检测RNA m6A修饰引起的免疫反应的方法

摘要

检测RNA m6A修饰引起的免疫反应的方法。本发明属于分子生物学领域，提供了一种体外检测含有N6‑甲基腺嘌呤(N6‑methyladenosine，m6A)修饰的RNA引起的免疫反应的方法及其应用.本发明基于体外获得的含有与不含有m6A修饰的RNA片段，并通过检测转染不同RNA片段在体外模型中引起的相关免疫因子表达水平的变化来评估m6A修饰对RNA免疫原性的影响.该方法帮助我们在体外快速准确的判断m6A修饰对RNA免疫反应性的影响，有助于对m6A修饰生物学意义的探索。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种m6A甲基化修饰对RNA引起的细胞免疫反应的检测方法.

背景技术

RNA的转录后修饰对RNA功能的正常发挥至关重要.目前已在RNA上鉴定出超过100种不同类型的修饰，其中N6-甲基腺苷酸修饰(N6-methyladenosine，m6A)是哺乳动物mRNA上含量最为丰富的一种修饰类型。

m6A的修饰位点高度保守，通常富集在3’-非翻译区(3’-UTR)、近终止密码子处的RRACH(R＝G/A；H＝A/C/U)基序上.在哺乳动物中，m6A修饰受到甲基转移酶、去甲基化酶以及m6A识别蛋白等多种因子的调控.m6A通过对RNA降解、翻译和剪接等分子过程的调控来参与许多细胞生物学过程，如免疫调节、脂肪代谢、生物节律、生殖发育等.除此之外，m6A及其调控因子参与了免疫识别、先天及适应性免疫反应激活以及细胞命运的决定，在免疫系统相关基因表达的严格调控过程中发挥了重要作用.

越来越多的研究发现在病毒和原核生物的RNA上也存在大量的m6A修饰，然而目前的技术无法帮助我们去准确的解释这些修饰存在的意义.近年来，随着m6A检测技术的不断发展，人们实现了从ELISA简单定量到单碱基分辨率RNA测序技术的突破，这帮助我们可以在单碱基水平上实现对RNA修饰的调控.然而，目前基于体外合成获得的转录本受限于RNA结构和性质的不稳定性，往往面临着易降解、修饰难度大、无法获得天然结构以及成本高等问题.因此，我们提供了一种基于免疫沉淀来获取天然含有与不含有m6A修饰的RNA分子，并由此来模拟RNA诱导的免疫过程的方法.此方法可以帮助我们在体外快速准确的判断m6A修饰对RNA免疫反应性的影响，有助于对m6A修饰生物学意义的探索.

发明内容

本发明的目的是提供一种体外检测m6A修饰对RNA免疫原性影响的方法.

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于免疫沉淀来获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA的方法，包括以下步骤：

(1)细胞或组织样本中的总RNA的提取；

(2)取上述获得的总RNA与m6A特异性抗体在IP缓冲液中4℃孵育过夜；

(3)向上述混合液中加入免疫磁珠，4℃孵育2-3h后回收上清.

(4)用IP缓冲液将(3)中磁珠洗涤3次，然后加入洗脱液来洗脱磁珠上的RNA.

(5)将(3)和(4)步骤获得的上清以及洗脱液进行乙醇沉淀，分别在上清和洗脱液中获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA.

前述的方法，本发明特征在于步骤(1)中的样本选择包括但不限于临床、动物组织样本，真核、原核细胞，病毒，体液，外泌体等.

前述的方法，本发明特征在于步骤(2)中RNA投入量要保证在20-25ug.

前述的方法，本发明特征在于步骤(2)中的m6A抗体可以特异性区分含有与不含有m6A修饰的RNA，并将含有m6A修饰的RNA富集下来.

前述的方法，本发明特征在于步骤(3)中的上清被认为含有不存在m6A修饰的RNA.

前述的方法，本发明特征在于步骤(4)中的洗脱液被主为含有存在m6A修饰的RNA.

前述的方法，步骤(5)之后使用Nanodrop2000超微量分光光度计完成对RNA的浓度以及质量的测定.

前述的方法，步骤(5)之后使用m

第二方面，本发明提供一种外源性RNA免疫原性的检测方法，包括：

(1)将免疫沉淀获得的含有与不含有m6A修饰外源RNA转染进细胞中；

(2)Trizol提取转染细胞的总RNA；

(3)将上述RNA进行反转录获得cDNA，通过qPCR的方法来检测相关免疫因子的表达情况.

前述的方法，本发明特征在于步骤(1)使用Lipo3000实现对任意的人类或其他哺乳动物细胞系的外源RNA的转染.

前述的方法，本发明特征在于步骤(1)以原核生物中提取的RNA Gluc作为阳性对照，来检测RNA的转染效率.

前述的方法，本发明特征在于步骤(2)之后使用Nanodrop2000超微量分光光度计完成对RNA的浓度测定.

前述的方法，本发明特征在于步骤(3)可以通过不同的引物实现对多种免疫因子的mRNA的表达水平的检测.

