新型配位肽QEY127及其在与稀土离子组装成发光材料的应用

摘要

本发明公开新型配位肽QEY127及其在与稀土离子组装成发光材料的应用。配位肽QEY127由1个起始密码子编码甲硫氨酸(M)、1个6聚组氨酸标签(6X His)和10个QSEPGDPGEPSY(QEY12)构成，长度为127个氨基酸残基；配位肽QEY127基因通过全基因合成方法获得，并优化了密码子构成。配位肽QEY127产量为100～1200mg/L发酵液，纯度为82～95％。本发明配位肽QEY127具有谷氨酰胺转氨酶(TG酶)催化交联、高弹和与稀土金属形成发光配位化合物的特性，在生物医用领域、发光材料领域具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物高分子研究领域，主要是涉及一种新型配位肽QEY127及其在与稀土离子组装成发光材料的应用。

背景技术

稀土铕在近几年来是研究的一大热点，相关稀土离子既可以光致发光，也可以电致发光，在诸如生物标定、化学分析、民用照明等领域，稀土离子都有着不俗的表现，是一类性能优异的材料。

大部分小分子掺杂的稀土离子，本身存在一定的问题，如机械强度较差、稳定性较差、难以成膜，且真空蒸镀成膜的处理工艺成本相对昂贵。解决上述难题的一种有效途径是，可以将小分子稀土配合物物理掺杂有机高分子例如聚甲基丙烯酸甲酯等，使之高分子化，获得聚合物白光有机发光二级管材料；或者是采用适当的化学聚合法，制备均聚物或者共聚物，如甲基丙烯酸甲酯、二氧化硅气凝胶以及可德胶等，并以此为高分子配体，选择二苯甲酰甲烷、三氟乙酰噻吩甲酰甲烷、β-二酮以及乙酰丙酮作为小分子配体，通过协同配位反应合成相关高分子荧光配合物。高分子化处理稀土配合物是一种行之有效的方法，可以使处理工艺上的成本大大减少，并且可以湿法旋涂成膜，以适应未来发光材料卷曲化和大尺寸的趋势。

肽类(或蛋白类)是性能优越的新型载体材料，具有更加丰富多变的组装形式，其材料学性能更为优越。通过适宜氨基酸残基的组合运用可以创造出具有良好铀配合性能的配位肽。目前有关肽类配位化合物或高分子研究报道仍然较少。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种配位肽QEY127。

新型配位肽QEY127的主要功能区是由10个拷贝长度为12个氨基酸残疾的小肽QSEPGDPGEPSY(QEY12)构成，上游(N端)携带的6聚组氨酸标签(6X His)便于目标蛋白的分离纯化；其氨基酸序列如下：

MHHHHHHQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSYQSEPGDPGEPSY，见SEQ NO.2所示。

作为优选，配位肽QEY127由6聚组氨酸标签前起始密码子编码的甲硫氨酸、6聚组氨酸标签(6X His)、10个重复QEY12序列顺次连接构成，长度为127个氨基酸残基。

本发明的第二个目的是提供编码配位肽QEY127的基因序列，如下：

ATGCATCATCACCATCACCATCAGAGCGAACCGGGTGATCCGGGTGAACCGAGCTATCAATCTGAGCCTGGAGATCCGGGTGAAGTGAACCAGGCGACCCTGGAGAACCGTCTTACCAGAGCGAACCGGGTGATCCGGGTGAACCGAGCTATCAATCTGAGCCTGGAGATCCGGGTGAACCTAGTTATCAACCCTGGAGAACCGTCTTACCAGAGCGAACCGGGTGATCCGGGTGAACCGAGCTATCAATCTGAGCCTGGAGATCCGGGTGAACCTAGTTATCAGAGTGAACCAGGCGACCCTGGAGAACCGTCTTACCAGAGCGAACCGGGTGATCCGGGTGAACCGAGCTATTAA，见SEQ NO.1所示。

作为优选，编码配位肽QEY127基因序列的上游还包括表达元件：Lac启动子、Lac操纵子和Lac核糖体结合位点(RBS)。

作为优选，配位肽QEY127的表达载体为PUC57，插入位点为EcoRⅤ限制性酶切位点，表达宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株。

作为优选，配位肽QEY127全基因长度为384bp，其中6聚组氨酸标签(6X His)前侧为起始密码子3bp，6聚组氨酸标签(6X His)密码子长度为18bp，10个编码12个氨基酸残基的密码子360bp，以及终止密码子3bp。

