假长双歧杆菌在制备治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种假长双歧杆菌在治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用，该假长双歧杆菌用于治疗注意缺陷多动障碍，其通过平衡肠道微生态，调节脑肠轴内分泌功能紊乱，进而大大缓解与ADHD相关的异常心理行为状态。该假长双歧杆菌对血清中的ACTH、CORT激素，脑组织中的Nr3c1、Nr3c2 mRNA基因，以及脑组织中的GR、MR、CRF的蛋白的表达水平显著上调，进而能够通过调节HPA轴功能缓解ADHD症状。本发明对于寻求益生菌对注意缺陷多动障碍的治疗潜力方面提供了有力的理论依据，具有较高的社会意义及潜在的市场价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种假长双歧杆菌在制备治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用。

背景技术

注意缺陷多动障碍(Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder，ADHD)是儿童最常见的神经发育性障碍之一，核心症状为注意缺陷、多动/冲动，伴有社交、学业等方面功能损害；全世界儿童ADHD的患病率约为7.2％，我国儿童ADHD患病率为6.26％；由于其症状多在学龄期出现，因此数十年来ADHD被认为是一种局限于儿童、青少年的行为问题。但是到20世纪80年代初，相继有许多学者对ADHD进行了追踪研究，结果发现10％-60％的ADHD患者到青春期后，其症状尤其是社会功能并未缓解，只是ADHD的临床表现形式发生了变化，而且出现了更多的共患病和社会问题，对患者的学业、家庭和社会生活等方面产生了明显不良的影响。因此，ADHD已经越来越引起人们更广泛地关注。

有证据表明，肠道免疫功能障碍是ADHD病理生理学的一部分。过敏性鼻炎、哮喘、过敏性皮炎和过敏性结膜炎等特应性疾病的发病率在住院ADHD患者中有所增加。在患有多动症的儿童中，便秘和大便失禁的发生率都在增加。这些发现表明，肠道生态失调可能与ADHD患者的胃肠功能障碍有关，并可能在这些病例中对大脑功能和行为起作用。

ADHD患儿的肠道菌群与正常儿童相比，多样性上有显著差异，此外“微生物-肠-脑轴”的发现，证实了肠道菌群与神经系统关系密切，肠道微生物可通过影响多种神经递质、免疫、内分泌和代谢途径来影响中枢神经系统，进而导致行为和认知变化。重建肠道菌群稳态，是预防和缓解精神行为异常性相关疾病的新手段。

70多年来，多动症的治疗主要是使用单胺能精神刺激药，主要是哌甲酯(MPH)和安非他明(AMPH)，外加儿茶胺能非兴奋剂阿托西汀(ATX)。然而在临床上大约有20％-30％的患者使用MPH治疗效果差甚至无效，不能达到症状的控制。还有一部分患者因不能耐受MPH的副作用(睡眠障碍、食欲降低、头痛、抽搐等)而减少药量甚至停药，也不能达到临床控制。另外由于中枢兴奋药物远期疗效的局限性和潜在的滥用危险，一些家庭拒绝中枢兴奋药物的治疗。因此，寻找副作用小、价格经济且适合预防敏感人群ADHD发生的产品，非常的必要和紧迫。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种假长双歧杆菌在制备治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的假长双歧杆菌在治疗注意缺陷多动障碍的药物中的应用，所述假长双歧杆菌用于治疗注意缺陷多动障碍，所述假长双歧杆菌以治疗有效量使用以实现注意缺陷多动障碍的治疗，该假长双歧杆菌的保藏号为Bio-74494。

进一步，所述注意缺陷多动障碍包括但不限于大脑功能发育异常引起的注意缺陷多动障碍。

在某些具体实施例中，有效剂量为200μL，且所述假长双歧杆菌菌液的浓度为2.8×10

在某些具体实施例中，所述假长双歧杆菌制成药物制剂，所述药物制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂和气体制剂中的任一种。

进一步，所述药物制剂的剂型包括药剂学上可接受的任意一种剂型。

进一步，所述药物制剂还包括药剂学上可接受药用辅料中的任一种或者多种。

在某些具体实施例中，所述假长双歧杆菌的给药方式为灌胃给药。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1)本申请提供假长双歧杆菌的一种新用途，用于制备治疗注意缺陷多动障碍的药物，其通过平衡肠道微生态，调节脑肠轴内分泌功能紊乱，进而大大缓解与ADHD相关的异常心理行为状态。本发明验证了假长双歧杆菌可以通过调节血清中的ACTH、CORT激素，脑组织中的Nr3c1、Nr3c2 mRNA表达水平，以及脑组织中的GR、MR、CRF表达水平，进而改善注意缺陷多动障碍的相关症状。

2)本申请中的假长双歧杆菌，在给予SHR大鼠两周假长双歧杆菌菌液灌胃后，其多动行为、自发性活动水平及冲动行为都有相当显著的改善；HPA轴相关激素、基因及蛋白表达都明显上调，根据以上实验结果，推测假长双歧杆菌可能通过调节HPA轴功能缓解ADHD症状。本发明对于寻求益生菌对注意缺陷多动障碍的治疗潜力方面提供了有力的理论依据，具有较高的社会意义及潜在的市场价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所述假长双歧杆菌的生长曲线；

