FaU-box E3基因家族在调控草莓果实成熟中的应用

摘要

本发明公开了FaU‑box E3基因家族在调控草莓果实成熟中的应用，属于生物信息技术领域。上述FaU‑box E3基因家族包括FaU‑box98、FaU‑box36和FaU‑box52。本发明通过生物信息技术结合基因表达分析，筛选出与草莓果实成熟相关的FaU‑box E3基因家族成员，并具体的确定FaU‑box98和FaU‑box36正向调控草莓果实成熟，FaU‑box52负向调控草莓果实成熟。因此，本发明为草莓果实成熟相关的特异性基因的大范围鉴定以及功能分析奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，特别是涉及FaU-box E3基因家族在调控草莓果实成熟中的应用。

背景技术

基因家族是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因复制而产生两个或更多的拷贝而演变成的一组基因，它们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物。同一家族的基因成员数量从几个到几百个不等，由多基因控制的性状存在主效基因。目前，关于多基因成员的基因家族功能鉴定多数采用随机选择，或者逐个挑选基因进行功能验证，容易漏选、误选，且工作量繁琐巨大。鉴于此，有必要提供一种快速、适用性范围广、利用已有技术和数据库的基因家族鉴定并从中预测、筛选出具有特定功能或者参与特定生物进程的成员方法。

泛素/26S蛋白酶体系统(UPS)是真核生物和植物中重要的翻译后调节机制之一，在信号转导、代谢调节和应激反应等各种生物过程中发挥着关键的调节作用，并最终导致特定泛素化底物蛋白的降解。目标蛋白的泛素化需要三步共轭级联反应的参与，该级联反应由E1(泛素激活酶)、E2(泛蛋白共轭酶)和E3(泛素连接酶)组成。其中，E3泛素连接酶是最大、最多样的一类，由于其识别修饰目标蛋白的能力，被视为泛素化特异性的决定因素。E3泛素连接酶可分为9个亚家族，包括RING、HECT、U-box、F-box、cullin、BTBT、DDB、RBX和SKP。RING、HECT和U-box E3类型作为单一多肽蛋白起作用，而其他六种E3类型在多亚基复合物中起作用。尽管U-box E3连接酶是所有E3连接酶亚家族中最小的一个家族，但它在植物生长发育和应激反应中起着重要作用。

U-box E3蛋白具有70个含有U-box结构域的特征性氨基酸，该结构域与RING型结构相关，但缺乏整合半胱氨酸和组氨酸残基的保守特征性锌。已在各种植物中鉴定出U-boxE3蛋白，基因数量因物种而异。拟南芥、番茄、桃、葡萄、香蕉、水稻和大豆的基因组分别有60、62、54、56、91、76和120个U-box E3基因。但草莓种U-box类型的E3泛素连接酶包含多少个基因成员还未得到分析、鉴定和报道。目前，Tan等人证明了U-box E3基因与桃中的乙烯、生长素和ABA有关。还发现，U-box 13、43、50和51高度表达，并预测在番茄果实的发育和成熟中起作用。苹果中的U-box型E3泛素连接酶MdPUB24被证明是乙烯激活的，并促进水果叶绿素降解。此外，有研究表明，葡萄U-box E3泛素连接酶VlPUB38通过促进脱落醛氧化酶降解来负调控果实成熟。所有这些结果表明，U-box E3基因在果实成熟过程中具有重要的潜在作用。然而，草莓中U-box E3基因的家族鉴定、分析，以及与成熟相关的基因成员筛选还缺乏。

发明内容

本发明的目的是提供FaU-box E3基因家族在调控草莓果实成熟中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过生物信息学分析结合基因表达分析，快速筛选草莓中成熟相关FaU-box E3基因家族成员，为草莓果实成熟相关的特异性基因的大范围鉴定以及功能分析奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供FaU-box E3基因家族在调控草莓果实成熟中的应用，所述FaU-box E3基因家族包括FaU-box98、FaU-box36和FaU-box52。

优选的是，所述FaU-box98和FaU-box36正向调控草莓果实成熟；所述FaU-box52负向调控草莓果实成熟。

本发明还提供一种检测FaU-box E3基因家族表达的试剂在制备鉴定与调控草莓果实成熟相关的基因的产品中的应用，所述FaU-box E3基因家族包括FaU-box98、FaU-box36和FaU-box52。

优选的是，所述试剂用于检测FaU-box E3基因家族表达量，其检测方法具体包括：将待测草莓果实样品用ABA和蔗糖处理后，相比所述草莓果实样品处理前，FaU-boxE3基因家族成员表达量上升，则认为该FaU-box E3基因家族成员为正向调控草莓果实成熟相关的基因；FaU-box E3基因家族成员表达量下降，则认为该FaU-box E3基因家族成员为负向调控草莓果实成熟相关的基因。

本发明还提供一种鉴定与草莓果实成熟相关的基因的产品，包括FaU-box E3基因家族，所述FaU-box E3基因家族包括FaU-box98、FaU-box36和FaU-box52。

