CpG寡核苷酸对糖尿病心脏自主神经疾病药物中的应用

摘要

CpG寡核苷酸对糖尿病心脏自主神经疾病药物中的应用，实验证实CpG寡核苷酸1826可降低星状神经节卫星胶质细胞激活和炎症细胞因子的表达，抑制嘌呤2Y12受体的表达，降低脂质过氧化损伤来减轻星状神经节神经细胞的铁死亡，从而改善心脏自主神经功能。CpG寡核苷酸1826作为实施例表明，具有抑制炎性作用的CPG‑ODN或对交感神经产生抗损伤保护作用的CPG‑ODN，在糖尿病心脏自主神经疾病、交感神经损伤相关疾病中具有防治药物作用。

说明书

技术领域

本发明涉及糖尿病心脏自主神经疾病药物用途发明领域，尤其是涉及CpG寡核苷酸制备降低糖尿病心脏自主神经疾病药物和防治交感神经损伤相关疾病中的应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人们生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，其致死率被列为大多数高收入国家疾病致死率的第五甚至第四位，成为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4位需要优先考虑的疾病。糖尿病分为1型(胰岛素依赖性)和2型(非胰岛素依赖性)糖尿病。糖尿病心脏自主神经病变(DCAN)是2型糖尿病的常见严重并发症，其特征是支配心脏和血管的自主神经纤维受损，导致心血管系统功能障碍。特别是，心脏交感神经的区域性丧失可导致心脏交感神经元重塑，从而增加室性心律失常和心源性猝死的易感性。颈交感神经系统参与维持心血管稳态。心脏交感神经来自颈交感神经节，星状交感神经神经节的神经纤维可以分布到心丛，从而影响心脏的活动。糖尿病自主神经纤维病的星状交感神经节神经元接收到的传入信号可以影响交感传出活动，从而影响心脏功能的调节。

嘌呤信号转导(Purinergic signalling)主要是兴奋嘌呤受体(Purinergicreceptor)产生效应。P受体包含P1和P2受体，腺苷及其类似物作用于P1受体，三磷酸腺苷(ATP)及其类似物作用于P2受体。P2受体又分为配体门控非选择性离子通道型受体(P2X受体)和促代谢型G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。嘌呤能受体已被证明与心血管疾病有关。P2Y12受体是P2Y亚型的一员，是一种G蛋白偶联型受体。颈交感神经节存在P2Y12受体的表达。卫星胶质细胞(SGC)紧密包裹颈交感神经节中的神经元胞体。外周炎症导致颈交感神经节SGC激活。然后，ATP诱导的P2Y12受体激活介导SGC释放白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)参与心脏自主神经疾病的病理变化。研究表明，星状交感神经节中P2Y12的表达上调并参与糖尿病自主神经病变的过程，下调P2Y12受体的表达可通过减弱异常交感兴奋反射有效改善心功能。

糖尿病患者的活性氧(ROS)和氧化损伤增加。在细胞膜的膜磷脂中高表达的多不饱和脂肪酸很容易受到ROS的攻击，引发许多氧化还原反应，统称为脂质过氧化。铁死亡已被描述为一种依赖铁的细胞死亡形式，由脂质过氧化物的过量积累介导。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)是铁死亡的关键调节因子，以谷胱甘肽(GSH)为代价催化脂质过氧化物的减少，并保护细胞免受膜脂质过氧化。GPX4失活或GSH耗竭导致脂质氢过氧化物的积累，破坏铁稳态最终导致铁死亡。形态学上，铁死亡主要表现为线粒体改变，包括线粒体体积减少、线粒体嵴减少甚至消失、双层膜密度增加、线粒体外膜破裂等。线粒体损伤可导致线粒体DNA释放到细胞质中。

CpG寡核苷酸(CpG ODNs)是合成的短链DNA分子，在特定序列环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供CPG-ODN在制备防治糖尿病心脏自主神经疾病防治药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供CPG-ODN在制备防治交感神经损伤相关疾病防治药物中的应用。

