一种利用转基因斑马鱼评价二卤代硝基苯酚心脏毒性的快速筛选方法

摘要

本发明公开了一种利用转基因斑马鱼评价二卤代硝基苯酚心脏毒性的快速筛选方法。包括：将斑马鱼的胚胎在含有低浓度的二卤代硝基苯酚溶液中暴露，观察，若心室与心房重叠面积减少，距离拉长，即可判定低浓度的二卤代硝基苯酚对斑马鱼具有心脏毒性。本发明发现二卤代硝基苯酚是一类心脏毒素，均能抑制心脏的发育，采用本发明的筛选方法，可以简便、快速地、清晰地判断水环境中二卤代硝基苯酚是否具有心脏毒性，以此来评价水环境中二卤代硝基苯酚的健康风险，结果准确、可靠，为后续评价新型的含氮芳香族消毒副产物健康风险提供良好的基础。

说明书

技术领域

本发明属于毒性评价技术领域，更具体的说是涉及一种利用转基因斑马鱼模型评价二卤代硝基苯酚心脏毒性的快速筛选方法。

背景技术

二卤代硝基苯酚是一类新型的含氮芳香族消毒副产物，目前已在饮用水、游泳水等多种水环境中被频繁的检出。尽管二卤代硝基苯酚在水环境中的含量(μg/L)较低，但其在日常生活中与人类接触频繁，可通过饮食、皮肤接触等多种方式进入人体，因此对人类健康存在潜在的威胁。

尽管目前有部分研究报道了对二卤代硝基苯酚的毒性效应，但这些研究主要集中在海洋多毛虫和细胞毒性，并没有关于二卤代硝基苯酚心脏毒性的任何信息。心脏作为脊椎动物器官发生过程中最早形成的结构之一，对于维持生物体正常生长发育起着重要的作用。而毒物通过诱导心脏毒性可在后期的成长发育过程中诱发一系列的毒性效应。因此，了解二卤代硝基苯酚的心脏毒性对于准确全面评价二卤代硝基苯酚的健康风险起着重要的作用。

由于和人类具有较高的同源性，斑马鱼(Daniorerio)被作为一种模式动物，被广泛用于多种与人类相关的科学研究领域中。与成鱼相比，其胚胎对外界污染更加敏感，而且其胚胎还具有体外发育、通体透明且发育速度快等优点，因此斑马鱼胚胎被认为是毒理学研究的理想实验对象。

在斑马鱼早期毒理学实验中，常规的心脏毒性的检测方法主要基于心跳、组织病理切片或是其他分子生物学手段。Huang等人曾借助斑马鱼微视系统记录并分析了丙烯酰胺暴露下对斑马鱼每分钟的心率，以此来评估心脏毒性。但此类方法的评估敏感性性较差，实验过程复杂，需要配备价格昂贵的专业仪器。而组织病理切片则是另一种常用来反应污染物心脏毒性的生物手段。Du等人在评价膦酸酯类阻燃剂对斑马鱼的心脏毒性研究中，采用了组织病理切片。然而该方法实验过程冗长、繁琐，其所使用的染色和切片技术对实验人员要求较高。而其它同样的分子生物学手段也往往存在实验要求高、花费大，实验操作复杂等问题。尤其是在频繁的检测评估中，较高的技术要求，较长的实验时间及昂贵的价格往往意味着难以普及，而复杂的实验操作意味着更大的劳动力投入。

因此，如何提供一种二卤代硝基苯酚心脏毒性快速筛选方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用转基因斑马鱼评价二卤代硝基苯酚心脏毒性的快速筛选方法。以进一步评估水环境中二卤代硝基苯酚的健康风险。考虑现在关于二卤代硝基苯酚毒性的相关研究较少，且现有的心脏毒性检测方法操作复杂，需要配备专门的仪器，且价格高昂，因此本发明利用转基因斑马鱼(cmlc)评估二卤代硝基苯酚心脏毒性的方法，操作简单，成本低廉并且快速高效。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用转基因斑马鱼模型的二卤代硝基苯酚心脏毒性快速筛选方法，包括：将斑马鱼的胚胎在二卤代硝基苯酚的低浓度中暴露，观察，若心室与心房重叠面积减少，距离拉长，即可判定二卤代硝基苯酚在低浓度下暴露对斑马鱼具有心脏毒性。

优选的：斑马鱼为转基因斑马鱼Tgcmlc-EGFP；低浓度为1/10120hLC

进一步的，1/10120hLC

hpf：受精后的小时；

有益效果为：斑马鱼胚胎在72hpf时，心脏发育完全，此时是评价心脏形态的一个较好的发育时期。

优选的：还包括斑马鱼的饲养：养殖用水为曝气自来水，水温控制在28±0.5℃，光周期为14h：10h，pH为7.2～7.5，水的硬度为200mg/L，溶解氧浓度为5～7mg/L，电导率为550μS/cm。

优选的：还包括：斑马鱼种鱼用刚孵化的丰年虫每天投喂两次，及时清除多余的饲料和排泄物；在繁殖的前一天晚上，雄鱼和雌鱼以1：1的比例放入配鱼盒中，用隔板将配鱼盒中的种鱼雌雄分开，次日清晨，将配鱼盒中的隔板拆掉，在光照刺激下，收集所产胚胎；保留受精后4小时发育正常的胚胎。

