一种定量检测血清中抗人白介素4受体α单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法

摘要

本申请涉及一种抗体；它的重链、轻链；相应的可变域以及相应的互补决定域；以及在间接ELISA分析中使用该抗体作为二抗所建立的酶联免疫分析方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种定量检测血清中抗人白介素4受体α单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法。

背景技术

人白介素4受体α(人IL-4Rα，或hIL-4Rα)亚单位是一种高亲和力结合IL-4的140kD的I型跨膜蛋白，IL-4与之结合后募集共同γ链(IL-2等多种细胞因子的共同受体亚单位)组成IL-4的I型受体，或者募集IL-13Rα1组成IL-4的II型受体(该受体可与IL-13结合介导其生物学效应)，从而进行信号的转导，因而IL-4Rα可以介导IL-4、IL-13的生物学活性。体外研究表明，IL-4和IL-13通过I/II型受体激活多种细胞(诸如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、气道平滑肌细胞、呼吸道上皮细胞、肺成纤维细胞和内皮细胞等)的效应功能。抗人白介素4受体α单克隆抗体为特异性结合人白介素4受体α(hIL-4Rα)的IgG4型人源化单克隆抗体；其亲本抗体由经人白介素4受体α免疫的新西兰兔B细胞筛选获得，亲本兔抗体经人源化改造后得到抗人白介素4受体α单克隆抗体。

本申请中待检测的抗人白介素4受体α单克隆抗体是江苏荃信生物医药股份有限公司的QX005N，该抗人白介素4受体α单克隆抗体在中国专利文献CN 110746507 B中有所描述。具体来说，IL-4Rα可以介导IL-4、IL-13的生物学活性。IL-4是促使初始Th细胞(辅助性T细胞)分化发育为Th2的关键细胞因子，其可以促进B细胞表达CD23、MHC II(主要组织相容性复合物)、细胞活化和IgE的分泌，并可促进上调B细胞、肥大细胞等表达IgE受体，增强其反应性，同时它能够促进血管内皮细胞释放血管细胞粘附分子1(VCAM-1)进而诱使T细胞、单核细胞、嗜酸/碱性粒细胞向炎症部位的转移。Th-2细胞因子过表达可引起特应性皮炎的事实已在转基因小鼠模型中得到证实。目前，IL-4Rα相关抗体药物已经被批准上市，有Dupilumab(IL-4Rα靶向抗体，DUP)用于治疗特异性皮炎、哮喘、慢性鼻窦炎伴鼻息肉。江苏荃信生物医药股份有限公司开发了商品代号为QX005N的抗IL-4Rα单克隆抗体作为药物使用。

对于药物而言，药物代谢动力学是应用动力学的原理与数学处理的方法，定量描述药物在体内动态变化的规律，研究以不同途径进入人体的药物，其吸收、分布、代谢、排泄的过程。因此药代动力学的研究将有利于药物安全性和有效性的评价。生物样品常用的分析方法包括色谱法和免疫法。色谱法灵敏度较低，试验过程繁琐，且回收率不稳定。免疫法是以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法，是当前非临床和临床生物样品检测方法中最为常用的一种。由于抗人IL-4Rα单克隆抗体属于蛋白大分子，适合使用酶联免疫分析方法进行测定，而且兔抗抗人IL-4Rα单克隆抗体体作为第二抗体与酶标检测抗体的结合使用，减少血清中无关蛋白的干扰。

间接ELISA是指先将抗原结合到ELISA板上，然后加入待检测抗体与抗原特异性结合，接着加入特异性抗抗体，最后加入酶标检测抗体并利用底物发生显色反应。这样，待测抗体与二抗的特异性结合，结合了酶标检测抗体与与二抗的结合，不仅起到了多级放大作用，而且提供了更大的灵活性，也需要更少的标记抗体，更经济。达到检测未知抗体分子的目的，具有高灵敏度、高特异性和稳定性等优点。

发明内容

基于以上原因，亟待开发一种特异性强、灵敏度高的基于酶联免疫分析法的定量测定血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的方法。