CPG-ODN的作用涉及抑制2型糖尿病模型大鼠星状神经节卫星胶质细胞激活、减少炎性细胞因子表达、降低嘌呤2Y(P2Y)12受体表达、改善铁死亡病理变化，进而缓解糖尿病心脏自主神经疾病。成果表明CPG-ODN可通过以上作用，防治糖尿病心脏自主神经疾病、防治交感神经损伤相关疾病。CPG-ODN 1826抑制2型糖尿病模型大鼠星状神经节卫星胶质细胞激活、减少炎性细胞因子表达、降低嘌呤2Y(P2Y)12受体表达、改善神经细胞铁死亡病理变化的作用。CPG-ODN 1826作为实施例表明具有抑制炎性作用的CPG-ODN或对交感神经产生抗损伤保护作用的CPG-ODN，具有防治糖尿病心脏自主神经疾病、防治交感神经损伤相关疾病的药物作用。

附图说明

图1为CpG ODN 1826对2型糖尿病模型大鼠交感神经放电(SND)活动的影响。糖尿病大鼠的SND明显高于对照组大鼠(p<0.001，图1A，B)。CpG ODN 1826处理后，与未处理糖尿病(DM)组相比，可显著改善糖尿病大鼠异常的颈部SND。结果表明经CpG 1826处理能有效降低糖尿病大鼠颈部SND的激活(p<0.001，图1A，B)。

图2为糖尿病大鼠星状交感神经节P2Y12受体在mRNA水平的表达明显高于对照大鼠(p<0.001)。CpG 1826处理后，较未经处理的DM组相比显著降低了P2Y12受体的表达水平(p<0.01)。

图3为糖尿病大鼠星状神经节P2Y12受体在蛋白水平的表达明显高于对照大鼠(p<0.01)。CpG 1826处理后，较未经处理的DM组相比显著降低了P2Y12受体的表达水平(p<0.01)。

图4为免疫荧光双标检测2型糖尿病神经病理痛大鼠星状神经节(SG)中P2Y12受体与卫星胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)共表达结果。免疫荧光检测显示SG中P2Y12受体与卫星胶质细胞标志物GFAP共表达，提示PY12受体可存在于SG卫星胶质细胞。糖尿病模型(DM)大鼠SG中P2Y12受体与卫星胶质细胞标志物GFAP共表达较对照组增加，CpG ODN 1826处理可降低糖尿病模型大鼠SG中P2Y12受体与卫星胶质细胞标志物GFAP上调的共表达。

图5为实时定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测IL-1β的mRNA表达。结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中IL-1β的mRNA表达较对照组显著增加(p<0.001)；CpG ODN1826处理后的IL-1β的mRNA表达较未处理模型组降低(p<0.01)。

图6为蛋白印迹(Western blotting)检测IL-1β的蛋白水平表达。结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中IL-1β的蛋白水平表达较对照组显著增加(p<0.01)；CpG ODN 1826处理后的IL-1β的蛋白水平表达较未处理模型组降低(p<0.05)。

图7为定量RT-PCR检测TNF-α的mRNA表达。结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中TNF-α的mRNA表达较对照组显著增加(p<0.001)；CpG ODN 1826处理后的TNF-α的mRNA表达较未处理模型组降低(p<0.001)。

图8为Western blotting检测TNF-α的蛋白水平表达。结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中TNF-α的蛋白水平表达较对照组显著增加(p<0.01)；CpG ODN1826处理后的TNF-α的蛋白水平表达较未处理模型组降低(p<0.05)。

图9为Western blotting检测NF-κB p65的蛋白水平表达。结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中NF-κB p65的蛋白水平表达较对照组显著增加(p<0.01)；CpG ODN 1826处理后的NF-κB p65的蛋白水平表达较未处理模型组降低(p<0.05)。

图10为2型糖尿病大鼠模型SG中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4，GPX4)的蛋白表达变化。蛋白印迹结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中GPX4表达较对照组显著降低(p<0.01)；CpG ODN 1826处理后GPX4的表达较未处理模型组上调(p<0.01)。

图11为2型糖尿病大鼠模型SG中活性氧(ROS)含量变化。化学荧光法检测结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中ROS含量较对照组显著增加(p<0.001)；CpG ODN1826处理后ROS的含量较未处理模型组降低(p<0.001)。

图12为2型糖尿病大鼠模型SG中Fe

图13为2型糖尿病大鼠模型SG中、丙二醛(MDA)含量变化。化学荧光法检测结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中MDA含量较对照组显著增加(p<0.001)；CpG ODN 1826处理后MDA的含量较未处理模型组降低(p<0.001)。

