一种猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。所述制备方法包括：将TRAF1重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，TRAF1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过构建猪源TRAF1基因的原核和真核表达载体，制备特异性的多克隆抗体，验证了该多克隆抗体可以特异性结合原核表达和真核表达的TRAF1蛋白，猪瘟(CSFV)感染PK‑15细胞后，TRAF1蛋白表达水平显著提高；体外过表达TRAF1能显著抑制CSFV的复制。因此，本发明所制备的多克隆抗体可应用到检测TRAF1或鉴定TRAF1与CSFV互作，为深入探索和了解CSFV与TRAF1蛋白互作机制及其在信号通路中的功能及细胞免疫机制奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起猪的一种急性、败血性和接触性传染病，在全球各地广泛流行，对养猪业造成了巨大经济损失。由于猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用，猪瘟疫情从急性大流行变成以地区性散发为主，病情更为复杂，出现潜伏、临床症状不明显、持续性感染和多种病毒混合感染的现象。如今需要深入研究CSFV的致病机理和免疫机制，尤其是研究病毒与宿主分子之间的互作网络、宿主免疫应答对病毒复制周期的调控机制等方面来寻找切入点，以便为猪瘟防控提供更为完善的理论基础。

肿瘤坏死受体相关因子(TRAF)超家族是参与固有免疫系统的重要成员，TRAF1是通过与TNFR2特异结合而被发现的首个成员，在免疫和炎症方面具有广泛的功能。TRAF1完整编码区包括1248bp，编码416aa，蛋白的分子量为45kDa。TRAF1除了在N端缺失环指结构，其余结构与TRAFs家族成员一致，都包含一个锌指结构域，一个N端的TRAF结构域和一个C端的TRAF结构域。TRAF1能与多种细胞内蛋白结合，包括接头蛋白、受体相互作用蛋白等，表明TRAF1参与了细胞分子复杂的信号网络。TRAF1作为免疫反应正调节和负调节因子的作用可以归因于它参与了多种信号通路。TRAF1在人类艾滋病病程中高度表达于CD8 T细胞从而有效控制艾滋病；在人类丙型肝炎病毒感染中，TRAF1促进IL-7R，Mcl-1和CD107a的表达而增强细胞免疫；TRAF1通过激活NF-κB、MAPK和IRF7通路抑制EB疱疹病毒的感染。此外，TRAF1抑制CD3诱导的T细胞NF-κB激活和增值；TRAF1的磷酸化抑制了Hela细胞中NF-κB和JNK信号，也对TBK1招募到4-1BB信号复合物有负面影响。近年来，对TRAF1在分子、细胞学水平上功能的研究越来越全面，但大多主要集中在人和鼠的TRAF1基因进行的相关的研究，而关于猪TRAF1基因的研究相对较少，目前市面上并无猪TRAF1商品化抗体，且在CSFV感染过程中的作用鲜有报道，难以对猪源TRAF1蛋白生物学特性、细胞定位及其与CSFV的相互作用等机制更加深入探索。在研究病毒蛋白的功能以及病毒与宿主的相互作用机理中，抗体是重要且有效的工具，因此，制备一种特异性的有效抗体对于探索CSFV与猪源TRAF1蛋白之间的关系具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建猪源TRAF1基因的原核和真核表达载体，并制备具有良好特异性的多克隆抗体，验证了该多克隆抗体可以特异性结合TRAF1蛋白，并且CSFV感染PK-15细胞后，TRAF1的蛋白表达水平显著提高；体外过表达TRAF1显著抑制CSFV的复制。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将TRAF1重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，所述TRAF1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的是，所述TRAF1重组蛋白的构建方法包括如下步骤：

将TRAF1原核表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞制备重组基因工程菌，再利用IPTG诱导所述重组基因工程菌表达目的蛋白，通过亲和层析进行纯化，得到所述TRAF1重组蛋白。

本发明还提供所述的制备方法制备的猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体。

本发明还提供所述的猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体在制备抗猪瘟病的疫苗或者药物中的应用。

本发明还提供所述的猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体在制备检测或者诊断猪瘟病的产品中应用。