作为优选，配位肽QEY127基因上游序列长度为196bp，其中Lac启动子34bp，Lac操纵子25bp，核糖体结合位点(RBS)8bp。

作为优选，位于PUC57上EcoRⅤ位点的人工合成序列长度为580bp。

本发明的第三个目的是提供配位肽QEY127的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、配位肽QEY127表达载体的构建：

按SEQ NO：3所示序列合成目标基因片段，其中包含SEQ NO：1所示的基因序列，将合成序列接插入到PUC57载体上EcoRⅤ位点，获得QEY127表达载体；

步骤(2)、将配位肽QEY127表达载体导入大肠杆菌DH5α中，获得QEY127表达菌株；

步骤(3)、配位肽QEY127的自诱导表达：将QEY127表达菌株接种到自诱导表达培养基中，于一定温度下培养一定时间，获得产物发酵液；

所述自诱导表达培养基配方为：酵母抽提物0.5～2.5g/L，胰蛋白胨1.0～3.0g/L，硝酸钾0.1～0.5g/L，葡萄糖0.1～1.5g/L，磷酸氢二钾1.0～3.0g/L，磷酸二氢钾1.0～3.0g/L，磷酸铵2.0～6.0g/L，硫酸镁0.2～1.6g/L，氯化钙2.0～5.0mg/L，氯化钴0.5～3.5mg/L，氯化铜0.5～1.5mg/L，硫酸锰1.2～5.0mg/L，钼酸钠3.2～8.0mg/L，硼酸0.1～0.5mg/L，氯化铁1.0～8.0mg/L，氯化锌0.5～3.0mg/L，甘油1.0～10.0g/L，丝氨酸0.5～2.0g/L，甘氨酸2.0～10.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)20～300mg/L；发酵温度为16～40℃；发酵时长为12～24h；

步骤(4)、配位肽QEY127的分离纯化：

将步骤(3)产物发酵液离心收集菌体，并重悬于磷酸盐缓冲溶液中，超声破碎，然后再次离心收集上清液，最后将上清液过镍离子柱并以梯度浓度咪唑洗脱，收集配位肽QEY127洗出液，经透析和冷冻干燥获得本发明目标配位肽QEY127。

本发明的第三个目的是提供配位肽QEY127在制备发光材料上的应用。

本发明的第四个目的是提供一种发光配位材料，是将配位肽QEY127经谷氨酰胺转氨酶催化交联形成树状、网状或线型结构复合体，平均聚合度可达到100-20000，拉伸比为200％-1000％，晾干成膜；将上述配位肽QEY127聚合物与稀土金属盐共孵育形成紫外灯下发射红光的材料。

作为优选，稀土金属采用铀。

作为优选，配位肽QEY127聚合物与稀土金属盐的质量比为100-1：1-100。

本发明的有益效果如下：

本发明新型配位肽QEY127兼具长度均一、可完全生物降解、能够与稀土金属配伍形成发光材料、微生物法制备产量高、不存在化工污染等优点；其具体表现如下：

(1)本发明配位肽QEY127为人工设计制备的蛋白，不存在天然对应体或类似物。配位肽QEY127的氨基酸序列(SEQ NO:2)经NCBI数据库BLASTp比对分析，表明配位肽QEY127与数据库中蛋白质序列最高覆盖率93％时，相似度为62.1％，且最高相似度序列为假定蛋白。

(2)本发明制备配位肽QEY127所用基因序列非天然基因序列，是经过密码子改造并由人工合成的全新基因序列。通过全基因合成法获得新型人造配位肽QEY127的基因(SEQNO:1)。配位肽QEY127基因序列经NCBI数据库BLASTn比对分析，结果为无显著相似序列发现。

(3)在配位肽QEY127基因上游设计了Lac基因表达原件，使其能够在大肠杆菌DH5α菌株中受IPTG诱导表达，并最终通过细胞破碎和镍离子柱亲和层析分离获得本发明融合蛋白。

(4)配位肽QEY12肽段中重复出现的谷氨酰胺和赖氨酸残基为通过TG酶完成分子内和分子间交联提供了活性位点，谷氨酸和天冬氨酸残基上的羧基则为稀土金属离子配位结合提供了位点，脯氨酸残基则为肽段提供了柔韧和弹性的可能，甘氨酸和丝氨酸主要起到空间位阻缓冲和临近活性位点保护的作用。这些性能赋予该配位肽QEY127优良的稀土金属配位性能、易加工性以及优良的产品稳定性，在生物医药领域和发光材料领域具有广阔的应用前景。

