人参总多糖的制备方法和应用、人参总多糖疫苗佐剂及其疫苗组合物

摘要

本申请提供一种人参总多糖的制备方法和应用、人参总多糖疫苗佐剂及其疫苗组合物。与现有技术相比，本申请的疫苗佐剂能显著地提高抗原免疫后的特异性抗体(或中和抗体)滴度，可以有效地增强狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗的免疫应答活性。本申请的疫苗佐剂，具有免疫效果好、使用方便等优点，为疫苗提供了新的佐剂选择。

说明书

技术领域

本申请属于医药领域，具体地，涉及人参总多糖的制备方法和应用、人参总多糖疫苗佐剂及其疫苗组合物。

背景技术

免疫佐剂是指能够非特异性改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的物质，要求无毒性、纯度高、有一定的吸附能力性质稳定。免疫佐剂的作用机理主要是可以增加抗原表面积，提高免疫原性；对抗原起缓释作用，延长抗原在组织中的滞留时间；促进炎症反应，刺激主动免疫应答。目前市售疫苗佐剂多为铝盐佐剂，但是铝盐可引起注射部位的炎症并刺激局部红斑、肉芽肿和皮下结节，同时，铝盐佐剂可能会延缓部分疫苗的中和抗体的产生，因此在应用时受到多种限制。

五加科植物人参主要含有皂苷、多糖、黄酮等多种活性成分，其根、根茎、叶等部位均有悠久的药用历史，具有补气、生津等功效。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本申请提供人参总多糖的制备方法和应用、人参总多糖疫苗佐剂及其疫苗组合物。经活性追踪及活性验证，本研究发现人参总多糖(GPS)具有很好的免疫佐剂活性，能够明显提升实验个体对特定疫苗的免疫反应。

具体来说，本申请涉及如下方面：

1.一种人参总多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将人参用水提取，得到第一提取物，

向第一提取物中加入蛋白酶培养后提取，得到第二提取物，

将第二提取物通过乙醇和水提取，得到人参粗多糖，

将人参粗多糖溶解后透析，并去除截留液中的蛋白质，

将去除蛋白质后的截留液使用乙醇提取，得到人参总多糖。

2.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为中性蛋白酶。

3.根据项1所述的制备方法，其特征在于，蛋白酶培养温度为30℃～40℃，培养时间为1～3h。

4.根据项1所述的制备方法，其特征在于，透析所采用的截取分子量为800～2500kDa，优选为1000～1500kDa。

5.根据项1所述的制备方法，其特征在于，使用Sevag试剂去除截留液中的蛋白质。

6.一种疫苗佐剂，其特征在于，包括人参总多糖。

7.根据项6所述的疫苗佐剂，其特征在于，还包括生理盐水或疫苗注射用水，进一步优选所述疫苗佐剂由人参总多糖和生理盐水或疫苗注射用水组成。

8.根据项6所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述人参总多糖是通过项1-5中任一项所述的制备方法得到。

9.一种疫苗组合物，其特征在于，包括项6-8中任一项所述的疫苗佐剂和疫苗抗原或编码所述抗原的DNA。

10.根据项8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括药用辅料和第二疫苗佐剂。

11.根据项8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗为狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗。

12.根据项9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述人参总多糖和疫苗抗原的用量比为(0.1～1000):(0.10～200)μg/IU或(0.1～1000)：(0.1～500)μg/μg，优选为10～500μ0～50或1～150μ～1IU。

13.根据项10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗类型为灭活病毒疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。

14.项6-8中任一项所述的疫苗佐剂在制备疫苗制剂、疫苗组合物中的用途。

与现有技术相比，本申请具有如下技术效果：

(1)本申请疫苗佐剂和疫苗组合物中的的活性成分GPS来自于天然植物，来源明确，资源丰富，且成分具有较好的安全性和稳定性。

(2)本申请的疫苗佐剂能显著地提高抗原免疫后的特异性抗体(或中和抗体)滴度，可以有效地增强狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗的免疫应答活性。

(3)本申请的疫苗佐剂，具有免疫效果好、使用方便、副作用低、可应用于多种疫苗(佐剂活性广泛)等优点，为疫苗提供了新的佐剂选择。

附图说明

图1为吸光度-葡萄糖含量标准曲线；

图2为吸光度-蛋白质含量标准曲线；

图3为GPS对狂犬疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图4为GPS对狂犬疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；

图5为GPS对流感疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；

图6为不同剂量GPS对流感疫苗免疫小鼠IgG抗体效价的影响；

图7为GPS对乙肝疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图8为GPS对甲肝疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；

