脐带间充质干细胞外泌体联合脐血PRP制备的口腔黏膜病喷雾

摘要

本发明涉及干细胞技术领域，具体来说是一种脐带间充质干细胞外泌体联合脐血PRP制备的口腔黏膜病喷雾。本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体联合脐血富血小板血浆(Platelet‑rich plasma，PRP)制备的口腔黏膜病喷雾，控制脐带间充质干细胞外泌体联合脐血PRP后的混合喷雾中蛋白浓度为0.15～0.20 mg/ml，血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的2～3倍。可以有效改善免疫性口腔黏膜病以及复发性口腔溃疡。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体来说是一种脐带间充质干细胞外泌体联合脐血PRP制备的口腔黏膜病喷雾。

背景技术

口腔黏膜病也称口腔溃疡，指的是口腔某一部位黏膜的正常色泽、外形、完整性与功能等发生改变的疾病。病变种类繁多，可以组合成复杂多样的损害。有些全身性疾病也在口腔黏膜上有所表现，而有些口腔表征可作为全身疾病诊断的依据或线索。其发病因素方面，除了少数与口腔条件直接相关外，绝大多数与全身或系统因素的关系密切。随着免疫学研究的不断发展，发现与自身免疫有关的口腔黏膜病在临床上已屡见不鲜，如慢性盘状红斑狼疮、天疱疮、类天疱疮、舍格林氏综合征、贝赫切特综合征以及结节病等。口腔中反复发作溃疡的疾病有：复发性阿弗他溃疡、复发性坏死性粘膜腺周围炎、贝赫切特氏病。

目前市售的常用口腔溃疡治疗的药物，例如采用甲硝唑能够杀灭口腔内G+ 、G-厌氧菌且具有收敛作用，虽然在治疗上有较好的效果，但其镇痛作欠佳，经治疗后多易复发，而且不良反应较多；因大部分抗生素长期使用会引起口腔内部的正常菌群失调；长期以往会降低人体免疫力，增加细菌入侵的危害。

口腔溃疡的细胞疗法作为一个新型的治疗手段被广泛研究，间充质干细胞在培养过程中会分泌多种大量的外泌体，人脐带间充质干细胞分泌的外泌体能够促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，可调节局部组织微环境，促进血管新生，加快溃疡面愈合，有效缓解患者疼痛程度，从而达到改善治疗的效果。如CN 109010523 A一种用脐带间充质干细胞分泌细胞因子制备的口腔溃疡软膏及制备方法，其采用了添加免疫调控增强剂和外泌体活化剂激活脐带间充质干细胞的方法，但是其治疗所用的时间长；另外针对复发性口腔溃疡的治疗效果不佳。

发明内容

针对现阶段口腔溃疡细胞疗法上存在的问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体联合脐血富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)制备的口腔黏膜病喷雾，有效改善免疫性口腔黏膜病以及复发性口腔溃疡。

本发明的技术方案如下：

一种口腔黏膜病喷雾，采用脐带间充质干细胞外泌体联合脐血PRP制备而成。

优选地，所述的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

（1）原代细胞制备：符合采集标准的脐带标本，于48h内进行细胞分离；将脐带保存液弃尽，用生理盐水冲洗，截取透亮度好、无破损、无水肿区域的脐带小段；用组织剪将脐纵向剖开，剔除脐静脉和脐动脉，用生理盐水冲洗；华通胶充分剪碎，接种至已加培养基的培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀分布于瓶底，培养；换液、传代、收获；

（2）细胞传代：细胞融合度达80％～90％时，进行细胞消化弃掉培养瓶中的上清液，用生理盐水冲洗培养瓶底细胞，用0.25％ TRY-EDTA的消化液消化细胞，待细胞由长梭形逐渐变圆并起时用新的无血清完全培养基终止消化；收集细胞并使之混匀，取样计数后离心；用无血清培养基重悬后并进行接种，培养2～3d时细胞融合度80％～90％进行细胞收获，经多次传代后即获得P1、P2、P3.......代细胞；

（3）流式细胞检测脐带间充质干细胞的表型；

（4）间充质干细胞外泌体的制备、收集和预处理：当细胞培养至第3、4、5代时，当融合度达70%-80%时，将培养基弃掉，用生理盐水洗细胞，加入MSC基础培养基，进行饥饿培养，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液；离心去除死细胞和碎片；滤膜过滤。

优选地，脐血PRP的制备方法包括以下步骤：取脐血，颠倒混匀，置于低温低速离心机，设定离心参数升9降7，1700g，室温，离心；轻拿轻放，静置一下，离心管自上而下分四层：贫血小板血浆PPP 、富血小板血浆PRP、白细胞、红细胞，用注射器自上而下、慢慢吸弃PPP；收集第二层的液体即为PRP层。

