都被激活，如CD44、CD200、TNFSF14、CD40LG、CTLA-4和TNFRSF14，这意味着低风险组对免疫治疗更敏感。应用ESTIMATE R软件包发现低风险组的免疫评分和估计评分明显高于高风险组的患者，可以评估化疗和免疫治疗的临床效果。

本发明进一步阐明铜死亡相关lncRNA和UCEC之间的关系，这为探索治疗UCEC的新靶点，特别是免疫治疗提供强有力的理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为UCEC中生存相关CRL的识别：A：CRL与UCEC的预后相关；B：前20位存活相关CRL的森林图；C：铜死亡基因和51个生存相关CRL之间联系的调节图；D：CRL的Lasso回归曲线；E：用Lasso进行变量选择的10倍交叉验证结果；

图2为高风险和低风险组的预后模型预测；A：两个风险组中11个CRL的热图；B：风险分数的分布；C：生存时间和临床终点；D：高危组和低危组患者OS的K-M生存曲线；E：预测模型的时间依赖ROC曲线；F：风险评分与临床特征的关系；

图3为Nom图和校准曲线；A：Nom图；B：1年、3年和5年生存率的校准曲线；

图4为RT-qPCR验证在UCEC组织和癌旁组织中差异表达的CRL的表达水平，包括AC083799.1、AL603832.1、AC243772.2、AC013731.1、AC004596.1、AC080013.4和AC002116.2；

图5为GSEA富集KEGG途径的差异；A：高风险组中的富集途径；B：低风险组的富集途径；

图6为风险评分与免疫细胞和免疫功能的关系；A：两组免疫细胞浸润的差异；B：两组的免疫细胞ssGSEA评分；C：两组的免疫功能评分；

图7为高风险和低风险人群的免疫微环境；A：两个危险组中免疫检查点表达的差异；B：两组间质评分、免疫评分和评估评分；

图8为常见化疗药物、靶向药物和免疫治疗药物的风险评分与IC50的相关性，包括ABT888、顺铂(cisplatin)、阿霉素(doxorubicin)、足叶乙甙(etoposide)、紫杉醇(paclitaxel)、PD.173074、索拉非尼(sorafenib)、吉西他滨(gemcitabine)、多西紫杉醇(docetaxel)、拉帕替尼(lapatinib)和二甲双胍(metformin)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明从TCGA数据库下载了UCEC患者的临床信息、RNA-seq测序数据。通过Pearson相关和wilcox分析筛选与铜死亡相关的差异lncRNAs，采用单因素Cox回归、LASSO回归和多因素Cox回归分析建立并验证了UCEC患者预后风险模型。K-M和ROC曲线分析风险模型的临床价值，随后我们筛选独立预后因素，建立了基于临床参数和风险分数的预后模型，同时还分析了风险分数(RS)与免疫细胞浸润、免疫检查点分子和化疗靶向药物敏感性之间的相关性。具体试验设计如下：

1试验设计

1.1数据收集

552个UCEC肿瘤和35个癌旁组织的RNA序列数据从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载。FPKM值用于识别表达的lncRNAs。我们检索了526名患者的临床信息进行生存分析，如年龄、性别、生存状态和随访天数。

1.2生存相关CRL的选择

从铜死亡基因集和相关文献中筛选出15个铜死亡基因。对UCEC样本中的所有lncRNAs与铜死亡基因进行Pearson相关分析。某些lncRNAs(|系数|>0.3，P值<0.001)被视为CRL。使用R软件包“igraph”显示lncRNAmRNA网络，以显示铜死亡基因和CRL之间的相互调节联系。此外，使用R包“limma”比较UCEC组织和癌旁组织之间CRL的差异表达，标准为|Log2(FC)|>1。

1.3预后模型的建立和验证

采用单Cox回归分析确定生存相关CRL(P<0.05)。所有lncRNAs均在火山图中显示，无论是否与UCEC预后显著相关，前20名生存相关的CRLs显示在森林图中。用R包“ggplot2”和“ggplot2”对铜死亡基因和生存相关CRL进行调控。随后，我们进行了LASSO和multi-Cox回归分析，以建立一个预后模型。UCEC患者的风险分数按以下公式计算：