图9为不同剂量GPS对甲肝疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；

图10为GPS对丙肝疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图11为GPS对手足口疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；

图12为GPS对手足口疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图13为不同剂量GPS对手足口疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；

图14为GPS对HPV疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图15为不同剂量GPS对HPV疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图16为GPS对新型冠状病毒疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

图17为不同剂量GPS对新型冠状病毒疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；

其中，*表示与阳性对照组相比，P<0.05；**表示与阳性对照组相比P<0.01；***表示与阳性对照组相比P<0.005；***表示与阳性对照组相比P<0.001；#表示与阴性对照组相比，P<0.05；##表示与阴性对照组相比P<0.01；###表示与阴性对照组相比P<0.005；表示与阴性对照组相比####P<0.001；&表示与同等剂量市售人参总多糖相比，P<0.05；％表示与同等剂量对比例1制备人参总多糖相比，P<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。

如本文所用，术语“疫苗“是指任何适于刺激动物或人类中的活性免疫性的抗原或致免疫性物质的制剂。

如本文所用，术语“佐剂＂，是指提高、增加、向上调节、改变或以其它方式促进动物中对抗原的免疫反应(例如，体液或细胞免疫反应)的任何物质或物质的混合物。

如本文所用，术语“抗原”是指当被引入至免疫活性的人或动物中时，刺激体液及/或细胞介导的免疫反应的任何物质。该抗原可为纯物质、物质的混合物或微粒物质(包括细胞、细胞片段或细胞衍生片段)或活的(通常经减毒)的生物或病毒。适当抗原的实例包括(但不限于)：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、肤、碳水化合物/多糖、脂多糖、毒素、病毒、细菌、真菌及寄生物。其它适当抗原包括抗原的最小组分，例如(但不限于)，抗原决定簇、表位或肤。仍然适当的其它抗原包括那些描述于美国专利笫5,855,894号中的抗原。抗原可以为天然(自然表达或制得)的、合成的，或由那些本领域的技术人员熟悉的重组DNA方法学所衍生的。

如本文所用，术语“药用辅料”指生产药品和调配处方时，为解决制剂的成型性、有效性、稳定性、安全性加入处方中除主药以外的一切药用物料的统称，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。本申请所述药用辅料可以是适当的载体或赋形剂、乳化剂、润湿剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、佐剂(例如氢氧化铝佐剂、油剂佐剂、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)等。

如本文所用，术语“人参多糖”是指从五加科植物人参中提取的总多糖。在本申请中，与术语“人参总多糖”的含义相同，可以互换使用。人参总多糖可以通过本领域已知的方法制备得到，也可以通过商业途径购买得到，也可以通过本申请提供的人参总多糖的制备方法制备得到。

本申请提供的人参总多糖的制备方法，包括以下步骤：

将人参用水提取，得到第一提取物，

向第一提取物中加入蛋白酶培养后提取，得到第二提取物，

将第二提取物通过乙醇和水提取，得到人参粗多糖，

将人参粗多糖溶解后透析，并去除截留液中的蛋白质，

将去除蛋白质后的截留液使用乙醇提取，得到人参总多糖。

在一个具体的实施方式中，得到第一提取物的步骤包括：

干燥的人参根1kg粉碎至10-20目，加入8倍量水(g:mL)，沸水浴煮8h，过滤并收集滤液；向滤渣中继续加入10倍量水(g:mL)，沸水浴加热8h。合并两次滤液，6000rpm离心10min。取上清蒸干，得到第一提取物。

在一个具体的实施方式中，得到第二提取物的步骤中，蛋白酶培养温度为30℃～40℃，培养时间为1～3h。

在一个具体的实施方式中，得到第二提取物的步骤包括：

向第一提取物加入中性蛋白酶，40℃培养3h，后以100℃灭活30min，将混合溶液以10000rpm离心，得到上清液，蒸干，得到第二提取物。

在一个具体的实施方式中，得到人参粗多糖的步骤包括：

将第二提取物使用10倍体积的95％的乙醇低温浸泡2.0h。过滤，取滤渣，加2倍体积的蒸馏水溶解，沸水回流提取3次，每次1.0h，120目尼龙布过滤，合并提取液，浓缩至500mL，离心20分钟(5000rpm)，弃去沉淀。向上清液加入95％的乙醇至乙醇终浓度为90％，静置1h。离心20分钟(5000转/分钟)，收集沉淀，再向沉淀中加入400mL蒸馏水，再向上清液加入95％的乙醇至终浓度为80％，静置1h，离心20分钟(5000转/分钟)，室温静置过夜，收集沉淀。次日，将沉淀依次用无水乙醇、95％乙醇洗涤两次。并冷冻干燥得人参粗多糖，