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包含3个互补决定区CDR区，它们的氨基酸序列为：

重链互补决定区HCDR1区：SEQ ID NO:1：SAYMS；

重链互补决定区HCDR2区：SEQ ID NO:2：IIYPSRSTYYASWVKG；

重链互补决定区HCDR3区：SEQ ID NO:3：GSVNNDDSSWDI；

轻链互补决定区LCDR1区：SEQ ID NO:4：QASQRISNYLS；

轻链互补决定区LCDR2区：SEQ ID NO:5：AANLAS；

轻链互补决定区LCDR3区：SEQ ID NO:6：QSNYDSASSNYGA。

2.根据项1所述的单克隆抗体，所述抗体包括重链和轻链，其特征在于，所述重链和轻链分别包括一个可变域CVR区，它们的氨基酸序列为：

重链可变域HCVR区：SEQ ID NO:7：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSAYMSWVRQAPGKGLEYIGIIY

PSRSTYYASWVKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGSVNNDDS SWDIWGPGTLVTVSL；

轻链可变域LCVR区：SEQ ID NO:8：

AEVVMTQTPASVEAAVGGTVTINCQASQRISNYLSWYQQKPGQPPKLLI

YYAANLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCQSNYDSASSN YGAFGGGTGVVVK。

3.根据项2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括重链和轻链，它们的氨基酸序列为：

重链的氨基酸序列：SEQ ID NO:9：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSAYMSWVRQAPGKGLEYIGIIY

PSRSTYYASWVKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGSVNNDDS

SWDIWGPGTLVTVSLGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPE

PVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHP

ATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQ

DWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSR

SVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK；

轻链的氨基酸序列：SEQ ID NO:10：

AEVVMTQTPASVEAAVGGTVTINCQASQRISNYLSWYQQKPGQPPKLLI

YYAANLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCQSNYDSASSN

YGAFGGGTGVVVKGDPVAPTVLIFPPSADLVATGTVTIVCVANKYFPDV

TVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC。

4.一种用于检测抗人IL-4Rα单克隆抗体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：抗原和第二抗体；

其中，抗原是IL-4Rα且被固定在酶联板上；而所述第二抗体是根据权利要求3所述的单克隆抗体。

5.根据项4所述的试剂盒，其特征在于，所述待检测的抗人IL-4Rα单克隆抗体是QX005N；

所述QX005N的LCDR1具有SEQ ID NO:11(RASESVYKNNRLS)的氨基酸序列，

所述QX005N的LCDR2具有SEQ ID NO:12(EASKVAS)的氨基酸序列，

所述QX005N的LCDR3具有SEQ ID NO:13(AGAYRGNIYP)的氨基酸序列，

所述QX005N的HCDR1具有SEQ ID NO:14(TNSMS)的氨基酸序列，

所述QX005N的HCDR2具有SEQ ID NO:15(IIGSSGYMDYASWAKG)的氨基酸序列，

所述QX005N的HCDR3具有SEQ ID NO:16(HGDSSSFAL)的氨基酸序列。

6.根据项4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG检测抗体；洗液、底物显色液、终止液；

用来制作标准曲线的、已知含量的抗人IL-4Rα单克隆抗体标准品以及相应的稀释液。

7.根据项6所述的试剂盒，其特征在于，

所述洗液是PBS溶液与吐温20的混合液(V/V:100/0.05)，所述显色液是TMB显色液，所述终止液是纯化水与磷酸的混合液(V/V:4/1)。

8.根据项7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是间接酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。