图14为2型糖尿病大鼠模型SG中还原性谷胱甘肽(GSH)含量变化。微板法检测结果显示糖尿病模型组(DM)大鼠SG中GSH含量较对照组显著降低(p<0.01)；CpG ODN 1826处理后GSH的含量较未处理模型组上调(p<0.01)。

图15为CpG 1826对II型糖尿病大鼠线粒体形态的影响。其中，a为对照组，b为糖尿病组，c为糖尿病模型加CpGODN1826处理组，d为糖尿病模型加CpGODN对照处理组。透射电镜分析显示与对照组相比，糖尿病大鼠线粒体体积缩小，膜密度增加，线粒体嵴减少，线粒体外膜破裂。CpG ODN 1826处理改善了糖尿病大鼠异常的线粒体结构变化。线粒体(箭头示)。标尺：2μm。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病心脏自主神经疾病治疗的口服或注射的CPG-ODN制剂。

用本技术领域公知的方法，制成适用于交感神经损伤相关疾病治疗的口服或注射的CPG-ODN制剂。

CpG寡聚脱氧核苷酸在制备用于上述疾病防治的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物中的应用。

为了更好地理解本发明的实质，下面以CPG-ODN 1826抑制颈交感神经节卫星胶质细胞激活、减少炎性细胞因子表达、降低嘌呤2Y(P2Y)12受体表达、改善脂质过氧化损伤诱导神经细胞铁死亡病理变化，进而缓解糖尿病心脏自主神经疾病的作用为实施例，说明CPG-ODN对糖尿病心脏自主神经疾病、防治交感神经损伤相关疾病作用的用途。

一、材料和方法

1.II型糖尿病模型制作和分组

健康成年SD雄性大鼠，大鼠常规分笼喂养，饲养环境安静，通风良好，室温20-25℃，相对湿度40％-60％，昼夜明暗交替12h/12h，自由饮水，隔日更换笼具和垫料。本实验选取雄性SD大鼠(清洁级)，常规饲料喂养，自由饮水，室温条件下饲养一周后将其随机分为正常对照组、II型糖尿病模型组(糖尿病组)。对照组自始至终给予常规饲料喂养，模型组给予高糖高脂饲料(含77.8％标准大鼠饲料、10％猪油、10％蔗糖、2％胆固醇和0.2％胆酸钠)喂养4周。

第五周末，2型糖尿病(T2DM)模型通过腹腔注射低剂量(30mg/kg)链脲佐菌素(STZ，7.5mg/mL，新鲜溶解于0.1M pH 4.4柠檬酸缓冲液中)。同时，给予对照组大鼠腹腔注射相同剂量的上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。给予链脲佐菌素(STZ)一周后(第六周末)，于大鼠尾端静脉采血测空腹血糖水平>7.8mM或餐后血糖水平>11.1mM的大鼠为成功建立了II型糖尿病模型。

成功建模后，将大鼠分为四组：对照组、2型糖尿病(T2DM)模型组、2型糖尿病(T2DM)模型加CpG ODN 1826处理组、2型糖尿病(T2DM)模型大加CpG ODN对照处理组。2型糖尿病(T2DM)模型大鼠腹腔注射CpG ODN 1826或CpG ODN对照(200μg/kg体重)。将CpG ODN1826和CpG ODN对照溶解在无菌水中。在整个实验过程中，对照组大鼠喂食标准实验室食物。糖尿病组大鼠继续给予高糖高脂饲料喂养。在第7周末(每日治疗后1周)，所有动物通过腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，并在禁食8-10小时后实施安乐死。然后，采集星状神经节和全血样本进行分析。