在一个具体的实施方式中，透析所采用的截取分子量为800～2500kDa，优选为1000～1500kDa。

在一个具体的实施方式中，使用Sevag试剂去除截留液中的蛋白质。

在一个具体的实施方式中，将人参粗多糖溶解后透析，并去除截留液中的蛋白质的步骤包括：

将人参粗多糖配制备成30％的水溶液，加入1000kDa透析袋进行透析，静置过夜。取透析袋内液体，向其中加入1/4体积的Sevag试剂，静置离心后除去凝胶状沉淀。重复上述操作5次。

在一个具体的实施方式中，将去除蛋白质后的截留液使用乙醇提取，得到人参总多糖的步骤包括：

合并去除蛋白质的截留液上清液，减压浓缩除去有机试剂。加入95％的乙醇至终浓度为80％，4℃静置过夜，离心，除上清。沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤两次。冷冻干燥得人参总多糖。

通过本申请的方法制备得到的人参总多糖中多糖含量超过95％，蛋白质含量较低(约为1％)。与目前市售总多糖相比，具有多糖含量高、蛋白杂质极少、佐剂活性更强的特点。

本申请还提供一种包括人参总多糖的疫苗佐剂。

在一个具体的实施方式中，该疫苗佐剂还可以包括生理盐水或疫苗注射用水。其中，人参总多糖的含量可以根据实际需要进行调整。

在一个具体的实施方式中，所述疫苗佐剂由人参总多糖组成。

在一个具体的实施方式中，所述疫苗佐剂由人参总多糖和生理盐水或疫苗注射用水组成。

在一个具体的实施方式中，所述人参总多糖是通过上述人参总多糖的制备方法得到。

本申请还提供一种疫苗组合物，包括本申请中含有人参总多糖的任一种的疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA。

所述疫苗组合物中疫苗佐剂的用量为以起到治疗效果的有效量，所述有效量是提高、增加、向上调节、改变或以其它方式促进对抗原的免疫反应的量。具体地说，治疗有效量是诱导易感于由病原体、癌细胞或过敏原引起的疾病的动物中的免疫性的量。如本领域的技术人员将了解，治疗有效量将有所不同且在个案的基础上进行判定，在本申请中，不特别限制疫苗佐剂和疫苗抗原的剂量，并且根据给药方法、受试者、受试者的年龄、剂型、给药路线等适当地选择。

在一个具体的实施方式中，所述的人参总多糖与疫苗抗原的用量比为(0.1μg～1000μg)GAPS：(0.10IU～200IU)抗原，例如可以为0.1μg：0.10IU、0.1μg：200IU、1000μg：0.10IU、1000μg：200IU；或者

(0.1μg～1000μg)GAPS：(0.1μg～500μg)抗原，例如可以为0.1μg：0.1μg、0.1μg：500μg、1000μg：0.1μg、1000μg：500μg。

在一个具体的实施方式中，所述人参总多糖和疫苗抗原的用量比为10～500μg/μg。

在一个具体的实施方式中，所述人参总多糖和疫苗抗原的用量比为1～150μ～/IU。

本领域的技术人员将易于认识到，治疗剂量及治疗长度可依待治疗患者的种类、重量及病症、其对疫苗组合物的个体反应及所选择的特定给药途径的不同而发生改变。在一些情况下，低于前述范围的下限的剂量水平可以是治疗有效的，而在其它情形下，可采用仍然较大的剂量而不引起任何有害副作用，其条件为，将此等较大剂量首先分为数个小剂量以在一天内给药。无论何时可能发生继发应激或曝露，认为激发剂量是理想的。

本申请的疫苗组合中的疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以共同包含在一个组合物中并且可以在单独的组合物中配制，在单独的组合物中配制时，疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA的给药路线可以相同或不同。在本申请中，疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以同时给予或有时间差异地给予，即，疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以同时或分开给予(例如，疫苗佐剂在给予疫苗抗原之前或之后给予)。疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以作为包含它们的试剂盒提供。但是从降低患者负担的角度，优选疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA包含在一个组合物中，使得在给药时可以同时给予。无论是共给药或同时给药，所述疫苗组合物的给药模式均可为任何适当途径，该途径无论是在共给药或同时给药情况下，均将所述疫苗组合物输送至宿主。

一种优选的实施方式中，本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物还包括药用辅料和第二疫苗佐剂。