9.使用根据项8所述的试剂盒依照间接ELISA法对抗人IL-4Rα单克隆抗体进行含量测定的方法。

10.如项9所述的单克隆抗体含量测定方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

-使用人IL-4Rα作为抗原包被酶联板；用洗液洗板；

-使已知浓度的抗人IL-4Rα单克隆抗体标准品用所述稀释液稀释为稀释列并与包被抗原反应；温育；用洗液洗板；

-加入项3所述的单克隆抗体作为第二抗体；用洗液洗板；

-依次加入酶标检测抗体；底物显色液；终止液；

-测定由上述得到的反应液在特定波长下的吸光值，制成标准曲线；

并且：

-使用人IL-4Rα作为抗原包被酶联板；用洗液洗板；

-使待测抗人IL-4Rα单克隆抗体样品与包被抗原反应；温育；用洗液洗板；

-加入根据项3所述的单克隆抗体作为第二抗体；用洗液洗板；

-依次加入酶标检测抗体；底物显色液；终止液；

-测定由上述得到的反应液在特定波长下的吸光值，由上面步骤得到的标准曲线计算待测抗人IL-4Rα单克隆抗体样品的浓度。

11.如项10所述的单克隆抗体含量测定方法，其特征在于，所述单克隆抗体样品与抗原反应时温育的条件为：室温下约110rpm、2h左右置于摇床。

12.如项10所述的单克隆抗体含量测定方法，其特征在于，所使用的洗液、显色液和终止液分别是：PBS溶液与吐温20的混合液(V/V:100/0.05)、TMB显色液、纯化水与磷酸的混合液(V/V:4/1)；而所述特定波长是450nm。

13.如项10所述的单克隆抗体含量测定方法，其特征在于，加入检测抗体、底物后的显色条件是：室温下约110rpm避光置于摇床。

14.如项9至13的任一项所述的单克隆抗体含量测定方法，其特征在于，所述待检测的抗人IL-4Rα单克隆抗体是QX005N；

所述QX005N的LCDR1具有SEQ ID NO:11(RASESVYKNNRLS)的氨基酸序列，

所述QX005N的LCDR2具有SEQ ID NO:12(EASKVAS)的氨基酸序列，

所述QX005N的LCDR3具有SEQ ID NO:13(AGAYRGNIYP)的氨基酸序列，

所述QX005N的HCDR1具有SEQ ID NO:14(TNSMS)的氨基酸序列，

所述QX005N的HCDR2具有SEQ ID NO:15(IIGSSGYMDYASWAKG)的氨基酸序列，

所述QX005N的HCDR3具有SEQ ID NO:16(HGDSSSFAL)的氨基酸序列。

发明的技术效果

采用本申请的技术方案，得到了下述有益效果：首先，以兔抗抗人IL-4Rα单克隆抗体为第二抗体，建立了定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法；第二，本申请所建立的方法有效定量范围很宽，为50～2500ng/ml，对抗人IL-4Rα单克隆抗体的定量下限为50ng/ml，灵敏度高；第三，本发明所建立的方法重复性好，板间重复实验变异系数为4.7％～15.0％，小于20％；第四，本发明所建立的方法个体选择性好，10/10个个体满足在定量下限的浓度水平上准确度和精密度符合接受范围；第五，本发明可用于检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量，可用于临床评价抗人IL-4Rα单克隆抗体的药代动力学特征，从而评估其安全性和有效性。

附图说明

图1为本发明中酶联免疫分析方法的示意图；

图2为方法标准曲线四参数拟合曲线图。

具体实施方案

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方案，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本申请在第一方面涉及一种抗体。

在一个具体的实施方案中，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包含3个互补决定区CDR区，它们的氨基酸序列为：

重链互补决定区HCDR1区：SEQ ID NO:1：SAYMS；

重链互补决定区HCDR2区：SEQ ID NO:2：IIYPSRSTYYASWVKG；

重链互补决定区HCDR3区：SEQ ID NO:3：GSVNNDDSSWDI；

轻链互补决定区LCDR1区：SEQ ID NO:4：QASQRISNYLS；

轻链互补决定区LCDR2区：SEQ ID NO:5：AANLAS；

轻链互补决定区LCDR3区：SEQ ID NO:6：QSNYDSASSNYGA。

在本说明书的上下文中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，术语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。单克隆抗体在结构上包括有重链和轻链。

在本说明书的上下文中，CDR为complement determine region(互补决定区)的缩写，也称“超变区”。LCDR为轻链超变区的缩写，HCDR为重链超变区的缩写。一般地，抗体的重链和轻链均具有3个CDR，它们共同组成Ig的抗原结合部位(antigen-binding site)。在该部位，抗体在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补。在下文中，在分析技术中使用本申请要求保护的单克隆抗体作为“二抗”或“抗抗体”与抗人IL-4Rα单克隆抗体发生特异性结合，即是依赖此处限定的CDR区对抗人IL-4Rα单克隆抗体上特定抗原决定簇的特异结合能力。

在又一具体实施方案中，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链和轻链，其中，所述重链和轻链分别包括一个可变域CVR区，它们的氨基酸序列为：

重链可变域HCVR区：SEQ ID NO:7：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSAYMSWVRQAPGKGLEYIGIIY

PSRSTYYASWVKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGSVNNDDS SWDIWGPGTLVTVSL；

轻链可变域LCVR区：SEQ ID NO:8：

AEVVMTQTPASVEAAVGGTVTINCQASQRISNYLSWYQQKPGQPPKLLI

YYAANLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCQSNYDSASSN YGAFGGGTGVVVK。

在本说明书的上下文中，CVR是“可变域”的英文缩写，该定义是相对“恒定域”而言。重链和轻链的可变域都包括三个上述“互补决定区”。

在再一具体实施方案中，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链和轻链，它们的氨基酸序列为：

重链：SEQ ID NO:9：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSAYMSWVRQAPGKGLEYIGIIYPSRSTYYASWVKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGSVNNDDSSWDIWGPGTLVTVSLGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK；

轻链：SEQ ID NO:10：

AEVVMTQTPASVEAAVGGTVTINCQASQRISNYLSWYQQKPGQPPKLLI

YYAANLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCQSNYDSASSN

YGAFGGGTGVVVKGDPVAPTVLIFPPSADLVATGTVTIVCVANKYFPDV

TVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC。

本申请在第二方面涉及一种试剂盒。

在一个具体实施方案中，提供了一种用于检测抗人IL-4Rα单克隆抗体的试剂盒，其中，该试剂盒包括：抗原和第二抗体；

其中，抗原是IL-4Rα且被固定在酶联板上；而所述第二抗体是前述兔抗抗人IL-4Rα单克隆抗体。

在又一具体实施方案中，提供了一种试剂盒，其中，所述待检测的抗人IL-4Rα单克隆抗体是QX005N；所述QX005N的LCDR1具有SEQ ID NO:11(RASESVYKNNRLS)的氨基酸序列，

LCDR2具有SEQ ID NO:12(EASKVAS)的氨基酸序列，

LCDR3具有SEQ ID NO:13(AGAYRGNIYP)的氨基酸序列，

HCDR1具有SEQ ID NO:14(TNSMS)的氨基酸序列，

HCDR2具有SEQ ID NO:15(IIGSSGYMDYASWAKG)的氨基酸序列，HCDR3具有SEQ IDNO:16(HGDSSSFAL)的氨基酸序列。

在本说明书的上下文中，人白介素4受体α(Human Interleukin-4receptorsubunit alpha，hIL-4Rα)表示一种源自人的膜蛋白。IL-4Rα是一种高亲和力结合IL-4的I型跨膜蛋白，可以介导IL-4、IL-13的生物学活性。IL-4/IL13通路能够引起细胞因子诱导反应，包括促炎细胞因子、趋化因子和IgE的释放，并在特应性皮炎和哮喘等自身免疫性疾病的病理生理过程中起重要作用。本申请的单克隆抗体是特异性识别IL-4Rα的中和性抗体，其能够与IL-4Rα特异性结合。

在本说明书的上下文中，“抗人IL-4Rα单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人IL-4Rα，使得所述单克隆抗体可用于鉴定/检测人IL-4Rα，也可以作为抗体药物使用，例如作为治疗自身免疫性疾病的药物使用。因此，在下文用本申请的试剂盒建立的间接ELISA方法可以作为此类抗体药物的药代动力学研究的分析手段来使用。

在又一具体实施方案中提供了一种试剂盒，其中，该试剂盒还包括：

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体；

洗液、底物显色液、终止液；

用来制作标准曲线的、已知含量的抗人IL-4Rα单克隆抗体标准品以及相应的稀释液。

在本说明书的上下文中，“标准曲线”是指待测样品的含量与分析方法的可测量量(例如吸光度值)之间的线性关系，以借助其实现对待测样品的定量分析。

在再一具体实施方案中，提供了一种试剂盒，其中，所述洗液是PBS溶液与吐温20的混合液(V/V:100/0.05)，所述显色液是TMB显色液，所述终止液是纯化水与磷酸的混合液(V/V:4/1)。

在又一具体实施方案中，提供了一种试剂盒，其中，该试剂盒是间接酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。

