细胞因子作为标志物在制备用于辅助判断肺结核病理损伤或肺结核治疗预后产品中的应用

摘要

本发明公开了一种细胞因子作为标志物在制备用于辅助判断肺结核病理损伤或肺结核治疗预后产品中的应用，涉及传染病检测技术领域。细胞因子包括IL‑2Rα，以及IL‑1Rα和eotaxin两者中的至少一种。本发明提供的细胞因子组合可以在一定程度上反应患者体内的病原菌的感染情况，可用于评价肺结核病理损伤程度以及早期预测结核病治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及传染病检测技术领域，具体而言，涉及细胞因子作为标志物在制备用于辅助判断肺结核病理损伤或肺结核治疗预后产品中的应用。

背景技术

结核病是当前人类面临的严重公共卫生安全威胁之一，也是单一传染病中死亡人数最多的疾病。世界卫生组织(WHO)最新的全球结核病报告数据显示：2020年全球新发结核病患者约987万，发病率为127/10万。因此，指定合理有效的化疗方案是成功治疗结核病的关键。然而，缺少早期、可靠的抗结核疗效评价指标是一直是结核病临床治疗中的难题。

结核病治疗周期长，至少需要6个月，而耐药结核病的治疗经常需要1-2年。目前，临床最常使用患者症状体征、影像学检查及细菌学检查等指标来评价抗结核疗效。由于观察这些指标具有耗时或是易受主观因素影响等缺点，难以进行早期、准确地疗效评价。而无法及时发现治疗效果不佳的患者，有可能会导致耐药的产生，并增加疾病传播风险。近年来，寻找早期预测结核病疗效和预后的诊断标识物，一直是结核病研究领域的热点。其中，不乏以细胞因子为对象的研究，但关于监测患者血清中细胞因子动态变化作为疗效评价指标的研究比较少见，临床急需建立早期预测结核病治疗效果的指标。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞因子作为标志物在制备用于辅助判断肺结核病理损伤或肺结核治疗预后产品中的应用，以评价肺结核病理损伤程度以及早期预测肺结核病治疗效果。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种细胞因子作为标志物在制备用于辅助判断肺结核病理损伤或肺结核治疗预后产品中的应用，细胞因子包括IL-2Rα，以及IL-1Rα和eotaxin两者中的至少一种。

发明人经过对治疗前和抗肺结核治疗早期肺结核病患者血清中30种细胞因子的水平进行跟踪检测，发现IL-1Rα、IL-2Rα和eotaxin在预后良好组与预后不良组间除了绝对浓度存在显著性差异之外，预后不佳组还显示出上述三种细胞因子水平有明显的下降趋势。因此，肺结核患者在早期治疗过程中细胞因子IL-1Rα、IL-2Rα和eotaxi的浓度变化趋势与疗效密切相关，可以应用于肺结核的早期疗效预测。

由于细胞因子可反应机体在肺结核菌感染后的免疫状态，并随着病原菌的感染情况和严重程度发生变化，因此可以在一定程度上反应患者体内的病原菌的感染情况。同时，细胞因子水平在不同个体间存在较大的差异，单一时间点的定量指标往往不可客观的反应机体的感染情况。因此，发明人重点关注细胞因子水平的动态变化，有助于极大程度消除不同个体间的基线差异。

上述细胞因子例如选自IL-2Rα和IL-1Rα的组合，或IL-2Rα和和eotaxin的组合，或IL-1Rα、IL-1Rα和eotaxin的组合。

一种可选的实施方式中，本发明还提供了一种检测血清或血液中的IL-1Rα、IL-1Rα和eotaxin中的至少两种细胞因子的含量的试剂在制备用于辅助判断肺结核病理损伤或肺结核治疗预后产品中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述治疗预后包括如下至少一种情形：