优选的是，所述猪源抗病毒蛋白TRAF1多克隆抗体与TRAF1重组蛋白特异性结合，通过检测TRAF1重组蛋白表达水平判断猪瘟病毒感染情况。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以猪源TRAF1基因作为研究对象，开展了基因克隆、构建原核及真核表达载体，利用纯化的原核表达蛋白制备多克隆抗体，通过Western-blot验证真核表达载体转染HEK-293T细胞的蛋白特异性反应，同时利用间接免疫荧光(IFA)检测真核表达载体转染PK-15细胞表达的蛋白，结果显示，制备的多克隆抗体均能检测到HEK-293T细胞表达的目的蛋白，同时可观察到转染PK-15细胞中特异性荧光。多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞表达的TRAF1和蛋白反应性，结果显示，CSFV感染PK-15细胞后，TRAF1蛋白表达水平均显著提高；体外过表达TRAF1显著抑制CSFV的复制。因此，推测TRAF1在宿主对抗CSFV感染过程中扮演重要角色，说明本发明所制备的多克隆抗体可应用到检测或者诊断CSFV的试剂或者试剂盒等产品中，也为深入探索和了解CSFV与TRAF1蛋白互作及其在信号通路中的功能及细胞免疫机制奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为猪TRAF1亲疏水性预测；

图2为猪TRAF1基因的PCR扩增电泳图；M：DL2000 Marker；1：TRAF1基因PCR产物；

图3为TRAF1菌液PCR电泳结果图；M：DL2000 Marker；1-4：单菌落PCR电泳产物；

图4为PCR扩增TRAF1原核表达片段的电泳图；M：DL2000 Marker；1：TRAF1原核表达片段PCR产物；

图5为pMD-TRAF1-576菌液PCR电泳结果图；M：DL2000 Marker；1-3：pMD-TRAF1-576单菌落PCR电泳产物；

图6为pET-TRAF1双酶切电泳结果图；M：DL10000 Marker；1：pET-TRAF1重组质粒经HindⅢ/NotⅠ双酶切电泳产物；

图7为PCR扩增TRAF1真核表达片段电泳图；M：DL2000 Marker；1：TRAF1真核表达片段PCR电泳产物；

图8为pMD-TRAF1-H/N重组质粒菌液PCR电泳结果图；M：DL2000 Marker；1-3：pMD-TRAF1-H/N单菌落PCR电泳产物；

图9为pcDNA-TRAF1双酶切电泳结果图；M：DL10000 Marker；1：pcDNA-TRAF1经HindⅢ/NotⅠ双酶切电泳产物；

图10为SDS-PAGE分析TRAF1重组蛋白表达形式；M：蛋白Marker；1：未诱导的pET-32a(+)空载转化菌；2：诱导的pET-32a(+)空载转化菌；3：未诱导的重组菌；4：未诱导的重组菌沉淀；5：未诱导的重组菌上清；6：诱导表达的重组菌；7：诱导表达的重组菌沉淀；8：诱导表达的重组菌上清；

图11为TRAF1重组蛋白的纯化过程；M：蛋白Marker；1：重组菌上清；2：20mmol/L咪唑穿透蛋白液；3-4：70mmol/L咪唑洗涤蛋白液；5-9：250mmol/L咪唑洗脱蛋白液；

图12为SDS-PAGE和Western-blot检测纯化的TRAF1重组蛋白；A：SDS-PAGE检测；B：Western-blot检测；M：蛋白Marker；1-2：纯化的TRAF1重组蛋白；

图13为Western-blot鉴定TARF1多克隆抗体与重组蛋白反应；M：Protein Marker；1：TRAF1重组蛋白；

图14为抗FLAG标签抗体检测真核表达的TRAF1-FLAG特异性(抗FLAG鼠源单抗1:1000)；1：293T细胞；2：转染pcDNA3.0的293T细胞；3：转染pcDNA-TRAF1的293T细胞；

图15为TRAF1多克隆抗体检测TRAF1-FLAG重组蛋白的特异性；1：293T细胞；2：转染pcDNA3.0的293T细胞；3：转染pcDNA-TRAF1的293T细胞；

图16为IFA检测抗TRAF1抗体与PK-15中过表达的TRAF1蛋白的反应性；A：转染pcDNA3.0的PK-15细胞；B：转染pcDNA-TRAF1的PK-15细胞；C：40倍镜观察；

图17为TRAF1多克隆抗体的效价测定；

图18为CSFV感染PK-15后TRAF1的蛋白表达水平；

图19为过表达TRAF1蛋白对猪瘟病毒的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、猪TRAF1生物信息学分析