所述药用辅料如前所述。

本申请的疫苗佐剂可作为疫苗制剂的一部份给药，其任选含有额外的第二疫苗佐剂。所述第二疫苗佐剂是不同于本申请的人参总多糖佐剂的其他佐剂，可以是一种或者两种以上，适当的第二疫苗佐剂的实施例包括那些本领域中已知的佐剂，

本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可进一步包含一种或多种抗氧化剂，所述一种或多种抗氧化剂选自由以下各物组成的组：亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、次硫酸甲酪钠、L-抗坏血酸、异抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、单硫代丙三醇、琉基乙酸、硫代乳酸、硫脉、二硫苏糖醇、二硫赤鲜醇、谷胱甘肤、抗坏血酸棕桐酸酣、丁基化胫基苗香醒、丁基化轻基甲苯、去甲二氢愈创木酸、没食子酸丙酣、a-生育酚，以及其混合物。

本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可进一步包含一种或多种防腐剂，适当防腐剂的实例包括(但不限于)：苯扎氯绥、爷索氯绥、苯甲酸、爷醇、对轻基苯甲酸甲酣、对轻基苯甲酸乙酣、对轻基苯甲酸丙酣、对轻基苯甲酸丁酣、苯甲酸钠、苯酚，以及其混合物。如本领域的技术人员将了解，防腐剂的存在与否将依抗原而定。举例来说，若抗原是活细菌抗原，则无需添加防腐剂。

本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可用于预防或治疗人类或动物中由病原体、癌细胞或过敏原引起的疾病，其通过对易感于该疾病的人或动物给予治疗有效量的佐剂组合物或疫苗。

根据本申请，该病原体可为任何病原体，其包括(但不限于)：细茵、原生动物、蠕虫、病毒及真菌。通过所述病原体引起的动物中的疾病包括(但不限于)：牛呼吸道疾病、猪呼吸道疾病、肺炎、巴斯德菌病、球虫病、无形体病、及感染性角膜炎。

根据本申请，该癌细胞可为本领域中任何类型的癌细胞。根据本申请，该过敏原可为本领域中已知的任何过敏原。

例如，本申请的疫苗组合物可以是狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗等。

在一个具体的实施方式中，对于流感疫苗，所述人参总多糖和疫苗抗原的质量比为83.3～333.3μg/μg。

在一个具体的实施方式中，对于甲肝疫苗，所述人参总多糖和疫苗抗原的质量比为5～100μg/IU。

在一个具体的实施方式中，对于手足口疫苗，所述人参总多糖和疫苗抗原的质量比为1.25～12.5μg/IU。

在一个具体的实施方式中，对于HPV疫苗，所述人参总多糖和疫苗抗原的质量比为12.5～125μg/IU。

在一个具体的实施方式中，对于新型冠状病毒疫苗，所述人参总多糖和疫苗抗原的质量比为10～50μg/μg。

本申请的疫苗组合物的疫苗类型可以为灭活病毒疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗等。

本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可用于保护或治疗人类和诸如牲畜及家畜动物的非人类动物，包括(但不限于)牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、猫、狗及需要治疗的其它哺乳动物。优选的，本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物用于保护或治疗人类。如本领域的技术人员所了解，可基于待保护或治疗的患者来选择待给药的本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物。

本申请的组合物可以通过通用方法来制备，其中加入一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体，例如，呈口服药物形式，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等，或肠胃外药物，例如外用药物、栓剂、注射剂、滴眼剂、鼻内剂、经肺剂等。制剂的优选的实例包括可注射的或鼻内溶液剂，或通过冻干所述溶液剂而制备的冻干的制剂。

可注射的溶液剂的实例包括包含水性溶液和油质组合物的乳剂和脂质体，例如疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA溶解或分散在水中的水性溶液剂制剂或水性混悬剂制剂，或疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA溶解或分散在油中的油质溶液剂制剂或油质混悬剂制剂。

水性溶液剂、水性溶液剂制剂或水性混悬剂制剂的实例包括包含用于注射的蒸馏水并任选包含缓冲液、pH调节剂、稳定剂、等渗剂和/或乳化剂的水性溶液剂或水性混悬剂等。

本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可通过经口、肌肉内、静脉内、皮下、眼内、肠胃外、局部、阴道内或直肠途径给予本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物。对于对牛、猪或其它家畜的给药，可以饲料或作为灌服组合物经口给药所述佐剂组合物或疫苗佐剂。一种优选的实施方式中，以经肌肉内、静脉内或皮下注射本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物。