2.血压、心率变异性和交感神经放电的测量

使用无创尾袖法测量血压和心率(Softron BP-98A，Softron Co.，Tokyo，Japan)。将传感器置于大鼠尾部，通过袖带充气和放气获得血压。利用基于心电图(ECG)记录数据的频域方法分析心率变异性(HRV)。从5分钟的短期记录中计算出整个频谱频率范围(总功率频率，TP，0-0.5Hz)和极低频(VLF，0.003-0.04Hz)、低频(LF，0.04-0.15Hz)以及高频(HF，0.15-0.40Hz)中RR间隔(两个R波间距离)变化的功率。使用RM6240生物信号分析系统(中国成都仪器厂)记录并分析SG的节后颈交感神经放电(SND)。简而言之，在用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉大鼠后，分离左颈交感神经，并轻轻地将其置于双极金丝电极上。用浸有石蜡油的无菌棉将神经电极接头与周围组织电隔离。使用RM-6240B多通道生理信号采集与处理系统(中国成都仪器厂)记录并整合输出。将参比电极连接到皮肤皱褶上。

3.定量实时聚合酶链反应(实时PCR)

使用EastepTM总RNA提取试剂盒(Promega Biotech Co.，Ltd.，中国北京)从SGs中提取总RNA。使用逆转录系统试剂盒(Promega Biotech Co.，Ltd.，中国北京)合成cDNA模板。所用引物由上海三工生物有限公司设计合成，β-肌动蛋白正向5’-tgtcacaactgggacgata-3’和反向5’-ggggtgttgaagtcaaa-3’；P2Y12的正向5'-CTTCGTCCCTTCCATTTG-3'和反向5'-AGGTGCTCTCTTCACGTA-3'；IL-1β的正向5'-CCTATGTTGCCCGTGGAG-3'和反向5'-CACACTACTAGCGGTCGTCA-3'；TNF-α的正向5′-CACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′和反向5′-GTTGGTTGTCTTTGAGATCCAT-3′。使用

4.蛋白质印迹

收获的SG在带有RIPA裂解缓冲液的均质器中进行均质(中国北京Applygen)。将匀浆置于冰浴中20分钟，然后在4℃下以12000rpm离心10分钟。使用BCA蛋白质定量试剂盒(中国武汉博士德)测定上清液中的总蛋白质浓度。含有等量蛋白质(20μg)的样品用10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后电泳转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下，用含0.05％吐温20(TBST)的25mM Tris缓冲盐水(pH 7.2)中的5％脱脂干奶封闭膜2小时，然后用一级抗体培养：兔单克隆P2Y12抗体(1:1000，Abcam，Cambridge，MA，USA)，兔抗白介素1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(1:800，Abcam，Cambridge，MA，USA)、兔抗谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)(1:500,Affinity,Cincinnati,OH,USA)、β-肌动蛋白(1:1000，ZSGB-BIO，Beijing，China)、兔抗核转录因子-κB(NF-κB)p65(1:500，Abcam-，Cambriding，MA and USA)在4℃下过夜。随后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶结合的二级抗体(山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，1:2000，ZSGB-BIO，中国北京)孵育1小时。使用Image Pro Plus软件分析所得化学发光带的强度。

5、双标记免疫荧光

对于双标记免疫荧光染色，用冷冻切片机将冷冻SG切片至8μm厚。用PBS清洗切片，并在室温下在PBS中含有3％牛血清白蛋白和0.3％Triton X-100的封闭溶液中培养2小时。组织与一级抗体兔抗P2Y12(1:100，以色列耶路撒冷Alomone实验室)、小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(1:100；Millipore)。随后，在室温下用二级抗体(山羊抗兔TRITC和山羊抗小鼠FITC，ZSGB Bio，中国北京。Alexa Fluor○R488结合山羊抗兔和Cy5结合山羊抗鼠，Abcam，Cambridge，MA，USA)在PBS中稀释至1:200浓度。核染色采用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)。所有图像都是在荧光显微镜下拍摄的(日本东京奥林巴斯)，并由单盲观察。

6、铁含量、脂质过氧化和抗氧化活性水平的测定

丙二醛(MDA)被认为是脂质过氧化的标志物。抗脂质过氧化的主要内源性抗氧化剂是GPX4，它被认为是铁积累诱导的活性氧链反应的关键调节因子。GPX4的功能活性取决于合成GSH。铁、丙二醛、谷胱甘肽水平由化验试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)根据制造商的说明使用化学比色法测定。GPX4水平通过ELISA试剂盒(中国南京卡米洛生物工程有限公司)采用双抗体夹心技术测定。在冰浴中制备组织匀浆，然后以2500rpm离心10min。取上清液进行以下测试。采用化学荧光法通过检测试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)测定活性氧水平。取新鲜组织，用酶消化法制备单细胞悬液进行检测。操作步骤严格按照说明书执行。使用多功能微孔板阅读器检测各组在相应波长条件下的吸光度值。根据手册中的相应公式计算结果。