本申请在第三方面涉及对单克隆抗体进行含量测定的方法。

在一个具体实施方案中，提供了：使用前述试剂盒依照间接ELISA法对抗人IL-4Rα单克隆抗体进行含量测定的方法。

在又一具体实施方案中，提供了：前述对抗人IL-4Rα单克隆抗体进行含量测定的方法，其中，该方法包括下述步骤：

-使用人IL-4Rα作为抗原包被酶联板；用洗液洗板；

-使已知浓度的抗人IL-4Rα单克隆抗体标准品用所述稀释液稀释为稀释列并与包被抗原反应；温育；用洗液洗板；

-加入前述兔抗抗人IL-4Rα单克隆抗体作为第二抗体；用洗液洗板；

-依次加入酶标检测抗体；底物显色液；终止液；

-测定由上述得到的反应液在特定波长下的吸光值，制成标准曲线；

并且：

-使用人IL-4Rα作为抗原包被酶联板；用洗液洗板；

-使待测抗人IL-4Rα单克隆抗体样品与包被抗原反应；温育；用洗液洗板；

-加入前述兔抗抗人IL-4Rα单克隆抗体作为第二抗体；用洗液洗板；

-依次加入酶标检测抗体；底物显色液；终止液；

-测定由上述得到的反应液在特定波长下的吸光值，由上面步骤得到的标准曲线计算待测抗人IL-4Rα单克隆抗体样品的浓度。

在再一具体实施方案中，提供了一种单克隆抗体含量测定方法，其中，所述单克隆抗体样品与抗原反应时温育的条件为：室温下约110rpm、2h左右置于摇床。

在又一具体实施方案中，提供了一种单克隆抗体含量测定方法，其中，所使用的洗液、显色液和终止液分别是PBS溶液与吐温20的混合(V/V:100/0.05)、TMB显色液、纯化水与磷酸的混合液(V/V:4/1)；而特定波长是450nm。

在再一具体实施方案中，提供了一种单克隆抗体含量测定方法，其中，加入检测抗体、底物后的显色条件是：室温下约110rpm避光置于摇床。

在一个具体实施方式中，提供了一种单克隆抗体含量测定方法，其中，所述检测的抗人IL-4Rα单克隆抗体是QX005N；所述QX005N的

LCDR1具有SEQ ID NO:11(RASESVYKNNRLS)的氨基酸序列，

LCDR2具有SEQ ID NO:12(EASKVAS)的氨基酸序列，

LCDR3具有SEQ ID NO:13(AGAYRGNIYP)的氨基酸序列，

HCDR1具有SEQ ID NO:14(TNSMS)的氨基酸序列，

HCDR2具有SEQ ID NO:15(IIGSSGYMDYASWAKG)的氨基酸序列，HCDR3具有SEQ IDNO:16(HGDSSSFAL)的氨基酸序列。

根据本申请所建立的间接ELISA方法可以参见图1。

<实施例>

下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1第二抗体的制备与纯化

用抗人IL-4Rα单克隆抗体(F(ab)

实施例2对由实施例1制成的单克隆抗体进行性能鉴定

1、结合活性鉴定

使用抗人IL-4Rα单克隆抗体和人IgG作为抗原包被酶联板；使系列稀释的实施例1中的单克隆抗体与包被抗原反应；依次加入显色抗体；底物显色液；终止液；进行结合活性实验。结果显示，该单克隆抗体与抗人IL-4Rα单克隆抗体有较好结合活性，且与同型IgG不发生交叉反应。

2、中和活性鉴定

使用人IL-4Rα作为抗原包被酶联板；将定量抗人IL-4Rα单克隆抗体和系列稀释的实施例1中的兔单克隆抗体的孵育物加入与包被抗原反应；依次加入显色抗体；底物显色液；终止液；进行中和活性实验。结果显示，该兔单克隆抗体不阻断抗人IL-4Rα单克隆抗体和其靶点人IL-4Rα的结合，因此不具备中和活性。

实施例3使用依实施例1制得的“二抗”构建Elisa试剂盒

抗原是人IL-4Rα且被固定在酶联板上；抗人IL-4Rα单克隆抗体可以与包被抗原结合；实施例1制得的“二抗”作为第二抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体作为检测抗体。

实验过程：

包被：人IL-4Rα用1×PBS稀释至0.5μg/ml，100μl/孔，2-8℃包被过夜；

封闭：200μl/孔封闭液，室温封闭2h；

加样：标准品和质控品加样前统一用稀释液进行MRD稀释50倍；100μl/孔，室温温育2h；

加二抗：用稀释液加实施例1制得的“二抗”稀释至10ng/ml，100μl/孔，室温避光孵育60min；

加检测抗体：用稀释液将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体稀释至20ng/ml，室温避光孵育1h；

