对叶百部碱在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用

摘要

本发明公开了一种对叶百部碱在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用，属于医药技术领域。本发明实施例从细胞试验和活体实验方面，证实表明对叶百部碱能够改善肝脂肪变性、对于非酒精性脂肪肝的发生具有预防和治疗效果，对叶百部碱可以在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用。同时，对叶百部碱作为一种低毒性天然小分子化合物，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用、缓解高脂诱发肝脂肪变性、在非酒精脂肪肝的治疗药物中发挥作用，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种对叶百部碱在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用。

背景技术

对叶百部碱(TS)是提取自中药对叶百部块根的一种生物碱。已经报道TS具有抗炎作用，可以用于治疗支气管炎，通过抑制小鼠肺实质中炎症细胞(中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞)的流入而对香烟烟雾诱发的急性肺部炎症具有缓解抑制作用。可以通过下调NF-κB表达进而提高白血病的化疗效率，并能逆转慢性骨髓性白血病细胞K562/ADR的多药耐药性。而且还具有镇咳作用。体内外实验已经证明TS具有安全的临床医学特征。

随着生活水平的提高，普遍流行久坐不动的工作方式，这将进一步促进肥胖的发展。肥胖已经在世界范围变得越来越普遍，它增加了很多并发疾病的患病概率，比如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、二型糖尿病、高血压等。其中，非酒精性脂肪肝病是典型的代谢性疾病，近年来引起了大家的广泛关注。肝脏具有很多生理功能，是机体至关重要的器官，是体内许多生理过程的交通枢纽。在机体出现肥胖或脂肪代谢受损的情况下，肝脏会以甘油三酯的形式储存多余的脂质，当肝脏内积累的甘油三酯超过了肝脏重量或体积的5％，而没有过度的酒精刺激或其他病毒感染时，就将其称之为是非酒精性脂肪肝病。

据统计，非酒精性脂肪肝病在一般人群中的患病率为20％-30％，目前患病率还在增长，它会随着肥胖流行的增加而增加，是全球范围内最具有广泛代表性的肝脏代谢障碍疾病。肝脏是机体最大的腺体，其功能主要以代谢为主，所以非酒精性脂肪肝病的患者常伴有胰岛素抵抗、心血管疾病和二型糖尿病和高血压等并发症。它进一步发展会引起肝炎、肝纤维化、血脂异常、甚至会导致肝细胞癌(HCC)，这会大大增加社会经济负担和肝移植的概率和数量，甚至会增加死亡概率，这将使我们面临着更加严重的临床研究和社会负担问题。

到目前为止，现有的研究和技术中还没有关于对叶百部碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝变性的报道，也没有发现类似的暗示或尝试性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对叶百部碱在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用，旨在解决目前缺乏健康有效预防或治疗肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的低毒性天然小分子药物的问题。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明实施例中从活体和细胞试验两方面显示：

TS在200μM以内对HepG2人肝癌细胞无明显毒性。

TS能够通过减少人肝癌细胞HepG2胞胞内TG含量和脂滴数量及大小，增加胞内TG的转运，来缓解人肝癌细胞HepG2的脂质紊乱；TS可以增加可以增加人肝癌细胞HepG2线粒体荧光染色数量、和ATP水平，能够促进人肝癌细胞HepG2能量代谢；而且TS可以通过降低人肝癌细胞HepG2内的ROS水平、MDA含量，增加还原型GSH和CAT的含量，从而增加人肝癌细胞HepG2的抗氧化作用。

此外，TS能有效降低有高脂饮食引起的老鼠体重的增加、脂肪率的增加，以及减少由高脂饮食引起的脂肪分布。并且TS可以提高小鼠的葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性和能量代谢水平；同时，发现TS可以减少肝脏的TG水平，减少肝脏脂质沉积，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用，表明TS能够改善肝脂肪变性、对于脂肪肝的发生具有预防和治疗效果。

经过本发明上述实施例中从活体和细胞试验结果可知，对叶百部碱可以在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用。

作为优选的实施方式，所述的防治包括预防、缓解、治疗。

作为优选的实施方式，所述制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物，制备获得的药物为注射制剂药物。