7、透射电子显微镜。

新鲜DRG组织被切成1mm

8、统计分析

使用SPSS 21.0软件(SPSS，Chicago,IL,USA)对数据进行分析，并使用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni’s post hoc检验确定统计显著性，以进行多重比较。p<0.05具有统计学意义。

二、结果

(一)CpG ODN 1826对II型糖尿病大鼠血压、心率和颈交感神经活动的影响

表1糖尿病组的血压和心率高于对照组，但用CpG ODN 1826后显著下降。交感神经放电(SND)活动如图1所示。糖尿病大鼠的SND明显高于对照组大鼠(p<0.001，图1A，B)，这表明2型糖尿病患者颈交感神经的兴奋性增加。然而，CpG ODN 1826处理后可显著改善糖尿病大鼠异常的颈部SND(p<0.001，图1B)。DM+CpG ODN对照组与糖尿病(DM)组之间无显著差异(p>0.05，图1B)。这些结果表明，CpG ODN1826处理能有效降低糖尿病大鼠颈部SND的激活水平。

表1CpG ODN 1826对2型糖尿病(T2DM)大鼠心率(HR)和血压(BP)的影响

*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001与对照组相比；###p<0.001与糖尿病组相比。

(二)CpG ODN 1826对II型糖尿病大鼠心率变异性的影响

心率变异性(HRV)报告如表2所示。与对照组相比，II型糖尿病组的TP、VLF、LF和HF等频域变量显著降低，表明交感神经和副交感神经张力均降低。此外，随着LF/HF比率显著增加，糖尿病大鼠的交感神经和副交感神经张力之间存在不平衡。然而，与糖尿病大鼠相比，CpG ODN 1826处理大鼠的TP、VLF、LF和HF显著增加(p<0.01)。此外，CpG治疗显著提高了DM组的LF/HF比率(p<0.001)。DM+CpG ODN对照组与DM组之间无显著差异。这些数据表明，CpG ODN 1826改善了糖尿病大鼠的自主神经失衡。

表2.CpG ODN 1826对2型糖尿病大鼠心率变异性的影响

*p<0.05和**p<0.01与对照组相比；#p<0.05和##p<0.01与糖尿病组相比。

(三)CpG ODN 1826对星状神经节中P2Y12表达的影响

糖尿病大鼠星状神经节P2Y12受体在mRNA水平的表达明显高于对照大鼠(p<0.001；图2)。与未经处理的DM组相比，CpG ODN 1826处理显著降低了P2Y12受体的mRNA表达水平(p<0.01；图2)。

糖尿病大鼠星状神经节P2Y12受体在蛋白水平的表达明显高于对照大鼠(p<0.01；图3)。与未经处理的DM组相比，CpG ODN 1826处理显著降低了P2Y12受体的蛋白表达水平(p<0.01；图3)。

如图4所示，在双重免疫荧光分析中，糖尿病大鼠星状神经节(SG)中P2Y12和GFAP的共同表达水平较高。CpG ODN 1826处理显著降低了共表达水平。GFAP是卫星胶质细胞(SGCs)的标志物。GFAP的上调揭示了SGC的激活。这些数据表明，P2Y12受体和GFAP共同定位于SG的SGC中。P2Y12受体可能参与了SGC的激活。CpG ODN 1826可能通过降低P2Y12受体的表达来抑制伤害性信号的传递和SGC的激活。

(四)CpG ODN 1826对星状神经节中IL-1β和TNF-α表达的影响

活化的卫星胶质细胞导致促炎因子的增加。定量RT-PCR检测IL-1β的mRNA表达。与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠IL-1β在mRNA的表达显著增加(p<0.001；图5)。然而，CpG ODN1826处理显著降低了IL-1β的mRNA高表达(p<0.01；图5)。DM组和DM+CpG ODN对照组之间没有显著差异。Western blotting检测IL-1β的蛋白表达。与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠IL-1β蛋白水平上的表达显著增加(p<0.011；图6)。然而，CpG ODN 1826处理显著降低了IL-1β蛋白的上调表达(p<0.05；图6)。DM组和DM+CpG ODN对照组之间没有显著差异。CpG ODN1826处理通过抑制促炎细胞因子IL-1β发挥保护作用。