1.1猪TRAF1蛋白抗原性分析

利用DNAStar对猪源TRAF1基因进行分析，TRAF1完整编码区包括1248bp，编码415aa，蛋白的分子量为45kDa，截取抗原表位好、亲水性高的1-192aa构建原核表达载体。

TRAF1编码的氨基酸序列，其中下划线序列为原核表达所用氨基酸(SEQ ID NO：1)：

MASGSASSPRPAPDENEFPFGCPPTICQNPAEPKPLCCTVCLPENVRNGEDQICPKCKGDDTPSESPG

1.2猪TRAF1蛋白亲疏水性分析

用ExPasy在线软件和DNAStar中Protean软件预测分析猪源TRAF1亲水性和疏水性。如图1所示，TRAF1蛋白1-108aa、155-192aa、204-288aa和311-408aa的抗原表位峰值平均峰值均大于1.6，整体抗原表位峰值均在0以上，说明该蛋白具有良好的抗原表位，图中红色框区域1-192aa即为TRAF1蛋白进行原核表达的氨基酸区域。

2、猪全长TRAF1基因的克隆

收集感染CSFV的PK-15细胞样品，用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，设计针对TRAF1全长mRNA的特异性引物TRAF1-F和TRAF1-R，进行PCR扩增，获得TRAF1基因目的片段，大小为1248bp，电泳结果如图2所示。

TRAF1-F：5'-tggcctctggctcagccag-3'；

TRAF1-R：5'-ctaagcgtttgtctccacgat-3'；

扩增反应体系：cDNA模板2μL，Prime STAR 12.5μL，TRAF1上游引物和下游引物各1.0μL，ddH

反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃15s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix 12.50μL，72℃延伸30min。

将全长TRAF1片段连接至pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞中，转化产物接种于固体培养基上获得单克隆菌落，进行菌液PCR鉴定，如图3所示，将PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序正确获得重组质粒命名为pMD-TRAF1-1248。

3、TRAF1原核表达片段的克隆

3.1TRAF1原核表达片段扩增

以pMD-TRAF1-1248质粒作为模板，用引物TRAF1-576-B和TRAF1-561-N进行PCR扩增576bp的TRAF1原核表达片段，如图4所示，在576bp位置得到目的条带。

TRAF1-576-B：5'-GGATCCAgcctctggctcagccagc-3'；

TRAF1-561-N：5'-GCGGCCGCBcttcccctccagctctgtcag-3'；

扩增反应体系：cDNA模板2μL，Prime STAR 12.50μL，TRAF1上游引物和下游引物各1.0μL，ddH2O补至25.0μL。

反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃10s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix 12.50μL 72℃延伸30min。

对目的片段进行胶回收后与pMD18-T载体连接，进行菌液PCR鉴定(图5)，鉴定为阳性的菌液进行测序分析，测序结果与GenBank中发表TRAF1序列一致，表明成功构建原核重组质粒pMD-TRAF1-576。

3.2TRAF1基因原核表达载体构建

用限制性内切酶HindⅢ与NotⅠ分别将原核载体pET-32a(+)与pMD-TRAF1-576质粒进行双酶切，电泳后分别进行胶回收pET-32a(+)载体大片段和TRAF1目的基因，通过T4连接酶将576bp的TRAF1片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上，获得重组原核表达重组质粒pET-TRAF1，重组质粒经双酶切鉴定，如图6所示，在预期位置576bp位置出现TRAF1目的片段。鉴定为阳性的质粒进行测序分析，测序结果与GenBank中发表TRAF1序列一致，表明成功构建原核重组质粒pET-TRAF1。

4、TRAF1真核表达载体的构建

4.1TRAF1真核片段的扩增

以3.1步骤中pMD-TRAF1-1248质粒为模板，以带有酶切位点的特异性引物TRAF1-1248-H和TRAF1-1248-N进行PCR扩增TRAF1基因1248bp的全长CDS片段，图7所示，1248bp位置出现TRAF1目的条带。

TRAF1-1248-H：5'-AAGCTT

TRAF1-1248-N：5'-

上述引物序列中，横线部分是酶切位点的序列，B字母代表Not I酶切位点；C字母代表Hind III酶切位点，D字母代表KOZAK序列，F字母代表Flag标签序列。

