一种快速鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌的方法

摘要

本发明属于耐药菌鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌的方法，包括建库用耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌的筛选、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药基因检测、质谱样品制备、蛋白质谱条带差异、建立不同肺炎克雷伯菌菌株的蛋白质谱条带差异数据库、用建立的质谱数据库进行临床鉴定。本发明质谱鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的准确率为81.5%，鉴定一株细菌的平均时间为0.5分钟，鉴定20株细菌的平均鉴定时间为10分钟。

说明书

技术领域

本发明属于耐药菌鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌的方法。

背景技术

当前，抗生素滥用而导致的耐药细菌的出现正成为全球共同面临的一大严峻危机。世界卫生组织的有关资料显示，每年全球死于抗生素耐药的约有70万人。另据英国抗菌药物评估委员会估计，到2050年，全球将有1000万人遭遇抗生素耐药问题。针对耐药细菌的问题，2017年世界卫生日主题为“控制细菌耐药，今天不采取行动，明天将无药可用”。在世界卫生组织认为急需开发新抗生素的12种重点耐药性细菌中，耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌类包括肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞及鲍氏不动杆菌为第一队列，在需要新抗生素的迫切度上最高。

肺炎克雷伯菌（

在近期，泛耐药高毒力的肺炎克雷伯杆菌院内感染暴发案例已经报道多起，而且存在散发的泛耐药高毒力肺炎克雷伯菌，院内感染暴发易发生在烧伤病房、ICU及神经外科等危重病人集中的病房，如果没有及时发现及处理，容易造成危重病人的高死亡率。因此，及时识别诊断泛耐药高毒力肺炎克雷伯菌，对临床合理应用抗菌药物及预防院内感染暴发具有重要的意义。传统的微生物鉴定方法主要是基于表型的检测，包括革兰染色、微生物培养和生化试验、药敏试验等，往往耗时较长，需要至少72小时才能将结果反馈临床。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix- assisted laser desorptionionization- time of flight MAs spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年发展起来的一种新型的细菌鉴定技术，不仅可以在10分钟内快速准确鉴定细菌，还可用于一些无菌样本如血液和尿液的直接鉴定，极大地缩短了检测时间至一小时。其原理是将检测样品与基质溶液混合或分别点加在样品靶上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶；利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，经过飞行时间检测器，以质谱峰为纵坐标，质荷比(m/z)为横坐标，形成质量图谱；通过软件分析比较，筛选并确定出特异性图谱，从而实现对目标微生物的区分和鉴定。各类细菌经MALDI-TOF- MS检测可以形成特异性的指纹图谱，只要建立这些细菌的图谱库，将待测细菌的质谱图与图谱库进行比较，就可确定细菌种属。

虽然目前已有报道，利用质谱技术和实时荧光定量PCR技术可以在二小时内快速鉴定血培养阳性标本的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌，但存在操作步骤繁琐、费用较高等缺陷，不适合临床广泛应用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种快速鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌的方法，鉴定一株细菌的平均时间为0.5分钟左右，具有较好的准确率和较为完善的种类鉴别。

为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种快速鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）建库用耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌的筛选

通过常规药物敏感性试验（vitek 2或BD Phonix100药敏板条）鉴定和筛选表型耐药或敏感的肺炎克雷伯菌，筛选后的耐碳青霉烯或敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenems resistant and sensitive Klebsiella pneumoniae，CRKP和CSKP）用KB（药敏纸片）法或E-test法复核。以美国临床和实验室标准协会（Clinical and laboratorystandard institute，CLSI）的药敏判断标准（CLSI-2021-M45）判断肺炎克雷伯杆菌是否耐亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类药物。

（2）所筛选耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药基因检测

利用PCR技术对所筛选CRKP菌株的KPC、IPM、NDM、VIM、OXA耐碳青霉烯酶基因进行检测，筛选有以上耐药基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株。

（3）样品制备

挑取已筛选的菌株（2-3个克隆菌落），放置于300μL无菌水中，加900μL无水乙醇，12000g离心3分钟后弃上清，加20μL甲酸，涡旋震荡3分钟后加20μL乙腈，放置3分钟，12000g离心3分钟后取1μL上清液均匀点靶，室温干燥后再取 1 μL 基质( HCCA) 覆盖，室温自然晾干后用于质谱检测。每个样品制备3个靶位。

（4）比较耐碳青霉烯、敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌及各种基因型的蛋白质谱条带差异

利用安图automs1000质谱仪器，应用 Flex Control 软件采集样品质谱数据。选择正离子线性操作模式，质量范围2000～20000，每个靶位采图3张，每张图轰击100次激光。将每个样品获得的9张图谱在flex analysis中打开，除去低质量的图谱，保留至少6张的有效图谱。

每次采集数据前都要用校准品进行质量校正，对耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株及各种基因型进行蛋白条带的质谱分析，寻找有明显特异性的差异蛋白质谱条带。

（5）建立不同肺炎克雷伯菌菌株的蛋白质谱条带差异数据库

采用常规自建库方法，将同一菌株的有效图谱创建为该菌株的预测波谱( mainspectral projection，MSP) ，本发明用已采集的916 株菌株的预测波谱构建数据库。

（6）用建立的质谱数据库进行临床鉴定

先（用 Flex Control 软件）采集待测菌株质谱数据；再用 MALDIBiotyper 3 软件中Biotyper MSP Identification StandardMethod 方法，选取已建好的标准数据库，调入待测菌株质谱数据进行匹配鉴定。