若抗肺结核治疗早期的患者血清中的IL-2Rα水平比治疗前下降，则预判治疗预后不良；

若抗肺结核治疗早期的患者血清中的IL-2Rα水平比治疗前无明显变化，则预判治疗预后良好；

若抗肺结核治疗早期的患者血清中的IL-1Rα水平比治疗前下降，则预判治疗预后不良；

若抗肺结核治疗早期的患者血清中的IL-1Rα水平比治疗前无明显变化，则预判治疗预后良好；

若抗肺结核治疗早期的患者血清中的eotaxin水平比治疗前下降，则预判治疗预后不良；

若抗肺结核治疗早期的患者血清中的eotaxin水平比治疗前无明显变化，则预判治疗预后良好。

上述下降包括不限于：相较于治疗前，细胞因子的水平略有下降、显著下降或大幅下降。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述诊断或治疗预后产品选自试剂、试剂盒或芯片。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述诊断或治疗预后产品选自芯片。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述诊断或治疗预后产品选自液相芯片。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗肺结核治疗早期是指肺结核治疗后1-4周。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述采用受试者工作特征曲线，从肺结核患者中鉴别预后不佳和预后良好，IL-2Rα水平降低的曲线下面积为0.649，IL-1Ra水平降低的曲线下面积为0.86，eotaxin水平降低曲线下面积为0.728。

经过实验证实，本发明筛选出的细胞因子作为肺结核早期疗效评价的标志物时，具有较高的灵敏性，尤其是将三种细胞因子联合进行疗效评价，灵敏度超过83％，特异性超过77％，表明这三种因子的变化水平可以作为肺结核早期疗效评价的特异性标志物。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述IL-2Rα，IL-1Rα和eotaxin在治疗早期(4周)的水平下降均与肺结核病理损伤严重程度呈正相关。例如IL-2Rα，IL-1Rα和eotaxin的含量下降越多，预后越差，肺部损伤越严重，细菌载量越高。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述血清中IL-2Rα，IL-1Rα和eotaxin在治疗早期(4周)的水平下降均与肺结核患者痰结核菌的荷菌量呈正相关。例如IL-2Rα，IL-1Rα和eotaxin的含量下降越少，预后越好，肺部损伤缓解，细菌载量越低。

细胞因子可反应机体在结核菌感染后的免疫状态，并随着病原菌的感染情况和严重程度发生变化，因此可以在一定程度上反应患者体内的病原菌的感染情况。

本发明具有以下有益效果：

本发明经过对治疗前和抗结核治疗早期肺结核病患者血清中30种细胞因子的水平进行跟踪检测，发现IL-1Rα、IL-2Rα和eotaxin在预后良好组与预后不良组间除了绝对浓度存在显著性差异之外，预后不佳组还显示出上述三种细胞因子水平有明显的下降趋势。因此，结核患者在早期治疗过程中细胞因子IL-1Rα、IL-2Rα和eotaxi的浓度变化趋势与疗效密切相关，可以应用于结核的早期疗效预测。

由于细胞因子可反应机体在结核菌感染后的免疫状态，并随着病原菌的感染情况和严重程度发生变化，因此，本发明提供的细胞因子组合可以在一定程度上反应患者体内的病原菌的感染情况。用于评价肺结核病理损伤程度以及早期预测结核病治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为IL-2Rα在57例肺结核患者血清中的表达水平结果图；

图2为IL-1Rα在32例肺结核患者血清中的表达水平结果图；

图3为eotaxin在35例肺结核患者血清中的表达水平结果图；

图4为IL-2Rα作为标志物后的ROC曲线图；

图5为IL-1Ra作为标志物后的ROC曲线图；

图6为eotaxin作为标志物后的ROC曲线图；

图7为三种细胞因子联合作为标志物后的ROC曲线分析结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例进行肺结核患者的血清样本收集

(1)纳入和排除标准

肺结核患者纳入标准：①年龄为18-65周岁，性别不限；②临床诊断为肺结核病；③初治患者在此次治疗前6个月内未服用抗结核药物；耐药结核病计划执行新治疗方案前；④自愿作为受试对象；⑤经首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准，签署知情同意书；⑥HIV阴性。排除标准：①患有严重基础疾病或免疫疾病者；②合并其它部位结核的患者；③长期服用激素或其他免疫抑制剂者；④其他需要排除的情况。

(2)诊断标准

参照《肺结核诊断WS 288—2017》，中华医学会结核病学分会的《中国耐多药和利福平耐药结核病治疗专家共识(2019版)》和WHO的《Guidelines for the programmaticmanagement of drug-resistant tuberculosis》相关内容，根据入组患者的随访信息，以临床症状、影像学检查和细菌学检测为依据，将各组患者划分为预后良好组和预后不佳组。

肺结核预后良好组：

中点指标：对于菌阳患者，现有方案治疗≤3个月时痰培养转阴，之后所有的培养均阴性，同时影像学检测显示病灶吸收良好，患者症状明显减轻或消失；对于菌阴患者，影像学检测显示病灶吸收良好，患者症状明显减轻或消失。