基于上述的技术方案，本发明包含至少以下优点：

(一)本发明所述技术方案操作简便，成本低.本发明基于体外免疫沉淀的方法获取天然的含有与不含有m6A修饰的RNA，从根本上避免了体外转录与修饰实验中RNA获取困难、难以体现天然RNA的真实结构、成本高等缺点.

(二)本发明所述技术方案特异性高.本发明基于高度特异性的m6A抗体来区分含有与不含有m6A修饰的RNA分子，并配有对RNA浓度与质量的检测方法，保证获得的RNA的纯度与特异性.

(三)本发明所述技术方案应用范围广.本发明可以实现对临床组织样本、动物组织样本、细胞、病毒，体液，外泌体等多种来源的RNA的免疫原性的检测；本发明通过RNA转染在多种细胞系中实现对RNA免疫原性的检测.

(四)本发明所述技术方案弥补了对病毒和原核生物的RNA上m6A修饰生物学意义的研究.

附图说明

图1为本发明体外获得有无m6A修饰的RNA的方法原理图.

图2A为本发明中SH-SY5Y细胞系m6A-IP上清中RNA的浓度与质检结果.

图2B为本发明中SH-SY5Y细胞系m6A-IP洗脱液中RNA的浓度与质检结果.

图2C为本发明中SH-SY5Y细胞系m6A-IP上清与洗脱液中m6A含量的ELISA检测结果.

图3A为本发明检测m6A修饰对RNA免疫原性影响的方法原理图.

图3B为本发明阳性对照的序列及其转染效果.

图3C为本发明体外转染有无m6A修饰的小鼠细胞系的免疫因子检测结果.

图3D为本发明体外转染有无m6A修饰的人源细胞系的免疫因子检测结果.

具体实施方式

本发明提供了一种体外检测m6A修饰对RNA免疫原性影响的检测方法.

第一方面，本发明提供一种基于免疫沉淀来获得存在与不存在m6A修饰的天然RNA的方法，下面将详细描述本发明的示例实施方案。此处仅为一种实例中的参考方法：

(1)总RNA的获取与定量。1×PBS洗涤的细胞沉淀或充分研磨的组织样本，加入适量Trizol，充分裂解

(2)按1ml Trizol：200μl氯仿的量加入氯仿尽享萃取，4℃，13000rpm离心20min后加入等体积稍多一点的异丙醇，充分混匀后放在液氮中3-5min进行RNA的沉淀

(3)干燥后，用RNase-free的水溶解RNA，使用NanoPhotometer测定RNA的浓度和质量，保证获得的RNA总量在20μg及以上；

(4)配置5×IPP缓冲液；

(5)将20-25μg总RNa和anti-m6A(Synaptic Systems，货号：202003)在IP缓冲液中充分混合，4℃摇床过夜孵育，转速20r/min左右；

(6)500μL BSA(0.5mg/mL)封闭40ul Dynabeads protein A/G(Lifetechnologies， 10002D)，4℃rotation孵育2～3h，转速20r/min左右；

(7)将(5)步骤的reactions转入(6)步骤已经去除上清的beads中，4℃rotation孵育2h，转速20r/min左右，配置elution buffer；

(8)保留(7)步骤中获得的上清液，此处含有无m6A修饰的RNA；

(9)1mL 1×IPP buffer洗(7)步骤中结合了mRNA的beads，2min洗3次；

(10)用400μL elution buffer来洗脱(9)步骤中的beads，4℃摇床孵育3h，保持仪器转速50～60r/min左右，获得有m6A修饰的RNA；

(11)将(8)步骤上清与(10)步骤洗脱液的总体积调整为400μL，再加1/10体积的5M醋酸铵和1μL Glycogen，使用100％乙醇沉淀RNA，分别获得不含有和含有m6A 修饰的RNA；

(12)取(11)步骤的两种RNA各1ul，使用NanoPhotometer测定两组分中RNA的浓度和质量；

(13)取(11)步骤的两种RNA各200ug，以yeast tRNA为阴性对照，total RNA为空白对照.使用m6A定量检测试剂盒(Epigentek，P-9005)，酶标仪测量OD

第二方面，本发明提供一种外源性RNA的免疫反应性的检测方法，下面将详细描述本发明的示例实施方案.此处仅为一种实例中的参考方法：

(14)小鼠神经母细胞瘤Neuro2a以及小鼠小胶质细胞系BV2提前一天铺板；

(15)细胞融合度达70-90％时使用LiPo3000(Invitrogen，L3000001)和P3000将阳性对照(Gluc，NEB#E1610S，序列见附图)、500ng含有m6A修饰和不含有m6A修饰的RNA转染进细胞中；

(16)24h后Trizol提取细胞的总RNA，使用NanoPhotometer测定RNA的浓度；

(17)使用东洋纺RT反转试剂盒对500ng RNA进行逆转录获得cDNA；

(18)qPCR检测阳性对照外源RNA的转染效果以及多种天然免疫因子的表达水平，引物见下表.

Real-time qPCR引物