本申请还提供上述的任意一种疫苗佐剂在制备疫苗制剂、疫苗组合物中的用途。

实施例

实验材料

铝盐佐剂：禾大Croda公司生产

实施例1

人参总多糖的制备：

取干燥的人参根1kg粉碎至10-20目，加入8倍量水(g:mL)，沸水浴煮8h，过滤并收集滤液；向滤渣中继续加入10倍量水(g:mL)，沸水浴加热8h。合并两次滤液，6000rpm离心10min。取上清蒸干，向提取物加入中性蛋白酶(Neutrase，酶浓度800U/g

10倍体积的95％的乙醇低温浸泡2.0h。过滤，取滤渣，加2倍体积的蒸馏水溶解，沸水回流提取3次，每次1h，120目尼龙布过滤，合并提取液，浓缩至500mL，离心20分钟(5000rpm)，弃去沉淀。向上清液加入95％的乙醇至乙醇终浓度为90％，静置1h。离心20分钟(5000转/分钟)，收集沉淀，再向沉淀中加入400mL蒸馏水，再向上清液加入95％的乙醇至终浓度为80％，静置1h，离心20分钟(5000转/分钟)，室温静置过夜，收集沉淀。

次日，将沉淀依次用无水乙醇、95％乙醇洗涤两次。并冷冻干燥得人参粗多糖，将其配置成30％的水溶液，加入1000kDa透析袋进行透析，静置过夜。取透析袋内液体，向其中加入1/4体积的Sevag试剂，静置离心后除去凝胶状沉淀。重复上述操作5次，合并上清液，减压浓缩除去有机试剂，加入95％的乙醇至终浓度为80％，4℃静置过夜，离心，除上清。沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤两次。冷冻干燥得人参总多糖。

对比例1

“对比用人参总多糖”的制备：

取干燥的人参根1kg粉碎至10-20目，加入8倍量水(g:mL)，沸水浴煮8h，过滤并收集滤液；向滤渣中继续加入10倍量水(g:mL)，沸水浴加热8h。合并两次滤液，6000rpm离心10min，取上清蒸干。8倍体积的95％的乙醇低温浸泡2.0h。过滤，取滤渣，加2倍体积的蒸馏水溶解，沸水回流提取3次，每次1h，120目尼龙布过滤，合并提取液，浓缩至500mL，离心20分钟(5000rpm)，弃去沉淀。向上清液加入95％的乙醇至乙醇终浓度为90％，静置1h。离心20分钟(5000转/分钟)，收集沉淀，再向沉淀中加入400mL蒸馏水，再向上清液加入95％的乙醇至终浓度为80％，静置1h，离心20分钟(5000转/分钟)，室温静置过夜，收集沉淀。

次日，将沉淀用95％乙醇洗涤两次。并冷冻干燥得人参粗多糖，将其配置成30％的水溶液，加入1000kDa透析袋进行透析，静置过夜。取透析袋内液体，取透析袋内液体，向其中加入1/4体积的Sevag试剂，静置离心后除去凝胶状沉淀。重复上述操作5次，合并上清液，减压浓缩除去有机试剂，加入95％的乙醇至终浓度为80％，4℃静置过夜，离心，除上清。沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤两次。冷冻干燥得人参总多糖。

多糖含量测定

应用苯酚-硫酸法测定人参总多糖及其酸性多糖的含量。以不同浓度的葡萄糖为横坐标，以在OD 490nm的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，根据葡萄糖标准曲线和样品吸光度计算多糖含量。实施例1的人参总多糖的多糖含量为95.8％。同法测定对比例1的“对比用人参总多糖”含量，其含量为91.3％。同法测定市售人参总多糖含量，其含量为90％。

蛋白质含量测定

人参总多糖及其酸性多糖中蛋白质含量的测定采用Bradford法。以牛血清白蛋白为横坐标，以在OD 595nm为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示，根据牛血清白蛋白标准曲线和样品吸光度计算蛋白质含量。实施例1的人参总多糖的蛋白质含量为1.1％。同法测定对比例1的“对比用人参总多糖”蛋白质含量，其含量为2.5％。同法测定市售人参总多糖含量(嘉叶生物科技有限公司，JY2021062A)，其含量为3.9％。

以下实施例中如没有特殊说明，GPS均指实施例1制备的人参总多糖。

实施例2：人参总多糖(GPS)对狂犬疫苗的免疫佐剂活性

狂犬疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的人参总多糖(GPS)和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例制1备得到的GPS和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250mg的铝盐及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：