图2为本发明所述假长双歧杆菌菌液浓度。(A)为假长双歧杆菌菌液稀释10

图3为本本发明所述假长双歧杆菌菌液浓度标准曲线图；

图4为本发明所述假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)的多动行为、自发性活动水平的影响；

图5为本发明所述假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)的冲动行为的影响；

图6本发明所述假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关激素的影响；

图7为本发明所述假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)海马Nr3c1和Nr3c2 mRNA表达水平的影响；

图8为本发明所述假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关蛋白的影响。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明所提供的假长双歧杆菌(Bifidobacterium PseudolongumSubsp.Pseudolongum Mitsuoka)，保藏于美国菌种保藏中心，保藏机构简称：ATCC，生物保藏编号为Bio-74494，菌株编号：

实施例1：假长双歧杆菌的培育

本申请中的假长双歧杆菌可以通过如下方法进行培育：

①假长双歧杆菌活化

假长双歧杆菌活化操作在厌氧操作台中进行。准备1支含有15mL硫乙醇酸盐流体培养基(酪胨(胰酶水解)15.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖5.0g，硫乙醇酸钠0.5g，L-胱氨酸0.5g，氯化钠2.5g，刃天青0.001g，琼脂0.75g，pH值7.1±0.2)的试管(提前置于厌氧环境除氧24h)；将装有假长双歧杆菌株冻干粉的安瓿管表面酒精消毒后，用酒精灯灼烧假长双歧杆菌株安瓿管顶部后迅速移至厌氧培养箱中冷却使之破裂。将0.5mL硫乙醇酸盐流体培养基加入安瓿管中，充分溶解冻干粉后，将假长双歧杆菌株混悬液加入到含有硫乙醇酸盐流体培养基的试管中，封口后放于15×30cm的密封厌氧培养袋，并立刻放入厌氧产气袋，在37℃厌氧培养箱(湿度65％)中静置培养至菌液浑浊或底部有大量菌体生长。

②假长双歧杆菌生长曲线的测定

如图1所示，为了测定假长双歧杆菌的数量，了解生长状况和代谢情况，采用比浊法测定。利用分光光度计测定假长双歧杆菌悬液与OD值的关系，以此明确假长双歧杆菌生长规律，并将其与所培养时间对应，明确假长双歧杆菌生长曲线，为实现后续体内外实验菌液的均一性准备。

②假长双歧杆菌菌液浓度计算

如图2和图3所示，吸取0.1mL混合液于盛有10mL培养基的试管中，此稀释度为10

计算公式：N(cfu/mL)＝n*d

n:平均菌落数d

④假长双歧杆菌传代培养与保存

准备10支装有硫乙醇酸盐流体培养基试管，取500μL活化好的假长双歧杆菌液接种于试管中，封口后放于15×30cm的密封厌氧培养袋，并放入厌氧产气袋。在37℃厌氧箱中静置培养1天后，明显可见液体培养基中菌液浑浊。菌种冻存管和60％无菌甘油(体积分数)高压灭菌后放入厌氧培养箱中，然后取菌液和甘油按照1：1的比例移入冻存管中，每管中加入1mL左右的细菌悬液，使甘油终浓度达到30％，-80℃保存。

⑤假长双歧杆菌菌液配置

假长双歧杆菌在培养后的8-10h达到对数期，用移液枪从对数生长期培养物中吸取1mL菌液于分光光度计样品池中，用紫外分光光度计检测OD

实施例2：假长双歧杆菌的性能实验

在本实施例中，所选用的实验动物为：

选取16只三周龄SHR雄性大鼠，室温保持在23±1℃，湿度保持在50±60％。光暗循环12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化。

实验方法：SHR大鼠分为Vehicle(SHR)、假长双歧杆菌灌胃组(B.p)，每组8只。SHR组每天灌胃给予200μL生理盐水，B.p组每日灌胃给予200μL上述假长双歧杆菌菌液，该假长双歧杆菌菌液的活菌数为2.8×10