定量RT-PCR检测TNF-α的mRNA表达。与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠IL-1β在mRNA的表达显著增加(p<0.001；图7)。然而，CpG ODN 1826处理显著降低了TNF-α的mRNA高表达(p<0.001；图7)。DM组和DM+CpG ODN对照组之间没有显著差异。Western blotting检测TNF-α的蛋白表达。与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠TNF-α在蛋白水平上的表达显著增加(p<0.01；图8)。然而，CpG ODN 1826处理显著降低了TNF-α蛋白的上调表达(p<0.05；图8)。DM组和DM+CpG ODN对照组之间没有显著差异。CpG ODN 1826处理通过抑制促炎细胞因子TNF-α发挥保护作用。

(五)CpG ODN 1826对II型糖尿病大鼠NF-κB p65表达的影响

核因子-κB信号通路将代谢与炎症结合起来。实验结果表明，糖尿病大鼠的NF-κBp65蛋白水平显著高于对照大鼠(p<0.01；图9)。然而，用CpG ODN 1826后，糖尿病大鼠的NF-κB p65表达显著降低(p<0.05；图9)。DM组与DM+CpG ODN对照组之间无显著差异。

(六)CpG ODN 1826对II型糖尿病大鼠谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)表达的影响

谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)的主要作用是将细胞内过多的ROS还原成为无毒的化合物，抑制GPX4可导致ROS的积累和脂质过氧化物的产生导致组织细胞铁死亡。实验结果表明，糖尿病大鼠的GPX4蛋白水平显著低于对照大鼠(p<0.01；图10)。然而，用CpG ODN ODN1826后，糖尿病大鼠的GPX4表达显著增加(p<0.01；图10)。DM组与DM+CpG ODN对照组之间无显著差异。

(七)CpG ODN 1826对II型糖尿病大鼠铁含量、脂质氧化和抗氧化活性的影响

与对照组相比，DM组的活性氧水平显著升高(p<0.001；图11)。给予CpG ODN1826后，糖尿病大鼠体内活性氧水平的降低(p<0.001；图11)。

与对照组相比，DM组的铁水平显著升高(p<0.01；图12)。给予CpG ODN 1826后，糖尿病大鼠体内铁水平的降低(p<0.01；图12)。

与对照组相比，DM组的丙二醛水平显著升高(p<0.001；图13)。给予CpG ODN1826后，糖尿病大鼠体内丙二醛水平的降低(p<0.001；图13)。

此外，与对照组相比，DM组谷胱甘肽(GSH)水平显著降低(p<0.01；图14)，CpG1826处理后显著升高(p<0.01；图14)。

CpG ODN 1826处理改善了糖尿病大鼠铁含量、脂质氧化和抗氧化活性的病理变化。

(八)CpG 1826对II型糖尿病大鼠线粒体形态的影响

图15透射电镜分析显示各组星状神经节线粒体的形态学改变。与对照组相比，糖尿病大鼠线粒体体积缩小，膜密度增加，线粒体嵴减少，线粒体外膜破裂。CpG ODN1826处理改善了这些异常的线粒体结构变化。

发明人研究发现是，CpG ODN 1826通过减弱糖尿病变增强的交感神经活性，维持自主神经系统的平衡，并在2型糖尿病心脏自主神经病变中发挥积极的保护作用。其机制可能涉及通过降低NF-kB表达来调节星状交感神经节卫星胶质细胞(SGC)中P2Y12受体，SGC的激活可释放大量的炎症因子，使神经元-胶质细胞间信息交流异常。CpG ODN 1826抑制P2Y12受体，降低SGC的激活和炎症细胞因子的表达，从而改善心脏自主神经功能。此外，CpGODN 1826处理通过减少脂质过氧化损伤来减轻星状交感神经节神经细胞的铁死亡。CpGODN 1826的以上作用可作为CpG ODN对糖尿病心脏自主神经疾病、交感神经损伤相关疾病防治作用的实施例。