鉴定结果以对数值0 到10作为评判分数，分值≤2.999，为红色，表示未鉴定出；分值在3.000～4.999，为黄色，表示可能的属名鉴定；分值在5.000～7.000，为绿色，表示可靠的属名，可能的种名；分值在7.001～10.000，为绿色，表示高度可靠的种名。每株待测菌株的3次重复值取得分最高为鉴定结果。

本发明具有以下积极有益效果：

本发明以表型筛选为金标准，筛选耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌及各种基因型，通过特异性的差异蛋白质谱条带构建数据库。质谱鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的准确率为81.5%，鉴定一株细菌的平均时间为0.5分钟，鉴定20株细菌的平均鉴定时间为10分钟。

附图说明

图1 肺炎克雷伯杆菌的耐碳青霉烯药物基因筛选PCR电泳图；

图2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌和敏感肺炎克雷伯菌质谱差异峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所使用试剂除非特别说明，皆为市购常规试剂或原料，所使用的试验方法除非特别说明，皆为本领域常规方法。

实施例1

一种快速鉴定耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌的筛选

申请人医院建立了有河南省各地市150家医院参加的微生物联盟，具备充足的肺炎克雷伯菌株，筛选耐药候选研究菌株包括已分离的916株肺炎克雷伯菌。利用常规药物敏感性试验筛选得到313株CRKP和603株CSKP。

筛选肺炎克雷伯菌的药物敏感性表型试验，根据细菌对亚胺培南或美罗培南的最小抑菌浓度，按照以美国临床和实验室标准协会（Clinical and laboratory standardinstitute，CLSI）的药敏判断标准（CLSI-2021-M45）制定的折点来判断细菌的敏感或耐药，目前已有美国BD公司或法国梅里埃公司生产的商业化自动板条和自动化仪器；

（2） 碳青霉烯类药物耐药基因检测

利用PCR技术对这313株CRKP进行肺炎克雷伯菌所有耐药基因KPC、IPM、NDM、VIM、OXA的检测（见图1），筛选出各种耐药基因的肺炎克雷伯菌株。

用细菌基因组提取试剂盒，提取所筛选CRKP菌株的基因组DNA，用这些基因组DNA做模板，扩增CRKP的各种耐药基因KPC、IPM、NDM、VIM、OXA，得到CRKP的各种耐药基因型。所参考文献为Ellington MJ, Findlay J, Hopkins KL, Meunier D, Alvarez-Buylla A,Horner C, et al. MμLticentre evaluation of a real-time PCR assay to detectgenes encoding clinically relevant carbapenemases in cμLtured bacteria.

引物序列及退火温度

（3）样品制备

挑取已筛选的菌株（2-3个克隆菌落），放置于300μL无菌水中，加900μL无水乙醇，12000g离心3分钟后弃上清，加20μL甲酸，涡旋震荡3分钟后加20μL乙腈，放置3分钟，12000g离心3分钟后取1μL上清液均匀点靶，室温干燥后再取 1 μL 基质( HCCA) 覆盖，室温自然晾干后用于质谱检测。每个样品制备3个靶位。

（4）比较耐碳青霉烯、敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌及各种基因型的蛋白质谱条带差异

利用安图automs1000质谱仪器，应用 Flex Control 软件采集样品质谱数据。选择正离子线性操作模式，质量范围2000～20000，每个靶位采图3张，每张图轰击100次激光。将每个样品获得的9张图谱在flex analysis中打开，除去低质量的图谱，保留6张的有效图谱。

每次采集数据前都要用校准品进行质量校正，对耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株及各种基因型进行蛋白条带的质谱分析，寻找有明显特异性的差异蛋白质谱条带。

（5） 质谱自建数据库

由于原有的德国布鲁克质谱仪没有CRKP和CSKP的数据库，因此无法将CRKP和CSKP鉴定出来。申请人采用安图公司仪器的自建库方法，将同一菌株的6份有效图谱创建为该菌株的预测波谱( main spectral projection，MSP) ，用已采集的313 株耐药菌株和603敏感菌株的预测波谱构建成数据库。

（6）用建立的质谱数据库进行临床鉴定

先（用 Flex Control 软件）采集待测菌株质谱数据；再用 MALDIBiotyper 3 软件中Biotyper MSP Identification StandardMethod 方法，选取已建好的标准数据库，调入待测菌株质谱数据进行匹配鉴定。

鉴定结果以对数值0 到10作为评判分数，分值≤2.999，为红色，表示未鉴定出；分值在3.000～4.999，为黄色，表示可能的属名鉴定；分值在5.000～7.000，为绿色，表示可靠的属名，可能的种名；分值在7.001～10.000，为绿色，表示高度可靠的种名。每株待测菌株的3次重复值取得分最高为鉴定结果。

利用萃取方法和质谱技术分析了现有的经表型和基因型筛选过的110株CRKP和106株CSKP的质谱峰图，建立了CRKP和CSKP的差异峰图库，两种肺炎克雷伯菌株的差异峰图集中在在4179、4519、4734、5141 m/z，见图2，通过本发明鉴定之后的准确率为81.5%，鉴定一株细菌的平均时间为0.5分钟，鉴定20株细菌的平均鉴定时间为10分钟。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式。