显色：100μl/孔加入TMB显色液，室温避光20min；

终止及读数：100μl/孔加入终止液；在450nm处读取OD值(以650nm作为参考)

试剂信息：

1×PBS：23.48gPBS粉末溶解于2000ml超纯水中；

清洗液：每1000ml1×PBS加入500μl Tween 20；

稀释液/封闭液：称取2.5g BSA，用1×PBS 500ml使其溶解，加入250μlTween 20及250μl Proclin 300，充分混匀；

TMB显色液的配制：取等体积的A液和B液，冷却至室温后充分混匀即可使用，避光，现配现用；

终止液：100ml H

人混合血清：10个个体空白血清等体积混匀；

实施例4定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法的建立

1、定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法标准曲线的建立

将抗人IL-4Rα单克隆抗体用人混合血清稀释成39.06,78.13,156.25,312.5,625,1250,2500,5000ng/ml，在确定的最佳实验条件下进行酶联免疫分析实验。以检测抗人IL-4Rα单克隆抗体浓度为横坐标，OD450值为纵坐标绘制四参数曲线，如图2所示，发现抗人IL-4Rα单克隆抗体浓度在50～2500ng/ml范围内，曲线具有较好的回收率。

结果见下表1，表明本发明建立的酶联免疫分析方法的标曲浓度为39.06(锚定点),78.13,156.25,312.5,625,1250,2500(ULOQ),5000ng/ml(锚定点)。方法定量范围为50～2500ng/ml，39.06，5000ng/ml作为锚定点用于改善标曲的拟合(回收率不做要求)。所建立的标准曲线可以参见图2。

表1：方法标曲建立各浓度点回收率统计

注：*标记为锚定点，回收率不作要求

2、定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法的方法学研究

2.1定量范围

不同实验人员于不同天用建立的定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法评估6个独立批次的标准曲线。

结果如表2所示，除锚定点外，在LLOQ和ULOQ浓度水平：批间准确度RE％在-0.4％～2.0％范围内，精密度CV％在2.0～9.0％范围内。2500ng/mL和50ng/mL可作为方法的定量上限和定量下限。

表2：方法定量范围研究

2.2准确度和精密度

实验人员至少2天用建立的定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法评估6个独立批次的质控样品(包括LLOQ、LQC、MQC、HQC、ULOQ)。

结果如表3所示，在LLOQ和ULOQ浓度水平：批间准确度RE％在-4.2％～1.4％范围内，精密度CV％在6.9％～12.7％范围内。在QC浓度水平：批间准确度RE％在-5.1％～1％范围内，精密度CV％在4.7％～15％范围内。

表3：方法准确度和精密度研究

2.3选择性

用建立的定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法，通过向至少10个个体来源的空白基质，添加LLOQ浓度水平的抗人人IL-4Rα单克隆抗体来考察。

结果如表4所示，10个个体来源的空白样品响应值均低于LLOQ，10个个体来源LLOQ水平质控样品批内准确度RE％在-2.5％～5％范围内。

表4：方法选择性研究

实施例5使用依实施例3构建的Elisa试剂盒依实施例4建立的方法对血清中的抗人IL-4Rα单克隆抗体进行含量测定

使用稀释液对待测抗人IL-4Rα单克隆抗体样品进行MRD稀释50倍，然后用2％血清稀释液进行合适倍数的稀释，以落入标曲定量范围为宜；使用依实施例3构建的Elisa试剂盒依实施例4建立的方法对血清中的抗人IL-4Rα单克隆抗体进行含量测定。

综上所述，本发所明提供的一种定量检测血清中抗人IL-4Rα单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法，是一种通过人IL-4Rα包被酶标板形成固相载体，与待检生物样品中抗人IL-4Rα单克隆抗体结合，再通过特异性第二抗体和检测抗体，形成固相抗原-抗体-酶标抗体复合物。由于筛选获得的第二抗体(二抗)具有很强的特异性，所以本发明中所建立方法的特异性强，灵敏度高，具有好的精密度和准确度。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。