本发明配位肽QEY127产量为100～1200mg/L发酵液，纯度为82～95％。本发明配位肽QEY127具有谷氨酰胺转氨酶(TG酶)催化交联、高弹和与稀土金属形成发光配位化合物的特性，在生物医用领域、发光材料领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为PUC57质粒图谱和基因序列插入的位子示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

配位肽QEY12序列由人为设计而来，非天然蛋白，经NCBI上BLAST序列比对发现Genbank中无DNA和蛋白质相同序列。相同肽段研究未见报道，相关制备方法亦未见报道。

在下列所有实施例子中的宿主菌为大肠杆菌DH5α(保藏号：GIM1.571)，表达载体框架为PUC57质粒，配位肽QEY127表达框插入位点为EcoRⅤ限制性内切酶位点。图1为PUC57质粒图谱和基因序列插入的位子示意图。大肠杆菌DH5α，购自宝生物工程(大连)有限公司，分类命名：大肠杆菌DH5α，拉丁学名：Escherichia coliDH5α，保藏号：GIM1.571，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。质粒PUC57，2710bp，来自大肠杆菌，由南京金斯瑞生物科技公司免费提供。本发明所有的百分比含量，没有特备指明，都属于质量百分比含量。

在下列实施例中，以较具代表性的实施方案为例进行说明，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

实施例1

步骤1：将配位肽QEY127表达框序列委托生物技术有限公司进行全基因合成(SEQNO:3)，并采用限制性酶切连接方法插入PUC57上EcoRⅤ位点，然后采用化学法或电击法导入大肠杆菌DH5α菌株，经羧苄青霉素抗性培养基筛选和DNA测序验证，获得配位肽QEY127表达菌株。

其中限制性酶切连接方法为：以EcoRⅤ酶切PUC57质粒，采用琼脂糖凝胶电泳法分离经EcoRⅤ酶切的PUC57线性片段，然后以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化PUC57质粒。以高保真DNA聚合酶扩增人工合成配位肽QEY127表达框序列，同样采用琼脂糖凝胶电泳法分离配位肽QEY127表达框片段，以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收配位肽QEY127表达框片段。将线性化PUC57质粒200ng与配位肽QEY127表达框片段100ng在20μL T4连接酶反应体系中连接过夜，即获得包含配位肽QEY127表达载体的连接产物。

大肠杆菌DH5α菌株转化方法为(以化学法为例)：吸取5μL包含配位肽QEY127表达载体的连接产物，加入到200μL购自宝生物工程(大连)有限公司的大肠杆菌DH5α化学法感受态细胞中，混合均匀并于冰浴中静置30min，然后于42℃水浴孵育90s，然后于冰浴中静置2min，最后添加800μL无抗生素液体LB培养基，于37℃下培养1h，即获得包含配位肽QEY127表达菌株的混合物。

转化子筛选方法为：将包含配位肽QEY127表达菌株的混合物涂布于含有100μg/mL羧苄青霉素的LB固体培养基平板上，于37℃下倒置培养过夜，获得再生单克隆菌落。挑取单克隆菌落寄往生物公司进行DNA测序，从中选取携带正确配位肽QEY127表达载体的大肠杆菌DH5α表达菌株，即为正确的配位肽QEY127表达菌株。

步骤2：将配位肽QEY127表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于16℃下，以220转/min的振荡速度培养12h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物0.5g/L，胰蛋白胨1.0g/L，硝酸钾0.1g/L，葡萄糖0.1g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙2.0mg/L，氯化钴0.5mg/L，氯化铜0.5mg/L，硫酸锰1.2mg/L，钼酸钠3.2mg/L，硼酸0.1mg/L，氯化铁1.0mg/L，氯化锌0.5mg/L，甘油1.0g/L，丝氨酸0.5g/L，甘氨酸2.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)20mg/L。

步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。

其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：50mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0M尿素，pH8.0。

步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标配位肽QEY127。

基于实施例1获得配位肽QEY127产率为100mg/L发酵液，纯度为80％，该配位肽QEY127的2mg/mL溶液经TG酶催化可形成聚合度达到100的树状、网状和线型结构复合体，晾干成膜后拉伸比为1000％，配位肽QEY127聚合物与氯化铀共孵育，在质量比100：1下可形成紫外灯下发射红光的材料，在195nm-230nm间具有强紫外吸收峰，195nm下最大发射波长587nm，230nm下最大发射波长625nm，587nm与625nm下相对荧光强度为3.5。