小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫一周后，进行第二次免疫。第二次免疫后14天采集各组小鼠血清，每份血清分别通过RFFIT、ELISA法检测其中的中和抗体及IgG特异性抗体效价。

实验分组及剂量：

GPS高剂量佐剂组：0.25IU狂犬疫苗+250μg GPS/只；

GPS低剂量佐剂组：0.25IU狂犬疫苗+25μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：0.25IU狂犬疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：0.25IU狂犬疫苗/只。

结果：

如图3和图4所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能提升狂犬疫苗接种小鼠体内的IgG抗体水平及中和抗体水平。与铝盐阳性对照组相比，高、低剂量的GPS(250μg、25μg)均能显著提升狂犬疫苗小鼠的IgG抗体水平及中和抗体水平(P<0.1)。

实施例3：人参总多糖(GPS)对流感疫苗的免疫佐剂活性

流感疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

GPS：实施例1和对比例1制备的GPS，同时选取市售人参总多糖(嘉叶生物科技有限公司，JY2021062A)。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂(市售人参总多糖)-疫苗组合物”：分别量取市售GPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

高剂量“佐剂(对比例1制备人参总多糖)-疫苗组合物”：分别量取对比例1所制备GPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂(市售人参总多糖)-疫苗组合物”：分别量取市售GPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：

小鼠随机分成7组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫1周后，进行第2次免疫。第2次免疫后的第14天，采集每只小鼠的血液，并通过血凝抑制实验检测小鼠血清流感疫苗的中和抗体水平。

实验分组与剂量：

市售GPS高剂量佐剂组:1.5μg流感疫苗+250μg市售GPS/只；

对比例1制备GPS高剂量佐剂组:1.5μg流感疫苗+250μg对比例1制备GPS/只；

GPS高剂量佐剂组:1.5μg流感疫苗+250μg GPS/只；

市售GPS低剂量佐剂组:1.5μg流感疫苗+25μg市售GPS/只；

GPS低剂量佐剂组:1.5μg流感疫苗+25μg GPS/只；

铝盐阳性对照组:1.5μg流感疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组:1.5μg流感疫苗/只。

结果：

如图5所示，与阴性对照组相比，高剂量GPS能显著提高流感疫苗接种小鼠体内的抗体水平(P<0.0001)。同时，与阳性对照组(铝盐佐剂)相比，高剂量GPS(250μg/只)能显著提升流感疫苗接种小鼠血液的中和抗体水平(P＜0.001)。同等剂量下，通过本申请方法制备的GPS，其佐剂活性显著高于高剂量市售GPS(P<0.05)及对比例1所制备GPS(P<0.05)。

实施例4：人参总多糖(GPS)作为流感疫苗佐剂的最佳用量

制备“佐剂-疫苗组合物”：

“佐剂-疫苗组合物”：分别量取GPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液，使每毫升溶液中分别含有250、1250、2500、5000、10000μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，组合物中GPS佐剂与流感疫苗之比分别为16.7、83.3、166.7、333.3、666.7(μg:μg)。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

实验分组与剂量：

GPS佐剂组1:1.5μg流感疫苗+25μg GPS/只；

GPS佐剂组2:1.5μg流感疫苗+125μg GPS/只；

GPS佐剂组3:1.5μg流感疫苗+250μg GPS/只；

GPS佐剂组4:1.5μg流感疫苗+500μg GPS/只；

GPS佐剂组5:1.5μg流感疫苗+1000μg GPS/只；

铝盐阳性对照组:1.5μg流感疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组:1.5μg流感疫苗/只。

结果：

如图6所示，使用不同剂量的GPS作为佐剂给药，可发现，对于流感疫苗，GPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组，GPS佐剂组5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但其显著低于佐剂组3、4，且对于多糖的用量更大。综上所述，在GPS作为流感疫苗的佐剂使用时，在GPS与疫苗的用量之比为83.3～333.3(μg:μg)时效果最佳。

实施例5：人参总多糖(GPS)对乙肝疫苗的免疫佐剂活性

乙肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：

小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第2次免疫。第2次免疫后第14天，采集小鼠血液，并通过ELISA实验检测小鼠血清乙肝抗体水平。

实验分组及剂量：

GPS高剂量佐剂组:2.5μg乙肝疫苗+250μg GPS/只；

GPS低剂量佐剂组:2.5μg乙肝疫苗+25μg GPS/只；

铝盐阳性对照组:2.5μg乙肝疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组:2.5μg乙肝疫苗/只。

