青藤碱对糖尿病大鼠颈上交感神经节P2X2/3受体介导心脏自主神经病变中作用的研究

摘要

研究背景和目的:
　　糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的主要特征之一就是血糖的升高,动物体体内的血糖的长时间保持在一个过高的状态,随着对机体损害的增加毫无疑问将会造成机体组织的代谢紊乱。糖尿病会导致众多并发症,随着每年糖尿病患者的增多,我们发现糖尿病心脏自主神经病变(Diabetic cardiac autonomic neuropathy,DCAN)已经成为糖尿病的众多并发症中最常见的之一,严重时可导致危及生命的其它高危险性疾病如心肌梗死、心源性猝死等。三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)等存在于胞外的核苷酸特异识别P2受体,具有重要对神经信息进行传递的用途。P2受体分为配体门控型离子通道型受体(P2X受体)和G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。ATP及与它发生相互作用的P2X受体被认为参与颈上交感神经节的心交感信息的传递过程。本研究旨在了解青藤碱对高糖高脂条件下颈上交感神经节P2X2和P2X3受体介导病理生理作用的影响。
　　方法:1、同源建模及分子对接实验:同源建模构建 P2X2、P2X3(P2X2/3)受体的三维结构模型,通过分子对接方法筛选出与其对接自由能降低比较大的小分子药物。2、动物实验:采用2型糖尿病大鼠模型进行实验,本实验大鼠随机分为:对照组(Ctrl)和糖尿病模型组(DM);第七周成功构建2型糖尿病大鼠模型后将糖尿病模型组(DM)随机分为:糖尿病模型+生理盐水对照组(DM+NS),糖尿病模型+青藤碱处理组(DM+SIN)(40 mg/kg),对照组(Ctrl)用注射生理盐水形成生理盐水对照组(Ctrl+NS)。实验内容:(1)在实验过程中测量各组大鼠空腹血糖和餐后血糖的变化。(2)测量各组大鼠的心率、血压及心率变异性指标。(3)免疫组化技术被用来直观地检测交感神经节P2X2受体和P2X3受体的表达情况,蛋白印迹等实验方法可定量检测实验大鼠颈上交感神经节P2X2受体和P2X3受体的含量变化。(4)运用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法半定量观察分析各组大鼠颈上交感神经节P2X2受体和P2X3受体mRNA的含量变化。(5)进一步使用全细胞膜片钳技术来研究青藤碱对颈上交感神经节神经元上的ATP激活电流的影响。
　　结果:1、同源建模及分子对接实验结果:(1)同源建模获得P2X2、P2X3的模型,通过Procheck检验90％以上的氨基酸位于允许区内,而且ATP结合口袋中的氨基酸残基未出现在不允许区内;(2)通过分子对接筛选出青藤碱与P2X2、P2X3对接后体系的自由能降低较大,其绝对值接近受体与已知激动剂结合的自由能变化,显示青藤碱与P2X2、P2X3可能有很强的相互作用。2、动物实验结果:(1)分析整理模型组大鼠的空腹血糖的数据表现出糖尿病的诊断标准,同时餐后血糖也发现和糖尿病诊断水平相当,同时测定的 Ctrl组大鼠的空腹血糖和餐后血糖经过比较分析认为处于正常范围,表明2型糖尿病造模成功。给予青藤碱处理后,DM+SIN组的空腹血糖和餐后血糖显著降低,与 DM+NS组相比有显著性差异(p<0.01),但是该组数据进一步和Ctrl+NS组比较发现其差异没有统计学意义(p>0.05)。(2)糖尿病模型大鼠心率加快、血压升高,DM+SIN组的心率、血压和糖尿病模型组相比更低(p<0.05),但是实验数据进一步和Ctrl+NS组比较分析可以发现其差异没有统计学意义(p>0.05)。糖尿病模型组大鼠血压通过心率变异性分析获得的低频/高频的数值( Low frequency/High frequency,LF/HF)都显著得高于正常组(P<0.01),极低频成分(Very low frequency,VLF)、LF、HF和总的频域值(Total Power,TP)则明显低于正常组;DM+SIN组血压与糖尿病模型组相比以上异常变化则得到明显的改善(p<0.01)。(3)免疫组化和蛋白印迹结果表明,DM+NS组颈上交感神经节P2X2受体和 P2X3受体的表达较 Ctrl+NS组明显升高,有统计学意义(p<0.01), DM+SIN和DM+NS组相比较表现出明显的降低,有统计学意义(p<0.01)。(4) RT-PCR结果表明,DM+NS组交感神经节P2X2受体和P2X3受体mRNA的表达较Ctrl+NS组明显升高,有统计学意义(p<0.01),DM+SIN组的表达和DM+NS组的表达相比较出现显著的降低,计算结果具有统计学意义(p<0.01)。(5)全细胞膜片钳实验结果表明:青藤碱可明显抑制 ATP在颈上交感神经节神经元的激活电流。
　　结论:青藤碱对大鼠颈上交感神经节P2X2/3受体介导的心脏自主神经病变信号传递具有抑制作用。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 实验方法与材料

2.1同源建模简介

2.2 同源建模获得目标蛋白结构文件

2.3 分子对接简介

2.4 分子对接方法预测药物作用

2.5动物实验材料

2.6 动物实验方法

第3章 结果

3.1 同源建模结果

3.2 分子对接结果

3.3 血糖结果

3.4 血压、心率及心率变异性的变化

3.5 RT-PCR结果

3.6 免疫组化

3.7 蛋白印迹

3.8全细胞膜片钳实验结果

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述P2X受体与激动剂三磷酸腺苷作用的结构解析

1 P2X受体的分子结构和功能

2 P2X受体的晶体结构

3 配体结合位点

4 结语与展望

参考文献：