优选地，所述的PRP层的血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的4～6倍。

进一步地，脐带间充质干细胞外泌体联合脐血PRP后的混合喷雾中蛋白浓度为0.15～0.20 mg/ml，血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的2～3倍。

本发明的有益效果

（1）目前市售的常用口腔溃疡治疗的药物，例如采用甲硝唑能够杀灭口腔内G + 、G - 厌氧菌且具有收敛作用，虽然在治疗上有较好的效果，但其镇痛作欠佳，经治疗后多易复发，而且不良反应较多；因大部分抗生素长期使用会引起口腔内部的正常菌群失调。

（2）间充质干细胞在培养过程中会分泌多种大量的外泌体，人脐带间充质干细胞分泌的外泌体能够促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，可调节局部组织微环境，促进血管新生，加快溃疡面愈合，有效缓解患者疼痛程度，从而达到改善治疗的效果。本发明采用饥饿脐带间充质干细胞的方法,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体 。

（3）富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)，是利用血液制作的富含血小板的高浓度血浆。人体的血小板在高浓度状态下，能够产具有细胞粘合功能的蛋白质(fibrin，中文名称：纤维连接蛋白、纤粘蛋白)，可以促进血小板大量分泌有促进伤口、组织愈合及细胞再生的多种生长因子，所以PRP也叫做富含生长因子血浆(plasma-rich growthfactors，PRGFs))。PRP具有迅速止血、止痛、加速伤口愈合的作用，可极大程度减轻疼痛，从上世纪九十年代中期开始，被广泛应用于各种外科手术、心脏手术以及整形手术，目前亦广泛用于医学美容方面。PRP抗衰老修复的原理，是根据生长因子的强大再生力量，促使肌肤新生而成。PRP中主要生长因子成分为①TGF(变形生长因子)：促进血管上皮细胞修复再生；②FGF(纤维细胞生长因子)：激发新活细胞，加速组织修复；③EGF(表皮生长因子):修复上皮细胞，加速血管生长，加快组织修复；④PDGF(血小板衍生生长因子):产生胶原蛋白，促进血管生长，激活细胞再生；⑤VEGF(血管内皮生长因子):强力修复组织，产生胶原蛋白，激生透明质酸。脐血PRP分泌各种因子含量能力更强及脐血血浆富含的生长因子更强大，同一血型的脐血PRP止血、止痛、加速伤口愈合的作用及医学美容方面会慢慢体现。

附图说明

图1为脐带间充质干细胞P0的显微镜图片；

图2为脐带间充质干细胞P3的显微镜图片；

图3为脐带间充质干细胞 P5的显微镜图片；

图4为脐带间充质干细胞的表型结果图；

图5 为饥饿培养不同时间与外泌体的浓度的关系图。

具体实施方式

实施例1

一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

一、原代细胞制备

采集符合采集标准的脐带标本，于48h内进行细胞分离。将脐带保存液弃尽，用生理盐水冲洗2～3次，并将脐带移至Φ15cm培养瓶内，截取透亮度好、无破损、无水肿区域的脐带小段，每段截成2～3cm。用组织剪将脐纵向剖开，剔除脐静脉和脐动脉，用生理盐水冲洗4～7次。使用脐带组织专用剪将华通氏胶剪成将华通胶充分剪碎至1mm

培养最初7天，保持培养瓶绝对静止。第八天根据生长情况，依据换液、传代、收获；结果见图1。

二、细胞传代

细胞融合度达80％～90％时，进行细胞消化弃掉培养瓶中的上清液，用生理盐水冲洗培养瓶底细胞1～2次，用0.25％ TRY-EDTA的消化液消化细胞，待细胞由长梭形逐渐变圆并起时用新的无血清完全培养基终止消化。收集细胞并使之混匀，取样计数后离心。用无血清培养基重悬后并按照0.5~1×10

三、流式细胞检测脐带间充质干细胞的表型

3.1样本处理

取6.0～9.0×10

3.2抗体标记

取12支流式上机试管，标记为1～12，预先加入流式抗体组合每支上机试管添加100u1细胞(每支内至少有1.0×10

由图4的流式检结果可知，CD90和CD105为90％以上，同时CD34和CD45检测结果为2％以下。

四、间充质干细胞外泌体的制备、收集和预处理

4.1间充质干细胞外泌体的制备：当细胞培养至第3、4、5代时，当融合度达70%-80%时，将完全培养基弃掉，用生理盐水洗细胞2遍，加入25ml MSC基础培养基，进行饥饿培养12－48h小时，结果见图5，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液。