扩增反应体系：cDNA模板2μL，Prime STAR 12.50μL，TRAF1-1248-H和TRAF1-1248-N各1.0μL，ddH

反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃15s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix 12.50μL 72℃延伸30min

对目的片段进行胶回收，连接pMD-18T载体，转化进DH5α感受态细胞中，培养12-16h，挑取单个菌落进行PCR鉴定，如图8所示，将阳性质粒进行测序分析，测序结果与GenBank中发表猪TRAF1基因序列一致，表明成功获得pMD-TRAF1-H/N重组质粒。

4.2TRAF1真核载体构建

用限制性内切酶HindⅢ与NotⅠ分别将真核表达载体pcDNA3.0与pMD-TRAF1-H/N质粒分别进行双酶切，分别回收pcDNA3.0大片段和TRAF1-H/N目的片段，通过T4连接酶将TRAF1-H/N片段与真核表达载体pcDNA3.0进行连接，构建重组真核表达质粒，命名为pcDNA-TRAF1，经双酶切鉴定，如图9所示，得到二条特异性目的条带，即1248bp的TRAF1和5446bp的pcDNA3.0目的条带。鉴定为阳性的质粒进行测序分析，结果插入的TRAF1真核表达片段序列及载体序列均正确，表明成功构建真核表达载体pcDNA-TRAF1。

5、TRAF1重组蛋白诱导表达

将测序正确的pET-TRAF1重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落到LB中培养12-16h，取1mL培养过夜的菌种，加入100mL LB培养基中37℃培养约4-6h。当OD

6、TRAF1重组蛋白的纯化

经过SDS-PAGE电泳鉴定，TRAF1重组蛋白属于可溶性蛋白，故利用Ni-NTA亲和层析进行纯化，在纯化过程中分别收集的重组蛋白纯化前的上清、上清穿过Ni-NTA柱的穿透液(20mmol/L低浓度的咪唑)、2次杂蛋白洗涤液(70mmol/L中浓度的咪唑)、5次目的蛋白洗脱液(250mmol/L高浓度的咪唑)进行SDS-PAGE考马斯亮蓝染电泳和Western-blot鉴定，图11所示。

结果表明，70mmol/L咪唑洗涤液中检测的均为洗涤下来的部分杂蛋白，由于融合表达His标签的TRAF1重组蛋白与Ni-NTA柱中Ni

7、TRAF1重组蛋白纯化鉴定

SDS-PAGE胶经考马斯亮蓝染色和Western-blot蛋白印迹表明，TRAF1重组蛋白属于有活性的可溶性蛋白，无需经蛋白复性可直接用于小鼠免疫，SDS-PAGE胶经考马斯亮蓝染色获得约40kDa位置处单一蛋白条带，说明经Ni-NTA柱纯化TRAF1重组蛋白效果良好；如图12所示，Western-blot蛋白印迹检测TRAF1重组蛋白纯化情况，以鼠源抗His标签抗体作为一抗，在约40kDa处检测到特异性蛋白条带，说明该重组蛋白融合正确表达了His蛋白标签。

8、TRAF1多克隆抗体的制备及反应性验证

用Ni-NTA亲和层析法从原核细胞BL21表达的TRAF1重组蛋白进行纯化，将纯化后的TRAF1重组蛋白与弗氏佐剂等量混合，进行乳化，参照免疫周期用TRAF1重组蛋白对昆明小鼠进行免疫，具体步骤为：

4周龄昆明小白鼠先饲养3～4d以适应新环境，减少外部应激影响。将纯化融合蛋白TRAF1与佛氏佐剂乳化成油包水乳剂，通过小鼠背部皮下多点注射进行免疫，免疫程序按照1、7、21和42d分4次进行免疫。首次免疫时，融合蛋白TRAF1与佛氏佐剂等体积混合乳化，其余免疫时则与佛氏不完全佐剂等体积混合乳化，每只昆明小白鼠注射约500μg的融合蛋白TRAF1。四免后第7d进行昆明小白鼠眼球采血，分离血清即为制备的抗TRAF1多克隆抗体，按100μL/管分装后-80℃保存备用。

免疫结束后，进行眼球采血，4℃静止过夜析出血清，获得TRAF1多克隆抗体。以重组蛋白作为目标蛋白，利用制备的抗TRAF1多克隆抗体(用脱脂奶粉封闭液按1:1000稀释)进行Western-blot蛋白印迹检测制备的多克隆抗体的反应性。