风险分数＝Σ[coef(lncRNA)×Exp(lncRNA)]；

所有UCEC样本分为低风险组和高风险组。使用由R软件包“生存率”制成的K-M曲线来评估两组的OS。计算ROC曲线下1年、2年和3年的面积(AUC)，以评估模型的准确性。此外，还分析了风险评分与年龄、性别和生存状况的相关性。

1.4基因集富集分析(GSEA)

R软件包“clusterProfiler”、“limma”、“org.Hs.e.g.db”和“enrichplot”用于识别高风险组和低风险组的富集途径(如果P<0.05，则具有统计学意义)。GSEA 4.2.2显示了富集途径。

1.5构造Nom图

根据风险评分和临床病理特征(如年龄和等级)进行分层生存分析，以探讨铜死亡的适用性。考虑到具有R包“rms”的UCEC患者1年、3年和5年OS的独立预后因素，开发了Nom图。使用Hosmer-Lemeshow绘制校准曲线，以说明实际结果和预测结果之间的一致性。

1.6RNA分离和RT-qPCR

使用TRIzol试剂(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific)从UCEC冷冻组织中提取总RNA。随后，我们根据制造商的说明，使用PrimeScript RT试剂盒(Takara)将RNA反向转录成cDNA(3000ng/10μl反应体系)。然后在StepOne

1.7风险评分与免疫细胞浸润的关系

使用XCELL、TIMER、QUANTISEQ、McCounter、EPIC、CIBERSORT-ABS和CIBERSORT等七种软件评估风险评分与肿瘤浸润免疫细胞之间的相关性。比较两个危险组的免疫细胞浸润和功能。此外，使用R软件包“估计”计算两组的TME评分，包括基质评分、免疫评分和估计评分。

1.8化疗和免疫治疗不同反应的风险评分

我们使用R包“Prrophytic”、“limma”、“ggpub”和“ggplot2”计算了16种可用于UCEC治疗的常见药物的IC50值，旨在预测高风险和低风险组UCEC患者对化疗、靶向和免疫治疗药物的反应。采用Wilcoxon签名排名测试分析两组IC50值的差异。

2.试验结果

2.1UCEC中CRL的识别和表征

从RNA图谱中总共提取了14004个lncRNAs，1265个lncRNAs与铜死亡基因相关，被认为是CRLs。建立mRNA-lncRNA共表达网络以确定铜死亡的潜在影响。其中，与正常组织相比，429个lncRNAs在UCEC组织中失调，包括249个上调的lncRNAs和180个下调的lncRNAs。热图显示了前100个差异表达的CRL，它可以有效区分肿瘤组和非肿瘤组。

2.2基于CRLs的预测预后模型构建

进行单因素Cox回归分析以筛选与生存相关的CRL，图1A显示CRL与UCEC的预后相关。共发现51个与存活相关的CRL，前20个出现在森林图中(图1B)。此外，我们绘制了铜死亡基因和生存相关CRL的调节图，结果表明大部分为正调节(图1C)。进行Lasso回归分析以排除共表达的CRL并避免过度拟合(图1D)，并选择20个CRL进行进一步分析，图1E为用Lasso进行变量选择的10倍交叉验证结果。随后，我们通过多Cox回归分析构建了一个由11个CRL组成的预后模型。如下表：

Table2 The prognosis model based on CRLs

采用方法部分提到的公式计算UCEC患者的风险分数。根据上述11个预后相关CRLs构建模型并得到根据其表达量计算风险分数的公式为：

风险分数＝(0.39436×AC103563.2表达水平)+(0.10874×LINC01629表达水平)+(0.5615×AL603832.1表达水平)+(0.10148×AC080013.4表达水平)+(0.31082×AC002116.2表达水平)+(0.38386×AC002306.1表达水平)-(1.45378×AC004596.1表达水平)+(1.3714×AC243772.2表达水平)+(0.58447×AC100861.1表达水平)-(0.05297×AC083799.1表达水平)-(0.62657×AC013731.1表达水平)；