结果：

如图7所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能显著提高乙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.001)。同时，与阳性对照组(铝盐佐剂)相比，高剂量GPS(250μg/只)能显著提升乙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P＜0.0001)，低剂量GPS(25μg/只)对乙肝疫苗的佐剂活性与铝盐的效果相似。

实施例6：人参总多糖(GPS)对甲肝疫苗的佐剂活性

二倍体甲肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的人参总多糖(GPS)和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：

小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中中和抗体水平。

实验分组及剂量：

GPS高剂量佐剂组：5IU甲肝疫苗+250μg GPS/只；

GPS低剂量佐剂组：5IU甲肝疫苗+25μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：5IU甲肝疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：5IU甲肝疫苗/只。

结果：

如图8所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能显著提高甲肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.01)。同时，与铝盐对照组相比，高、低剂量GPS(250μg/只)能显著提升甲肝疫苗小鼠的中和抗体水平(P＜0.05)。

实施例7：人参总多糖(GPS)作为甲肝疫苗佐剂的最佳用量

制备“佐剂-疫苗组合物”：

“佐剂-疫苗组合物”：分别量取GPS和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液，使每毫升溶液中分别含有125、250、2500、5000、10000μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，组合物中GPS佐剂与甲肝疫苗之比分别为2.5、5、50、100、200(μg:IU)。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

实验分组及剂量：

GPS佐剂组1:5IU甲肝疫苗+12.5μg GPS/只；

GPS佐剂组2:5IU甲肝疫苗+25μg GPS/只；

GPS佐剂组3:5IU甲肝疫苗+250μg GPS/只；

GPS佐剂组4:5IU甲肝疫苗+500μg GPS/只；

GPS佐剂组5:5IU甲肝疫苗+1000μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：5IU甲肝疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：5IU甲肝疫苗/只。

结果：

如图9所示，使用不同剂量的GPS作为佐剂给药，可发现，对于甲肝疫苗，GPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阴性对照组相比，GPS佐剂组5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但显著低于佐剂组3、4，且对于多糖的用量更大。综上所述，在GPS作为甲肝疫苗的佐剂使用时，在GPS与疫苗的用量之比为5～100(μg:IU)时效果最佳。

实施例8：人参总多糖(GPS)对丙肝疫苗的佐剂活性

丙肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有5000μg的GPS及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的GPS及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的铝盐及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：

小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。

实验分组：

GPS高剂量佐剂组：5μg丙肝疫苗+500μg GPS/只；

GPS低剂量佐剂组：5μg丙肝疫苗+50μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：5μg丙肝疫苗+50μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：5μg丙肝疫苗/只。

结果：

如图10所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能显著提高丙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.001)。同时，与铝盐阳性对照组相比，高剂量GAPS(500μg/只)、低剂量GAPS(50μg/只)能显著提升丙肝疫苗小鼠的IgG抗体水平(P＜0.05)。

实施例9：人参总多糖(GPS)手足口疫苗的佐剂活性

手足口疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中和抗体及特异性抗体IgG的水平。

实验分组：

GPS高剂量佐剂组:20IU手足口疫苗+250μg GPS；

GPS低剂量佐剂组:20IU手足口疫苗+25μg GPS；

铝盐阳性对照组:20IU手足口疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组:20IU手足口疫苗/只。

结果：

如图11和图12所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能显著提高手足口疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.05)。同时，与铝盐阳性对照组相比，高剂量GPS(250μg/只)、低剂量GPS(25μg/只)能显著提升手足口疫苗接种小鼠体内中和抗体、IgG抗体水平(P＜0.01)。

实施例10：人参总多糖(GPS)作为手足口疫苗佐剂的最佳用量

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取GPS和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液，使每毫升溶液中分别含有125、250、1250、2500、5000μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，组合物中GPS佐剂与手足口疫苗之比分别为0.625、1.25、6.25、12.5、25(μg:IU)。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

实验分组及剂量：

GPS佐剂组1:20IU手足口疫苗+12.5μg GPS/只；

GPS佐剂组2:20IU手足口疫苗+25μg GPS/只；

GPS佐剂组3:20IU手足口疫苗+125μg GPS/只；

GPS佐剂组4:20IU手足口疫苗+250μg GPS/只；

GPS佐剂组5:20IU手足口疫苗+500μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：20IU手足口疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：20IU手足口疫苗/只。

结果：

如图13所示，使用不同剂量的GPS作为佐剂给药，可发现，对于手足口疫苗，GPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阴性对照组相比，GPS佐剂组1、5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但显著低于佐剂组2～4。综上所述，在GPS作为手足口疫苗的佐剂使用时，在GPS与疫苗的用量之比为1.25～12.5(μg:IU)时效果最佳。