优选的：确定120hLC

(1)将二卤代硝基苯酚溶解在二甲基亚砜中，并作为储备液储存；二卤代硝基苯酚的储备浓度均为800g/L；

(2)通过二甲基亚砜稀释储备液，制备不同浓度的溶液；

(3)在暴露前，通过培养基，将步骤(2)中不同浓度的溶液再稀释1000倍，作为暴露溶液，在受精后4小时，将胚胎暴露于暴露溶液中，每组暴露溶液中含有体积浓度为0.1％的二甲基亚砜，同时设置对照，对照中的二甲基亚砜的体积浓度为0.1％；

(4)在14h光照/10h黑暗条件下，温度保持在28±0.5℃；

在实验期间，每天更新50％暴露溶液和对照溶液，以保持二卤代硝基苯酚的浓度，从12hpf到120hpf，每隔12h记录每个浓度组在不同时间点斑马鱼胚胎的死亡数，实验结束后使用GraphpadPrism9软件，计算出二卤代硝基苯酚的LC

进一步的，确认120hLC

每隔12h记录非必须，可根据实验调整。

优选的：观察的具体步骤：在斑马鱼心脏发育72hpf时，使用荧光显微镜拍摄记录转基因斑马鱼Tgcmlc-EGFP，进行荧光观察心脏，使用ImageJ软件统计分析心室心房距离，进行比较。

有益效果在于：斑马鱼是研究心脏发育的理想模型，尤其是特异性表达荧光蛋白的转基因品系，易于标记目标组织和细胞，可以清晰直观地观察到活体心脏的动态生物学过程。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用转基因斑马鱼评价二卤代硝基苯酚心脏毒性的快速筛选方法，取得的技术效果：

发现二卤代硝基苯酚均能抑制心脏的发育，在显微镜下表现为心室心房重叠程度减少，心室心房距离拉长，因此可以通过此原理来筛选具有心脏毒性的新型的含氮芳香族消毒副产物。

采用本发明的筛选方法，可以简便、快速地、清晰地观察到模型斑马鱼心室心房距离，以此来判断二卤代硝基苯酚在低浓度下是否具有心脏毒性，结果准确、可靠，为后续深入探索新型的含氮芳香族消毒副产物心脏毒性提供良好的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的二卤代硝基苯酚的半致死浓度图。

图2附图为本发明提供的在安全浓度暴露下(1/10120hLC

图3附图为本发明提供的低浓度暴露后对斑马鱼心脏损伤(a)及心脏发育损伤程度的半定量结果示意图(b)；误差棒代表±标准偏差，误差棒上方的不同字母表示在P<0.05时有显著差异。

图4附图为本发明提供的低浓度暴露后斑马鱼的组织病理切片示意图。A:心房；V：心室。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种利用转基因斑马鱼模型的二卤代硝基苯酚心脏毒性快速筛选方法。

实施例1

转基因斑马鱼养殖及胚胎获取

养殖用水为曝气自来水，水温控制在28±0.5℃，光周期为14h：10h(昼：夜)，pH为7.2～7.5，水的硬度为200mg/L(CaCO

实施例2

二卤代硝基苯酚急性毒性评估

将二卤代硝基苯酚溶解在二甲基亚砜中，并作为储备液在4℃下暗中储存。二卤代硝基苯酚的储备浓度为800g/L。通过用E3(5mMNaCl，0.17mM KCl，0.33mMCaCl

斑马鱼仔鱼的存活率与二卤代硝基苯酚浓度呈负相关，由浓度响应曲线得出2，6-二氯-4-硝基苯酚、2，6-二溴-4-硝基苯酚和2，6-二碘-4-硝基苯酚的120h-LC

1/10120hLC

Zhang等人发现，二卤代硝基苯酚对斑马鱼幼体生存的毒性是受管控的消毒副产物的138倍。根据《全球化学品统一分类和标签制度》第8修订版，可将其归类为I类(LC

实施例3

低浓度暴露下，二卤代硝基苯酚心脏毒性评估(见图3)

二卤代硝基苯酚的低浓度为1/10～120hLC

转基因斑马鱼Tg(cmlc-EGFP)在荧光显微镜下的明场和暗场的心脏发育情况，详见图3中a，对照组斑马鱼心脏发育良好，呈s型，两个心室大部分重叠。然而，在二卤代硝基苯酚暴露处理中，转基因斑马鱼Tg(cmlc-EGFP)的心脏拉长成一串形状，重叠面积减少。

为了量化心室心房的距离，使用ImageJ软件分析所拍摄暗场的斑马鱼心脏的形态变化情况，详见图3中b，结果表明，二卤代硝基苯酚暴露会增加斑马鱼幼鱼的心室和心房的距离，对斑马鱼幼体的心脏发育有显著影响，引起严重的心脏发育毒性。

实施例4

低浓度暴露下，组织病理切片法评估二卤代硝基苯酚心脏毒性

为了进一步验证低浓度暴露下，二卤代硝基苯酚对斑马鱼的心脏毒性，利用传统组织病理切片法评估二卤代硝基苯酚心脏毒性。

二卤代硝基苯酚的低浓度为1/10～120hLC50，作为后续暴露实验的暴露浓度。后续实验将普通斑马鱼胚胎(4hpf)置于10ml的的暴露液中，每个浓度实验组设置空白对溶剂对照，每个实验组平行重复六次，在斑马鱼心脏发育(72hpf)时，用4％多聚甲醛固定过夜，进行石蜡包埋、切片，再使用苏木精-伊红染色，最后使用体式显微镜拍摄记录普通斑马鱼心脏受损情况。详见图4，结果表明了低浓度暴露下，斑马鱼心室心房的距离被拉长，心脏的形态发生显著变化。表明了二卤代硝基苯酚对斑马鱼具有严重的心脏毒性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。