终点指标：患者治愈或临床治愈。前者为患者完成疗程，临床症状消失、影像学检查未发现活动性病灶、细菌学检查连续3次或以上转为阴性，且间隔至少30天。后者为临床症状消失，影像学检查未发现活动性病灶，但缺乏实验室检查结果。

肺结核预后不良组：现有方案治疗＞3个月时痰涂片或培养依然阳性；细菌学检查转阴后又复阳；现有方案治疗3个月时影像学检查显示病灶增多，或是出现空洞；治疗期间，更换现有治疗方案；治疗期间发生与结核病相关的死亡。

(3)血清样本的收集

采集患者各时间点的静脉血3～4mL于真空促凝采血管中；将标本以1000g离心15分钟；用移液器吸取血清，分装至EP管，-80℃保存备用。

实施例2

本实施例采用液相芯片技术检测细胞因子的水平。

将存于-80℃冰箱的细胞上清或患者样本取出，解冻并平衡至室温。将融解的样本涡旋震荡，充分混匀。取上清75μL样品至EP管中，加入75μL多因子试剂盒中的稀释液进行2倍稀释，充分吹打混匀。将制备好的标准品和待测样本加入到多因子检测试剂盒(Magnetic

检测血清中30种细胞因子的水平，包括IL-1β,IL-2,IL-2Rα,IL-4,IL-6,IL-7,IL-10,IL-13,IL-12p40,IL-12p70,IL-15,IL-21,IL-27,IP-10,MCP-1,TGF-α,TNF-α,IFN-γ,CD40Ligand,MIP-1α,Eotaxin,EGF,G-CSF,ICAM-1,IL-1Rα,IL-1ra,IL-6Rα,IL-17,VEGF,ENA-78。

数据处理及统计分析如下：

检测患者血清中的上述30种细胞因子水平，计算预后良好组以及预后不佳组的细胞因子变化水平(治疗一个月后-治疗前浓度)，采用SPSS20.0软件，选择Mann Whitney检验分析数据。P<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P<0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异。选择具有显著差异或极显著差异的细胞因子，绘制散点图。再行二分类Logistic回归，计算各组数据针对治疗效果的预测概率，绘制ROC曲线。

1)肺结核患者中血清细胞因子与疗效的初步评价结果

a、肺结核患者血清中IL-2Rα表达量

结果参照图1所示，预后良好组的IL-2Rα水平在治疗前和治疗早期(4周)无明显变化，而预后不佳组的IL-2Rα水平治疗早期比治疗前明显下降(P＝0.042)。可见，结核患者在治疗前和抗结核治疗早期，IL-2Rα的变化水平在不同预后组间存在差异。

b、肺结核患者血清中IL-1Rα表达量

在肺结核患者中，预后良好组的IL-1Rα在治疗前和治疗早期(4周)，预后不佳组的IL-1Rα水平治疗早期比治疗前明显下降(P<0.001)。在抗结核治疗后第4周，预后不佳组的血清IL-1Rα表达水平显著高于预后良好组(图2)。

c、肺结核患者血清中eotaxin表达量

预后良好组的eotaxin水平在治疗前和治疗早期(4周)无明显变化，而预后不佳组的eotaxin水平在治疗早期比治疗前明显下降(P＝0.028)。因此，肺结核患者在治疗前和抗结核治疗早期，eotaxin的变化水平在不同预后组间有差异(图3)。

通过ROC曲线分析，IL-2Rα水平降低的曲线下面积为0.649，特异性为82.9％，灵敏性为56.3％(见图4)；IL-1Ra水平降低的曲线下面积为0.86，特异性为92.0％，灵敏性为72.7％(见图5)；eotaxin水平降低曲线下面积为0.728，特异性为78.3％，灵敏性为66.7％(见图6)，将三种细胞联合后通过ROC曲线分析，曲线下面积为0.837，特异性为77.0％，灵敏性为83.3％(见图7)。

本发明中，IL-2Rα、IL-1Rα和eotaxin变化水平在肺结核预后良好和预后不佳组呈显著差异，在预后不佳组这三种因子的水平均呈现下降的趋势，说明这三种因子的变化水平可以作为肺结核早期疗效评价的特异性标志物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。