所述的注射制剂药物为溶液制剂，粉末制剂，水针制剂或油制剂中的一种。

所述的注射制剂药物中还含有药学上可接受的辅料和/或载体。

作为优选的实施方式，所述对叶百部碱在注射制剂药物中的含量为15mg/mL-30mg/mL。

作为优选的实施方式，所述对叶百部碱的用量优选为90mg/kg-180mg/kg；即每kg体重的用药量为90mg-180mg。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明实施例中确认，在细胞试验层面上，首先验证了TS在50μM时对人肝癌细胞无明显毒性作用，并且TS能够通过减少人肝癌细胞HepG2胞胞内TG含量和脂滴数量及大小，增加胞内TG的转运，来缓解人肝癌细胞HepG2的脂质紊乱；TS可以增加可以增加人肝癌细胞HepG2线粒体荧光染色数量、和ATP水平，能够促进人肝癌细胞HepG2能量代谢；而且TS可以通过降低人肝癌细胞HepG2内的ROS水平和增加还原型GSH的含量，从而增加人肝癌细胞HepG2的抗氧化作用。在活体实验层面上，TS能有效降低有高脂饮食引起的老鼠体重的增加、脂肪率的增加，以及减少由高脂饮食引起的脂肪分布。并且TS可以提高小鼠的葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性和能量代谢水平；同时，发现TS可以减少肝脏的TG水平，减少肝脏脂质沉积，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用，表明TS能够改善肝脂肪变性、对于非酒精性脂肪肝的发生具有预防和治疗效果。因而证实了TS可以在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用，并且该药物应用没有明显副作用，从而为有效预防或治疗肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝，提供了一种新的低毒性天然小分子药物-对叶百部碱。并且，对叶百部碱作为一种低毒性天然小分子化合物，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用、缓解高脂诱发肝脂肪变性，可以在非酒精脂肪肝的治疗药物中发挥作用，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例一中细胞相关实验的示意图。

图2为本发明实施例一中活体研究相关实验的示意图。

图3为不同浓度的TS对HepG2人肝癌细胞毒性影响的结果图。

图4为不同浓度的TS处理后HepG2人肝癌细胞胞内TG含量的检测结果图。

图5为TS处理后HepG2人肝癌细胞的胞外TG含量结果图；

图6为TS处理后HepG2人肝癌细胞的油红O染色结果图；其中左侧图为0μM的TS处理，右侧图为50μM的TS处理。

图7为TS处理后HepG2人肝癌细胞的线粒体荧光染色数量检测结果图；其中左侧图为0μM的TS处理，右侧图为50μM的TS处理。

图8为TS处理后HepG2人肝癌细胞的线粒体的ATP水平的检测结果图。

图9为TS处理后HepG2人肝癌细胞的ROS水平的检测结果图。

图10为TS处理后HepG2人肝癌细胞的MDA水平的检测结果图。

图11为TS处理后HepG2人肝癌细胞的GSH水平的检测结果图。

图12为TS处理后HepG2人肝癌细胞的CAT水平的检测结果图。

图13为TS处理后小鼠体重检测结果图。

图14为TS处理后小鼠进行核磁共振测量脂肪率的结果图。

图15为TS处理后小鼠进行CT检测脂肪分布结果图。

图16为TS处理后取附睾脂肪组织进行HE染色后的结果图。

图17为TS处理后取附睾脂肪组织细胞尺寸分析的结果图。

图18为TS处理后小鼠进行葡萄糖耐受性(GTT)测试结果图。

图19为TS处理后小鼠进行胰岛素敏感性(ITT)测试结果图。

图20为TS处理后小鼠代谢笼中观察能量代谢的测试结果图；其中，A为O

图21为TS处理后小鼠肝脏中TG水平检测结果图。

图22为TS处理后小鼠肝脏HE染色结果图。

图23为TS处理后小鼠肝脏中脂质沉积的油红O染色结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，现有技术缺少有效缓解脂肪肝变性或脂肪肝的低毒性无副作用的天然小分子药物。为了解决上述技术问题，本发明提出了一种对叶百部碱化合物在制备缓解脂肪肝变性或脂肪肝的药物中的应用。

目前研究发现，在TS处理期间的90天没有表现出毒性作用。

实施例一

本实施例中分别通过活体以及细胞试验，通过在高脂引起的脂质代谢紊乱的小鼠和HepG2人肝癌细胞中使用对叶百部碱进行处理，进而探究对叶百部碱在脂肪肝变性和非酒精性脂肪肝中的作用和药物应用前景。