实施例11:人参总多糖(GPS)对HPV疫苗的佐剂活性

HPV疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。

实验分组及剂量：

GPS高剂量佐剂组:2μg HPV疫苗+250μg GPS/只；

GPS高剂量佐剂组:2μg HPV疫苗+25μg GPS/只；

铝盐阳性对照组:2μg HPV疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组:2μg HPV疫苗/只。

结果：

如图14所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能显著提高HPV疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.001)。同时，与铝盐阳性对照组相比，高剂量GPS(250μg/只)、低剂量GPS(25μg/只)能显著提升HPV疫苗接种小鼠体内IgG抗体水平(P＜0.01)。

实施例12：人参总多糖(GPS)作为HPV疫苗佐剂的最佳用量

制备“佐剂-疫苗组合物”：

“佐剂-疫苗组合物”：分别量取GPS和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液，使每毫升溶液中分别含有125、250、1250、2500、5000μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，组合物中GPS佐剂与HPV疫苗之比分别为6.25、12.5、62.5、125、250(μg:μg)。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

实验分组及剂量：

GPS佐剂组1:2μg HPV疫苗+12.5μg GPS/只；

GPS佐剂组2:2μg HPV疫苗+25μg GPS/只；

GPS佐剂组3:2μg HPV疫苗+125μg GPS/只；

GPS佐剂组4:2μg HPV疫苗+250μg GPS/只；

GPS佐剂组5:2μg HPV疫苗+500μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：2μg HPV疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：2μg HPV疫苗/只。

结果：

如图15所示，使用不同剂量的GPS作为佐剂给药，可发现，对于HPV疫苗，GPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阴性对照组相比，GPS佐剂组1、5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但显著低于佐剂组2～4。综上所述，在GPS作为HPV疫苗的佐剂使用时，在GPS与疫苗的用量之比为12.5～125(μg:μg)时效果最佳。

实施例13:人参总多糖(GPS)对新型冠状病毒疫苗(新冠疫苗)的佐剂活性

新冠疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。

动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

制备“佐剂-疫苗组合物”：

高剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的人参总多糖(GPS)和新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有5000μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

低剂量“佐剂-疫苗组合物”：分别量取上述实施例1制备得到的GPS和新冠疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和新冠疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的铝盐及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

免疫方案：小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。

实验分组及剂量：

GPS高剂量佐剂组:5μg新冠疫苗+500μg GPS/只；

GPS低剂量佐剂组:5μg新冠疫苗+50μg GPS/只；

铝盐阳性对照组:5μg新冠疫苗+50μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组:5μg新冠疫苗/只。

结果：

如图15所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GPS均能显著提高新冠疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.01)。同时，与铝盐阳性对照组相比，高剂量GPS(500μg/只)、低剂量GPS(50μg/只)能显著提升新冠疫苗接种小鼠体内IgG抗体水平(P<0.01，P＜0.05)。

实施例14：人参总多糖(GPS)作为新型冠状病毒疫苗(新冠疫苗)佐剂的最佳用量

制备“佐剂-疫苗组合物”：

“佐剂-疫苗组合物”：分别量取GPS和新冠疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液，使每毫升溶液中分别含有250、500、2500、5000、10000μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，组合物中GPS佐剂与新冠疫苗之比分别为6.25、12.5、62.5、125、250(μg:μg)。

阳性对照铝盐的“佐剂-疫苗组合物”：分别量取铝盐和新冠疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。

实验分组及剂量：

GPS佐剂组1:5μg新冠疫苗+25μg GPS/只；

GPS佐剂组2:5μg新冠疫苗+50μg GPS/只；

GPS佐剂组3:5μg新冠疫苗+250μg GPS/只；

GPS佐剂组4:5μg新冠疫苗+500μg GPS/只；

GPS佐剂组5:5μg新冠疫苗+1000μg GPS/只；

铝盐阳性对照组：5μg新冠疫苗+25μg铝盐佐剂/只；

阴性对照组：5μg新冠疫苗/只。

结果：

如图15所示，使用不同剂量的GPS作为佐剂给药，可发现，对于新冠疫苗，GPS佐剂组2、3小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阴性对照组相比，GPS佐剂组1、4、5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但显著低于佐剂组2～4。综上所述，在GPS作为新冠疫苗的佐剂使用时，在GPS与疫苗的用量之比为10～50(μg:μg)时效果最佳。