1)假长双歧杆菌对多动行为、自发性活动水平的影响

对上述各组小鼠进行每日给药时间为上午8：00－9:00，连续给予14d，第15天各组大鼠空腹12h，进行行为学实验，具体为：

①旷场实验

旷场实验是用来评估大鼠在新环境中的自主活动，主动探索和焦虑状态。旷场装置为长50cm，宽50cm，高40厘米上部敞开的黑色箱子。旷场装置中正上方有摄像机与电脑相连，记录大鼠在旷场中的活动信息。实验开始前，在电脑中设置好旷场实验系统参数，并让大鼠适应周围环境5min，然后将大鼠放入旷场中，记录大鼠在旷场内5min的活动情况。每只大鼠实验结束后，对矿场实验装置中的大鼠粪便及尿液进行清理，然后用5％的乙酸水溶液对矿场装置彻底清洁，再用纸巾或干布擦干记录的活动信息包括活动总路程，中央活动距离，中央活动持续时间和活动轨迹图。结果如图4所示，图4为假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)的多动行为、自发性活动水平的影响。(4A)为连续灌胃假长双歧杆菌两周后，B.p组大鼠在旷场实验中的总活动距离显著减少(P<0.05)；(4B)为连续灌胃假长双歧杆菌两周后，B.p组大鼠在旷场实验中的中心区活动距离显著减少(P<0.05)；(4C)为连续灌胃假长双歧杆菌两周后，B.p组大鼠在旷场实验中的中心区活动时间显著减少(P<0.05)(N＝8)。(4D)为Vehicle大鼠在旷场实验中的活动轨迹图。(4E)为B.p组大鼠在在旷场实验中的活动轨迹图。

②高架十字迷宫

高架十字迷宫是由两个闭合壁(50cm×10cm)、两个开放壁(50cm×10cm)和中央区(10cm×10cm)构成的垂直十字，距离地面高50cm。实验开始前2h，将动物放入隔音房间以适应环境。严格控制房间温度和通风。实验者每次于同一位置将动物放于中央区位置，动物头部朝向其中一个开放壁的方向，实验人员离开实验装置区域后开始实验。实验时间5min，以动物在开臂内停留时间和进入开臂次数占总次数和总时间的百分比为主要指标评价动物冲动行为。结果如图5所示，图5为假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)的冲动行为的影响；(5A)为连续灌胃假长双歧杆菌两周后，B.p组大鼠在高架十字迷宫实验中的总活动距离显著减少(P<0.05)；(5B)为连续灌胃假长双歧杆菌两周后，B.p组大鼠在进入开臂空间次数显著减少(P<0.05)；(5C)为连续灌胃假长双歧杆菌两周后，B.p组大鼠在在高架十字迷宫中开臂空间活动时间的百分比显著减少(P<0.05)(N＝8)；(5D)为Vehicle大鼠在高架十字迷宫中的活动轨迹图；(5E)为B.p组大鼠在高架十字迷宫中的活动轨迹图。

2)假长双歧杆菌对脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关激素的影响

对本实施例中的各组小鼠的血清使用ELISA酶联接免疫吸附剂测定血清中肠脑轴神经内分泌系统相关激素水平：促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，皮质醇(cortisol，CORT)。结果如图6所示，图6假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关激素的影响；其中6A为相较于Vehicle大鼠，灌胃两周假长双歧杆菌菌液的大鼠血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)明显升高(P<0.0001)。6B为灌胃两周假长双歧杆菌菌液的大鼠血清中皮质醇(CORT)水平显著高于Vehicle大鼠(P<0.0001)(数据表示为平均值±标准差，N＝8)；酶联接免疫吸附剂测定实验结果表明，假长双歧杆菌可改善注意缺陷多动障碍存在的内分泌系统功能紊乱，调节HPA轴功能。

3)假长双歧杆菌对脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关基因的影响

对本实施例中的各组大鼠的脑组织(皮层、海马)，使用Quantitative-PCR法测定脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关基因表达水平：糖皮质激素受体(Nr3c1)，盐皮质激素受体(Nr3c2)。结果如图7所示，其中7A为假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)海马Nr3c1 mRNA表达水平的影响。7B为假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)海马Nr3c2mRNA表达水平的影响。数据表示为平均值±标准差，N＝6；灌胃两周假长双歧杆菌菌液后，相较于Vehicle组，B.p组脑组织中的Nr3c1、Nr3c2 mRNA表达水平显著上调。这些结果表明，假长双歧杆菌可能通过一定的作用机制调节脑肠轴神经内分泌系统功能，进而改善ADHD相关症状。

4)假长双歧杆菌对脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关蛋白分析的影响

对本实施例中的各组大鼠的脑组织(皮层、海马)，使用Western Blot免疫印迹法测定脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关蛋白水平：糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor，GR)，盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)，促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)。

结果如图8所示，图8为假长双歧杆菌对注意缺陷多动障碍大鼠(SHR)脑组织中肠脑轴神经内分泌系统相关蛋白的影响。通过免疫印迹法(Western Blot)测定神经内分泌系统相关蛋白糖皮质激素受体(GR)，盐皮质激素受体(MR)，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的蛋白表达水平。从图中可以看出，WB结果显示，灌胃两周假长双歧杆菌菌液后，相较于Vehicle，B.p组实验组脑组织中的GR、MR、CRF表达水平显著上调。这些结果表明，假长双歧杆菌可能通过一定的作用机制调节脑肠轴神经内分泌系统功能，进而改善ADHD相关症状。

本发明通过上述实验表明假长双歧杆菌具有缓解ADHD相关多动及冲动行为症状。这种效应可能是通过调节肠脑轴中神经内分泌功能相关的激素水平发挥作用的。本发明对于寻求益生菌对注意缺陷多动障碍的治疗潜力方面提供了有力的理论依据，具有较高的社会意义及潜在的市场价值。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。