本实施例中的小分子为固体药物，体内外实验的小分子的纯度均≥98％。药物溶于DMSO中，使其母液为20mM并置于-20℃保存。

细胞实验如图1所示。体外采用HepG2细胞检测TS对脂质代谢的影响。首先，将不同浓度的TS添加到DMEM(普通生长培养基)进行细胞培养，待HepG2细胞融合度达80％左右，用CCK8试剂盒检测TS对细胞的毒性作用。确定无毒性作用后，可进行后续实验。后续所有细胞实验都要先进行高脂诱导，即分为油酸/棕榈酸(OA/PA)诱导HepG2人肝癌细胞组、OA/PA诱导HepG2人肝癌细胞+50μM TS组。具体操作是待细胞生长融合度达80％左右，用无血清培养基进行静息培养6-12h；静息结束后，对照组每孔添加油酸/棕榈酸(OA/PA)培养基，实验组每孔用等量添加有50μM对叶百部碱的OA/PA培养基处理24小时。加药前，将小分子置于4℃解冻，按照1995μL OA/PA培养基添加5μL母液浓度为20mM的TS的比列配制终浓度为50μM对叶百部碱。处理24h后，取细胞测脂质代谢、糖代谢、能量代谢与氧化应激方面与脂肪肝变性密切的指标。具体包括(1)检测TS对HepG2人肝癌细胞活性影响；(2)检测TS对HepG2人肝癌细胞脂质代谢进行调控，测胞内外TG和LPS等变化，以及对细胞进行油红O染色观察细胞脂质积累的变化情况；(3)检测TS对HepG2人肝癌细胞能量代谢的影响，对细胞进行荧光染色，拍照观察细胞线粒体数量变化；测量线粒体ATP的变化；(4)检测TS对HepG2人肝癌细胞氧化应激的影响，测细胞ROS、MDA、CAT和GSH氧化方面指标变化。

活体实验如图2所示，实验动物为C57BL/6小鼠；五周大的雄性小鼠维持在温度为23±2℃、光/暗周期为12小时的环境中，可自由获得食物和水；经过2周的适应性喂养，小鼠被随机分为以下四组(n＝6)。1)正常饮食组(ND，3.8千卡/克，脂肪热量10％，蛋白质热量14％，碳水化合物热量76％)；2)高脂肪饮食组(HFD，5.5千卡/克，脂肪热量60％，蛋白质热量14％，碳水化合物热量26％)；3)高脂肪饮食注射15mg/mL TS组(HFD-L，5.5千卡/克，脂肪热量60％，蛋白质热量14％，碳水化合物热量26％，注射量为6μl/g体重)；4)高脂肪饮食注射30mg/mL TS组(HFD-H，5.5千卡/克，脂肪热量60％，蛋白质热量14％，碳水化合物热量26％，注射量为6μl/g体重)。小鼠实验时间周期为11周。处死前，将小鼠禁食6小时，用乙醚麻醉后将小鼠断颈处死，收集组织样本进行后续与脂肪肝变性相关的指标检测。活体实验包括：(5)检测TS对小鼠脂肪沉积的影响；(6)检测TS对小鼠葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性的影响；(7)检测TS对小鼠能量代谢的影响；(8)检测TS对小鼠肝脏脂质沉积的影响。

实验结果显示：

1.TS对HepG2人肝癌细胞无明显毒性影响

首先为了测试TS对HepG2人肝癌细胞的毒性，我们使用CCK8试剂盒分别测试了0、50μM，100μM，150μM和200μM的TS对HepG2人肝癌细胞毒性的影响，如图3所示结果，TS在200μM以内对HepG2人肝癌细胞无明显毒性影响。

2.TS对HepG2人肝癌细胞脂质代谢进行调控

脂肪肝一般伴随着高TG水平，加入50μM和100μM的TS后胞内TG逐渐下降，如图4所示。之后以50μM的TS做后续试验。接着我们发现50μM TS处理增加了胞内TG的转运，如图5所示。为进一步探究TS对HepG2人肝癌细胞脂质代谢的影响，做了油红O染色，图6表示HepG2人肝癌细胞油红O染色图，可以看出脂滴明显减少。这说明TS可以缓解HepG2人肝癌细胞脂质紊乱。

3.TS对增加HepG2人肝癌细胞能量代谢

肝细胞中富含线粒体，线粒体是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所，经过氧化磷酸化作用产生ATP以供机体所需。细胞线粒体荧光染色数量发现，TS可以增加HepG2人肝癌细胞线粒体数量，如图7所示。并且TS可以提高线粒体的ATP水平，如图8所示。表明TS对细胞能量代谢有促进作用。

4.TS对HepG2人肝癌细胞有抗氧化作用

细胞内过量的活性氧，会让正常细胞不断受到攻击与伤害。检测细胞ROS等氧化方面指标后，发现加入TS后显著降低了细胞ROS水平和MDA含量，如图9、图10所示。GSH、CAT作为抗氧化剂，在加入TS后，发现显著增加了GSH、CAT水平，如图11、图12所示。

5.TS有降低小鼠脂质沉积的作用

高脂肪饮食引起的过量脂质的沉积，会致使机体代谢紊乱，引起体重及体脂率的增加。分析老鼠每周的体重发现，如图13所示，TS能有效降低小鼠体重的增加。在实验的第0、2、4、6和第8周对小鼠进行核磁共振测量其脂肪率发现，TS可以有效减缓脂肪率的增加，如图14所示。

随后，CT检测老鼠的脂肪的分布发现，相比HFD组，HFD-L和HFD-H组的小鼠体内的脂肪分布减少，如图15所示。老鼠附睾脂肪HE染色后，发现TS可以使得高脂肪饮食引起的脂滴减小，如图16、图17所示。