根据风险评分的中位数，将所有UCEC患者分为高危组(260例)和低危组(261例)。

2.3预后模型的评估

我们比较了11个CRL的表达、风险评分的分布以及低风险组和高风险组之间的生存状态，以评估所构建模型的预后。结果表明，在高危组中，三个CRL(AC004596.1、AC083799.1和AC013731.1)下调，其他八个CRL上调(图2A)。图2B-D结果显示，高危组的风险评分明显较高。随着风险评分的增加，死亡患者增多。低风险组患者的生存率显著提高(P<0.001)。ROC曲线用于评估UCEC患者风险评分的预测性能。风险评分的1年、2年和3年AUC分别为0.842、0.814和0.759(图2E)，证明基于11个预后相关CRLs构建的预后模型对UCEC患者的预后具有良好的区分性能，可以准确预测UCEC患者的预后。同时，对两组UCEC患者按年龄、等级和生存状态进行分层生存分析，以揭示风险评分与临床病理变量预后之间的关系。结果表明，65岁以上组、G3组和死亡组的患者风险评分较高。结果表明，风险评分与临床病理变量显著正相关(图2F)。

2.4Nom模型的建立

根据年龄、等级和风险评分等临床病理因素，开发了Nom图来预测UCEC患者的生存率，以将CRL的特征转化为临床效用。1年、3年和5年预测分别为0.981、0.916和0.885。校准图用于证明预测结果和实际观察结果之间的一致性，结果显示出良好的对应关系(见图3，A：用于预测操作系统的Nom图；B：1年、3年和5年生存率的校准曲线)。

2.5通过RT-qPCR验证构成预后模型是否具有诊断、预后价值

使用RT-qPCR在20个UCEC肿瘤组织和10个癌旁组织中验证了构成预后模型的11个CRL的表达水平。结果证实，与癌旁组织相比，包括AC083799.1、AL603832.1、AC243772.2、AC013731.1、AC004596.1和AC002116.2在内的六种lncRNAs在UCEC肿瘤中显著上调，而AC080013.4在UCEC肿瘤中下调(见图4)，这与我们的TCGA数据库分析结果一致。其他四种lncRNAs在肿瘤和癌旁组织中的表达水平非常低，难以通过RT-qPCR检测到。

2.6以预后模型为特征的肿瘤免疫微环境(TME)

GSEA软件用于分析高风险组和低风险组之间的生物功能差异。如图5所示，几种肿瘤和免疫相关通路，如Notch、Wnt、VEGF和mTOR信号通路，在高危组中显著富集(图5A)，低风险组富集的途径主要与代谢有关(图5B)。提示信号通路在UCEC患者的进展中起着至关重要的作用。

此外，我们通过七种不同的软件研究了风险评分与肿瘤浸润性免疫细胞之间的相关性。结果如图6A-C所示，更多的免疫细胞与风险评分呈显著负相关，尤其是CD8+T细胞、NK细胞和T细胞调节细胞。然后，应用ssGSEA量化不同免疫细胞和功能的得分。我们发现风险评分与CD8+T细胞、树突状细胞(DC)、未成熟树突状细胞(IDC)、中性粒细胞、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和辅助性T细胞呈负相关；而与活化的树突状细胞(ADC)呈正相关。一些免疫功能，如T细胞共刺激/共抑制、Ⅱ型干扰素反应、HLA、细胞溶解活性、检查点和CCR，在低风险组的得分高于高风险组。然而，MHCⅠ类和Ⅰ型干扰素应答在高危组较高。

2.7高风险组和低风险组之间的TME特征

通过比较两个风险组中不同免疫检查点的表达，发现低风险组中有几个免疫检查点激活，例如CTLA-4、CD44、CD40/40LG、CD200、TNFSF14/15和TNFRSF14。结果表明，低风险组的免疫功能被激活，其中患者对免疫治疗更敏感(图7A)。计算两组的TME(免疫微环境)评分，包括基质评分、免疫评分和估计评分。发现低风险组患者的免疫评分和估计评分明显高于高风险组(图7B)。

2.8风险评分与化疗和免疫治疗反应的关系

我们分析了16种FDA批准的化疗和免疫药物的风险评分与IC50值之间的关系。发现ABT888、顺铂(cisplatin)、阿霉素(doxorubicin)、足叶乙甙(etoposide)、紫杉醇(paclitaxel)、PD.173074、索拉非尼(sorafenib)和吉西他滨(gemcitabine)在高危组更敏感。而低风险组患者对多西紫杉醇(docetaxel)、拉帕替尼(lapatinib)和二甲双胍(metformin)更敏感(见图8)。而其他五种药物(AG.014699、AZD.2281、阿糖胞苷、舒尼替尼和丝裂霉素)在两组之间没有差异。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。