实施例2

步骤1：参照实施例子1里的步骤1的方法，获得获得配位肽QEY127表达菌株。

步骤2：将配位肽QEY127表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于40℃下，以220转/min的振荡速度培养24h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物2.5g/L，胰蛋白胨3.0g/L，硝酸钾0.5g/L，葡萄糖1.5g/L，磷酸氢二钾3.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，磷酸铵6.0g/L，硫酸镁1.6g/L，氯化钙5.0mg/L，氯化钴3.5mg/L，氯化铜1.5mg/L，硫酸锰5.0mg/L，钼酸钠8.0mg/L，0.1～0.5mg/L，氯化铁8.0mg/L，氯化锌3.0mg/L，甘油10.0g/L，丝氨酸2.0g/L，甘氨酸10.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)300mg/L。

步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。

其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，3.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，3.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：100mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，3.0M尿素，pH8.0。

步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标配位肽QEY127。

基于实施例2获得配位肽QEY127产率为800mg/L发酵液，纯度为87％，该配位肽QEY127的200mg/mL溶液经TG酶催化可形成聚合度达到20000的树状、网状和线型结构复合体，晾干成膜后拉伸比为600％，配位肽QEY127聚合物与氯化铀共孵育，在质量比1：100下可形成紫外灯下发射红光的材料，在195nm-230nm间具有强紫外吸收峰，195nm下最大发射波长587nm，230nm下最大发射波长625nm，587nm与625nm下相对荧光强度为2.1。

实施例3

步骤1：参照实施例子1里的步骤1的方法，获得获得配位肽QEY127表达菌株。

步骤2：将配位肽QEY127表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于28℃下，以220转/min的振荡速度培养18h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物1.5g/L，胰蛋白胨2.0g/L，硝酸钾0.3g/L，葡萄糖0.8g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，磷酸铵4.0g/L，硫酸镁0.9g/L，氯化钙3.5mg/L，氯化钴2.0mg/L，氯化铜1.0mg/L，硫酸锰3.1mg/L，钼酸钠5.6mg/L，硼酸0.3mg/L，氯化铁4.5mg/L，氯化锌1.75mg/L，甘油5.5g/L，丝氨酸1.25g/L，甘氨酸6.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)160mg/L。

步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。

其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：75mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0。

步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标配位肽QEY127。

基于实施例3获得配位肽QEY127产率为900mg/L发酵液，纯度为93％，该配位肽QEY127的100mg/mL溶液经TG酶催化可形成聚合度达到500树状、网状和线型结构复合体，晾干成膜后拉伸比为500％，配位肽QEY127聚合物与氯化铀共孵育，在质量比1：1下可形成紫外灯下发射红光的材料，在195nm-230nm间具有强紫外吸收峰，195nm下最大发射波长587nm，230nm下最大发射波长625nm，587nm与625nm下相对荧光强度为1.9。

实施例4

步骤1：参照实施例子1里的步骤1的方法，获得获得配位肽QEY127表达菌株。

步骤2：将配位肽QEY127表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于34℃下，以220转/min的振荡速度培养16h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物1.2g/L，胰蛋白胨1.80g/L，硝酸钾0.3g/L，葡萄糖0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，磷酸铵2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙3.0mg/L，氯化钴2.0mg/L，氯化铜0.9mg/L，硫酸锰3.2mg/L，钼酸钠6.0mg/L，硼酸0.2mg/L，氯化铁4.0mg/L，氯化锌1.0mg/L，甘油6.0g/L，丝氨酸1.0g/L，甘氨酸5.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)120mg/L。

步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。

其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：80mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0。

步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标配位肽QEY127。

基于实施例4获得配位肽QEY127产率为1000mg/L发酵液，纯度为95％，该配位肽QEY127的160mg/mL溶液经TG酶催化可形成聚合度达到17000的树状、网状和线型结构复合体，晾干成膜后拉伸比为1000％，配位肽QEY127聚合物与氯化铀共孵育，在质量比80：3下可形成紫外灯下发射红光的材料，在195nm-230nm间具有强紫外吸收峰，195nm下最大发射波长587nm，230nm下最大发射波长625nm，587nm与625nm下相对荧光强度为1.9。