4.2细胞培养上清预处理：细胞上清液置于低温冷冻离心机，3000g离心20min去除死细胞和碎片。

4.3过滤除大颗粒：先后使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤第2步上清，收集过滤后的液体，取样150ul测蛋白浓度。

4.4 BCA法测定蛋白质浓度：选择波长为562 nm处测吸光度值，空白对照为基础培养基；根据吸光度值绘制标准曲线，计算样本中的蛋白浓度。

四、间充质干细胞外泌体的制备、收集和预处理

4.1间充质干细胞外泌体的制备：当细胞培养至第3、4、5代时，当融合度达70%-80%时，将完全培养基弃掉，用生理盐水洗细胞2遍，加入25ml MSC基础培养基，进行饥饿培养12－48h小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液。

4.2细胞培养上清预处理：细胞上清液置于低温冷冻离心机，3000g离心20min去除死细胞和碎片。

4.3过滤除大颗粒：先后使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤第2步上清，收集过滤后的液体，取样150ul测蛋白浓度。

4.4 BCA法测定蛋白质浓度：选择波长为562 nm处测吸光度值，空白对照为基础培养基；根据吸光度值绘制标准曲线，计算样本中的蛋白浓度。

实施例2

脐血PRP制备 脐带血富血小板血浆

将所接收的脐血，用75%酒精擦拭釆血袋。取脐血105ml，颠倒混匀分装到3支50ml离心管a中，置于低温低速离心机，设定离心参数升9降7，1700g，室温，离心12min，离心后，轻拿轻放，静置一下，离心管自上而下分四层：PPP 、PRP、白细胞、红细胞，在生物安全柜中，用注射器自上而下、慢慢吸弃PPP。用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层的液体即为PRP层。混匀后，取样150ul用于计数。制备后血浆中血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的4～6倍。

实施例3

一种口腔黏膜病喷雾的制备方法，包括以下步骤：

根据测定的外泌体蛋白质浓度及脐血PRP浓度，将实施例1的外泌体液体和实施例2的PRP混合，使配比后蛋白浓度为0.18mg/ml之间，血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的3倍，用0.22μm的滤膜过滤，分装在无菌喷雾瓶中。放置在-20℃培冰箱中可保存12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。

实施例4

一种口腔黏膜病喷雾的制备方法，包括以下步骤：

根据测定的外泌体蛋白质浓度及脐血PRP浓度，将实施例1的外泌体液体和实施例2的PRP混合，使配比后蛋白浓度为0.15mg/ml之间，血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的3倍，用0.22μm的滤膜过滤，分装在无菌喷雾瓶中。

实施例5

一种口腔黏膜病喷雾的制备方法，包括以下步骤：

根据测定的外泌体蛋白质浓度及脐血PRP浓度，将实施例1的外泌体液体和实施例2的PRP混合，使配比后蛋白浓度为0.20mg/ml之间，血小板浓度为制备前脐血中血小板浓度的2倍，用0.22μm的滤膜过滤，分装在无菌喷雾瓶中。

五、实施效果例

(1)疗效研究：

复发性口腔溃疡以灼痛为突出特征，好发于唇、舌、软腭等部位，外观为单个或者多个大小不一的圆形或椭圆形溃疡，直径5-10μm，表面覆盖灰白或黄色假膜，中央凹陷，边界清楚，周围黏膜红而微肿；具有周期性、复发性、自限性的特征，年龄不拘，女性较多，一年四季均能够发生，且能够在1-2周自愈，不留瘢痕。

本发明选取口腔溃疡患者100人，按照干预方式不同随机分为观察组和对照组，其中观察组50人，对照组50人，给予观察组人群早晚各一次本发明实施例3的喷雾，给予对照组人群早晚各一次0.9％氯化钠注射液漱口；

使用方法：口腔护理前后30min内禁止饮食饮水，先口腔内含10mL凉白开水，鼓动冲洗口腔各部位，3分钟后吐出，向溃疡面均匀喷雾，早晚各一次；连续使用10天，以溃疡面红斑消失、患者正常饮食为标准，如果溃疡面红斑消失可提前停止使用。

对比观察两组患者治疗效果，经过治疗后，判定标准为：

显效：患者溃疡面完全消失，疼痛、红斑均消失，并且患者正常饮食；

有效：患者溃疡面基本消失，疼痛、红斑等减轻，仍需注意饮食；

无效：经治疗后，患者溃疡面未见减少，疼痛、红斑等情况未见明显好转，仍不可正常饮食。

在经过治疗后发现，观察组患者口腔溃疡治疗有效率达到98％、3天可愈合，高于对照组50％、10天可愈合，治疗效果见下表；

从上表可以看出，本申请的喷雾愈合时间短，效率高。