如图13，在约40kDa处检测到特异性目的条带，表明TRAF1蛋白多克隆抗体和纯化TRAF1重组蛋白具有良好反应性。

9、TRAF1多克隆抗体与真核表达蛋白的特异性反应

使用6孔板培养HEK-293T细胞，根据脂质体2000说明书，分别转染2μg空载体pcDNA3.0和带有Flag标签的真核表达载体pcDNA-TRAF1，收集HEK-293T细胞总蛋白，通过Western-blot鉴定TRAF1多克隆抗体与HEK-293T细胞转染表达的TRAF1蛋白发生的特异性反应，同时以鼠源单抗FLAG抗体检测转染HEK-293T细胞蛋白作为阳性对照(图14)，观察到大小为45kDa的TRAF1-FLAG重组条带，表明转染于HEK-293T细胞真核表达载体融合表达了FLAG标签蛋白；接着，将制备的TRAF1多克隆抗体以1:4000、1:8000、1:16000、1:32000的比例稀释，分别对真核表达的TRAF1-FLAG重组蛋白进行检测(图15)，结果显示，在1:32000稀释多克隆抗体时，TRAF1多克隆抗体仍可检测到HEK-293T细胞转染表达的TRAF1蛋白，结果表明制备获得的TRAF1多克隆抗体具有良好的特异性。

10、IFA检测TRAF1多克隆抗体的特异性

将pcDNA-TRAF1真核质粒转染PK-15细胞，pcDNA3.0空载体转染为阴性对照，转染后48h后，去掉培养基上清，将制备的抗TRAF1多克隆抗体1:300稀释作为一抗孵育转染的PK-15细胞，接着以FITC荧光标记的马抗鼠IgG抗体作为二抗孵育。倒置荧光显微镜下观察荧光信号并拍照分析，IFA检测真核表达载体pcDNA-TRAF1在PK-15细胞的表达情况，如图16所示，结果显示空载体对照组未检测到荧光信号，转染TRAF1真核表达载体的PK-15细胞中成功检测到特异性荧光。结果表明了制备的TRAF1多克隆抗体与真核细胞表达的TRAF1蛋白特异性较好，可用以进行IFA检测。

11、TRAF1多克隆抗体效价测定

收集转染真核表达的TRAF1蛋白的HEK-293T细胞样品作为抗原，用抗原包被液进行稀释，将抗原包被到ELISA酶标板底，接着以制备的多克隆抗体作为一抗，HRP标记的马抗小鼠IgG作为二抗，以未免疫的小鼠血清作为阴性对照，利用间接ELISA测定抗体效价，结果表明，当多克隆抗体1:64000稀释时，多克隆抗体孔的OD

12、猪瘟病毒感染PK-15细胞对TRAF1蛋白的影响

PK-15细胞传代至12孔板，细胞培养至约70-80％，以1MOI CSFV感染PK-15细胞，按0、12、24、36和48h定点收集感染CSFV的PK-15细胞总蛋白，进行Western-blot蛋白印迹检测，以CSFV E2鼠单克隆抗体和制备获得的TRAF1多克隆抗体作为一抗(图18)，在24、36和48h时间点成功检测到CSFV E2蛋白，表明CSFV成功感染上PK-15细胞；CSFV感染12、24、36和48h后均成功检测到PK-15细胞内源性表达的TRAF1蛋白，TRAF1在PK-15细胞受到CSFV刺激12h后的表达量显著上升，且持续上升至48h，表明在PK-15细胞中TRAF1随着CSFV的感染而不断上升。

13、过表达TRAF1蛋白对猪瘟病毒的影响

PK-15细胞传代至12孔板，细胞培养至约70-80％，以1.0μg TRAF1真核表达载体转染PK-15细胞，6小时后以1MOI CSFV感染PK-15细胞，按24、36和48h定点收集感染CSFV的PK-15细胞总蛋白，进行Western-blot蛋白印迹检测，以CSFV E2鼠单克隆抗体和制备获得的TRAF1多克隆抗体作为一抗(图19)，在24、36和48h时间点成功检测到CSFV E2蛋白，表明CSFV成功感染上PK-15细胞；TRAF1过表达24、36和48h后均成功检测到PK-15细胞中CSFV E2蛋白减少，表明TRAF1蛋白对CSFV复制具有显著抑制作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。