优选的是，所述FaU-box98和FaU-box36正向调控草莓果实成熟；所述FaU-box52负向调控草莓果实成熟。

优选的是，所述产品包括试剂盒。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用生物信息学分析技术和现有数据库筛选，发现FaU-box E3基因家族可能参与草莓果实成熟调控；通过进一步鉴定显示，FaU-box E3基因家族中，FaU-box98和FaU-box36正向调控草莓果实成熟，以及FaU-box52负向调控草莓果实成熟。本发明为与调控草莓果实成熟相关的特异性基因的大范围鉴定以及功能分析奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于FaU-box和AtU-box蛋白序列构建的系统进化树；

图2为利用已公布的草莓果实成熟相关转录组数据，获得FaU-box E3基因的表达量；FR，PR和LG分别表示草莓果实不同的成熟阶段；FR，full red，全红时期；PR，partialred，片红时期；LG，large green，大绿时期；

图3为根据FaU-box E3基因的表达量变化趋势，利用R软件进行聚类分析的结果；

图4为利用已公布的ABA和蔗糖处理的草莓果实转录组数据获得FaU-box E3基因表达量；

图5为qPCR鉴定所筛选出的FaU-box基因在草莓果实不同成熟阶段的表达；其中SG，LG，W，PR，FR分别草莓果实不同的成熟阶段；SG，small green，小绿时期；LG，largegreen，大绿时期；W，white，白果时期；PR，partial red，片红时期；FR，full red，全红时期；

图6为qPCR鉴定ABA和蔗糖处理对FaU-box E3基因表达的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、快速筛选草莓中与成熟相关的FaU-box E3基因家族成员

1.1草莓基因组范围内FaU-box E3基因鉴定

①从Pfam数据库下载获得U-box保守结构域，PF04564；

②从GDR数据库中下载最新的栽培草莓基因组序列；

③采用HMMER软件包中的hmmscan命令首先构建HMM模型，然后在栽培草莓基因组范围内进行扫描搜索(E值设置为10

④利用SMART数据库对上述结果进行验证，2个数据库均鉴定到的基因，鉴定为FaU-box E3家族基因进行后续分析。

利用上述生物信息学分析技术和现有数据库，首次从栽培草莓基因组范围内鉴定出FaU-box E3泛素连接酶基因家族，共包含了155个基因成员。

1.2FaU-box E3基因家族进化树分析

①从TAIR拟南芥基因组数据库下载拟南芥AtU-box E3基因家族蛋白质序列；

②利用Clastal X软件对拟南芥AtU-box和草莓FaU-box E3蛋白序列进行多重比对，然后用MEGAX软件，利用蛋白全长氨基酸序列构建系统进化树，方法选择邻位相连算法(Neighbor-Joining，NJ)，bootstrap参数设置为1000。

如图1所示，为基于FaU-box和AtU-box蛋白序列构建的系统进化树，结果显示：与拟南芥AtU-box基因构建进化树发现，这155个基因可以分为4个大组。

1.3FaU-box E3基因家族在草莓果实成熟过程中的表达量分析

①NCBI SRA数据库中已公布的栽培草莓果实成熟过程中转录组原始数据下载；

②通过比对基因组、基因注释等过程分析转录本的转录丰度(FPKM)，并获得上述鉴定的FaU-box E3基因的表达量；

③利用R软件的TCseq包对草莓果实成熟过程中FaU-box E3基因表达量变化进行聚类分析。

结果发现：利用已公布的草莓果实成熟相关转录组数据，获得FaU-box E3基因的表达量(图2)，根据其变化趋势，利用R软件进行聚类分析，发现可以分为6个大类(图3)，其中在草莓果实成熟过程中不断上升的cluster1，为成熟过程中正向调控的基因；不断下降的cluster5和cluster6为负向调控的基因，大大缩小了筛选范围。

1.4FaU-box E3基因家族在ABA和蔗糖处理后的表达量分析

①NCBI SRA数据库中下载已公布的ABA和蔗糖协同处理(95μM ABA+100μM蔗糖，等体积混合)栽培草莓果实成熟转录组原始数据；

②通过比对基因组、基因注释等过程分析转录本的转录丰度(FPKM)，并获得上述鉴定的FaU-box E3基因响应ABA和蔗糖处理的表达量。

结果显示，利用已公布的ABA和蔗糖处理的草莓果实转录组数据获得FaU-box E3基因表达量(图4)，因为ABA和蔗糖协同处理会显著促进果实成熟。因此，将ABA和蔗糖处理后表达量显著上升的FaU-box E3基因，认为是与草莓果实成熟正相关的基因，而ABA和蔗糖处理后表达量显著下降的FaU-box E3基因，则被认为是与草莓果实成熟负相关的基因。

1.5采用双内参基因对筛选的FaU-box E3基因进行实时荧光定量表达验证

①选择草莓26-28S和FaActin基因作为内参基因，用于FaU-box E3基因表达量的校正；

②采用Primer软件对筛选出的FaU-box E3基因进行特异引物设计，引物序列如下表所示；

表1引物

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采用上述引物，以及CFX96 Real-Time PCR Detection System检测仪和

其中，PCR反应体系为：1μL Primer F(10mmol·L

反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，57℃退火30s，40个循环且每个循环结束后测定荧光，在65℃到95℃熔解中进行连续荧光数据采集用以熔解曲线分析。

如图5和图6所示，qPCR验证结果显示：验证上述筛选出的FaU-box E3基因，其中，正向调控草莓果实成熟的家族成员为FaU-box98和FaU-box36，以及负向调控草莓果实成熟的成员FaU-box52。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。