6.TS可以提高小鼠的葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性

高脂肪饮食容易引起葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，从而会引发机体糖代谢紊乱，进一步加重脂质代谢紊乱。对小鼠进行葡萄糖耐受性(GTT)以及胰岛素敏感性(ITT)试验发现，TS可以提高小鼠的葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性，如图18、图19所示。

7.TS具有提高小鼠能量代谢的作用

高脂肪饮食导致肥胖，肥胖主要是因为能量摄入和能量支出不平衡，因而会引起机体能量代谢紊乱。将小鼠置于代谢笼观察小鼠的O

8.TS具有减少小鼠肝脏脂肪沉积的作用

高脂肪饮食容易引起内脏脂肪堆积，尤其是肝脏，这会对肝脏造成损伤，从而导致肝脏变性，容易形成NAFLD，严重时会引发肝纤维化甚至肝癌。将小鼠肝脏进行TG检测，发现TS可以减少肝脏的TG水平，如图21所示。肝脏HE和油红O发现，TS减少了肝脏空泡化的程度和肝脏脂滴的大小和数量，如图22、23所示，表明TS治疗改善了肝脏脂肪变性。

综上实验结果，本发明实施例中从活体和细胞试验两方面显示：

TS在200μM以内对HepG2人肝癌细胞无明显毒性。

TS能够通过减少人肝癌细胞HepG2胞胞内TG含量和脂滴数量及大小，增加胞内TG的转运，来缓解人肝癌细胞HepG2的脂质紊乱；TS可以增加可以增加人肝癌细胞HepG2线粒体荧光染色数量、和ATP水平，能够促进人肝癌细胞HepG2能量代谢；而且TS可以通过降低人肝癌细胞HepG2内的ROS水平、MDA含量，增加还原型GSH和CAT的含量，从而增加人肝癌细胞HepG2的抗氧化作用。

此外，TS能有效降低有高脂饮食引起的老鼠体重的增加、脂肪率的增加，以及减少由高脂饮食引起的脂肪分布。并且TS可以提高小鼠的葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性和能量代谢水平；同时，发现TS可以减少肝脏的TG水平，减少肝脏脂质沉积，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用，表明TS能够改善肝脂肪变性、对于脂肪肝的发生具有预防和治疗效果。

经过本发明上述实施例中从活体和细胞试验结果可知，对叶百部碱在制备防治肝脂肪变性或脂肪肝的药物中应用。

所述的防治包括预防、缓解、治疗。

所述的脂肪肝为非酒精性脂肪肝。

所述制备防治肝脂肪变性或脂肪肝的药物，制备获得的药物为注射类药物。作为优选的实施方式，所述制备防治肝脂肪变性或脂肪肝的药物，制备获得的药物为注射制剂药物。

所述的注射制剂药物为溶液制剂，粉末制剂，水针制剂或油制剂中的一种。

所述的注射制剂药物中还含有药学上可接受的辅料和/或载体。

作为优选的实施方式，所述对叶百部碱在注射制剂药物中的含量为15mg/mL-30mg/mL。

作为优选的实施方式，所述对叶百部碱的用量优选为90mg/kg-180mg/kg，即每kg体重的用药量为90mg-180mg。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明实施例中确认，在细胞试验层面上，首先验证了TS在50μM时对人肝癌细胞无明显毒性作用，并且TS能够通过减少人肝癌细胞HepG2胞胞内TG含量和脂滴数量及大小，增加胞内TG的转运，来缓解人肝癌细胞HepG2的脂质紊乱；TS可以增加可以增加人肝癌细胞HepG2线粒体荧光染色数量、和ATP水平，能够促进人肝癌细胞HepG2能量代谢；而且TS可以通过降低人肝癌细胞HepG2内的ROS水平和增加还原型GSH的含量，从而增加人肝癌细胞HepG2的抗氧化作用。在活体实验层面上，TS能有效降低有高脂饮食引起的老鼠体重的增加、脂肪率的增加，以及减少由高脂饮食引起的脂肪分布。并且TS可以提高小鼠的葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性和能量代谢水平；同时，发现TS可以减少肝脏的TG水平，减少肝脏脂质沉积，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用，表明TS能够改善肝脂肪变性、对于非酒精性脂肪肝的发生具有预防和治疗效果。因而证实了TS可以在制备防治肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药物中应用，并且该药物应用没有明显副作用，从而为有效预防或治疗肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝，提供了一种新的低毒性天然小分子药物-对叶百部碱。并且，对叶百部碱作为一种低毒性天然小分子化合物，对高脂有诱导的脂质积累有明显缓解作用、缓解高脂诱发肝脂肪变性，可以在非酒精脂肪肝的治疗药物中发挥作用，具有广泛的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。